《Advanced Science》：A Circuit of Mechanically Regulated Transcription Factors Balances Regenerative and Fibrotic Memory of Mesenchymal Stromal Cells
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本期推荐一篇探讨“机械记忆”调控间充质基质细胞命运的开创性研究。针对细胞治疗中MSCs在体外扩增时因接触硬质培养表面而被激活为促纤维化肌成纤维细胞（MF）的难题，研究人员揭示了“软记忆”的分子机制，鉴定出HOXA11-SALL1-GATA6转录调控环路，并通过操控此环路成功增强了移植MSC在皮肤肥厚性瘢痕动物模型中的抗纤维化治疗效果。该研究为优化MSC扩增条件、提升细胞治疗疗效提供了新靶点和新策略。
在再生医学领域，间充质基质细胞（MSCs）因其强大的自我更新、多向分化和免疫调节能力，被视为治疗严重组织损伤（如烧伤）的明星细胞。然而，一个长期困扰科学家的难题是：为了获得临床治疗所需的数十亿细胞，MSCs不得不在体外进行大规模扩增。通常使用的硬质培养皿（如聚苯乙烯）会激活MSCs，使其分化为促纤维化的肌成纤维细胞（MF）。这些“变质”的MSCs在移植到受损组织后，不仅再生能力下降，还可能加剧纤维化瘢痕的形成。更令人担忧的是，即便将这些“被激活”的MSCs放回到类似健康组织的柔软环境中，它们似乎“记住了”之前的硬质刺激，MF特征依然存在。这种现象被研究者们称为“机械记忆”。此前，科学家对MSCs如何“记住”硬质环境（“硬记忆”）并持续激活已有一定了解，但对其如何“记住”柔软环境（“软记忆”）以抵抗纤维化的机制却知之甚少。这篇发表在《Advanced Science》上的研究，正是为了揭开“软记忆”的神秘面纱，并探索如何操控这种记忆，以生产出更具治疗潜力的MSCs。
本研究主要采用了多种前沿的组学技术和分子生物学手段。首先，研究人员使用了与健康皮肤和纤维化瘢痕组织硬度相匹配的硅胶培养基底（2 kPa 和 100 kPa）来模拟不同的机械微环境。核心的分析技术包括：用于在全基因组范围内分析染色质开放区域的ATAC-seq（转座酶可及染色质测序），以及与ATAC-seq同步进行的、用于分析基因转录水平的RNA-seq（RNA测序）。这两种技术的联用，使得研究人员能够将机械刺激导致的表观遗传变化与基因表达变化直接关联起来。此外，研究还运用了多种功能验证技术，如通过小干扰RNA（siRNA）进行基因敲低（KD）、基因过表达、免疫荧光染色、定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）以及细胞收缩力测定等。在动物模型层面，研究采用了已建立的大鼠皮肤肥厚性瘢痕模型，通过移植经过不同处理的MSCs，在体内评估其对伤口愈合和纤维化的影响。
2 结果
2.1 MSC培养基底硬度控制染色质可及性和促纤维化与抗纤维化基因表达
研究人员将MSCs直接在硬度分别为2 kPa（模拟柔软皮肤）和100 kPa（模拟僵硬瘢痕）的基底上培养长达5周。他们发现，随着在硬质基底上培养时间的延长，表达MF标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的MSCs比例显著增加，而在软基底上该比例保持低位。通过ATAC-seq分析，他们观察到，与软培养相比，硬培养的MSCs中差异可及性位点（DAL）的总数和信号强度随培养时间增加而升高，并且这些DAL越来越多地富集在基因启动子区域。RNA-seq分析进一步显示，硬培养导致促纤维化（如Grem1, Thbs2, Spp1）和成骨相关基因表达上调，而软培养则上调了与再生和抗纤维化功能相关的基因（如Hoxa11, Sall1, Spry1）。这些结果表明，长期的机械刺激能诱导全局性的染色质重塑，硬质环境逐渐增强与纤维化和成骨相关的基因可及性和转录，而柔软环境则增强与再生和抗纤维化相关的转录程序。
2.2 机械诱导的可及区域、转录和富集基序被记忆
为研究“机械记忆”，研究者在3周“启动”培养后，将MSCs从软基底切换到硬基底，或从硬基底切换到软基底，再培养2周。结果显示，在硬基底上启动3周的MSCs，即使切换到软基底，其α-SMA表达和MF特征依然保持（“硬记忆”）；反之，在软基底上启动3周的MSCs，切换到硬基底后仍能抵抗MF激活（“软记忆”）。通过比较始终在一种硬度下培养的细胞与切换硬度后的细胞的ATAC-seq和RNA-seq数据，研究人员鉴定出了一批“被记忆”的差异可及性启动子区域及其对应的差异表达基因。其中，14个基因在软启动后被上调且其启动子区域保持开放（软记忆基因），包括Hoxa11, Sall1, Ptgr1等；86个基因在硬启动后被上调且其启动子区域保持开放（硬记忆基因），包括Grem2, Postn, Col8a1等。这表明，为期3周的机械启动足以建立一种表观遗传“记忆”，使得细胞的转录组特征在机械环境改变后得以维持。
2.3 HOXA11是软环境中驱动抗纤维化基因表达的机械敏感转录因子
对软记忆基因的可及区域进行转录因子结合基序富集分析，发现HOX家族转录因子（特别是HOXA11和HOXD11）的结合基序高度富集。研究人员聚焦于HOXA11，因为其基因本身的启动子可及性和表达水平在软培养MSCs中更高，且这种状态在切换到硬环境后被“记忆”。功能实验表明，在软启动的MSCs中敲低HOXA11，会导致α-SMA表达升高、细胞收缩力增强、成骨潜能增加而脂肪形成潜能降低。同时，多个具有预测HOXA11结合基序的抗纤维化基因（如Smad7, Ptgr1, Sall1）的表达也随之下调。更重要的是，在软启动期间短暂敲低HOXA11，不仅能在后续软培养中维持MF激活水平，还会在切换到硬环境后加剧MF激活，表明HOXA11的缺失削弱了“软记忆”。因此，HOXA11被鉴定为一个新的、能持续抑制MF激活、促进抗纤维化基因表达的转录因子。
2.4 HOXA11对MSC向MF激活的抑制是通过SALL1介导并被记忆的
在HOXA11的下游靶基因中，研究者重点关注了Sall1。Sall1是软培养MSCs中上调最显著且被记忆的基因之一，其启动子区域含有预测的HOXA11结合基序且高度可及。实验证实，SALL1的蛋白和mRNA水平在软培养MSCs中极高，而在硬培养MSCs中几乎检测不到。在软启动MSCs中敲低SALL1，能直接诱导α-SMA表达升高；反之，在硬启动MSCs中过表达SALL1，则可减少α-SMA应力纤维的形成。机制上，SALL1敲低并未显著影响前述抗纤维化基因，却大幅上调了多个促纤维化基因（如Col8a1, Postn, Grem2, Thbs1, Thbs2）的表达。同样，在软启动期间敲低SALL1，能使其促纤维化效应在后续培养中被“记忆”，并在切换到硬环境后进一步增强。这些结果确立了SALL1作为一个由HOXA11调控的、新的机械敏感转录因子，通过抑制促纤维化基因表达来持续阻止MF激活。
2.5 GATA6是硬启动MSCs中机械MF记忆的保持者
在硬记忆基因的启动子区域，GATA家族转录因子（GATA3, GATA4, GATA6）的结合基序显著富集且被记忆。其中，只有GATA6的蛋白和RNA水平在硬培养MSCs中高表达，且在切换到软环境后仍保持高水平。研究证实，SALL1能抑制Gata6的表达。当在软启动MSCs中敲低SALL1时，GATA6水平上升，同时促纤维化基因表达增加、MF激活增强；而如果同时敲低SALL1和GATA6，则可以逆转这些促纤维化表型。有趣的是，单独敲低硬启动MSCs中的GATA6，并不会立即影响其MF特征。然而，如果在将细胞从硬环境切换到软环境的同时敲低GATA6，则能显著消除“硬记忆”，表现为切换到软环境后MF特征和促纤维化基因表达大幅降低。相反，在软启动MSCs中过表达GATA6，则能使其在切换到硬环境时对MF激活重新敏感。进一步的机制探索表明，GATA6可能作为一种先锋转录因子发挥作用：在硬启动MSCs切换到软环境后，GATA6的缺失会导致染色质凝集度增加、组蛋白H3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）水平下降，而H3K27ac是活跃染色质的标志。这表明GATA6有助于在机械刺激移除后，仍保持促纤维化基因染色质的开放状态，从而维持“硬记忆”。
2.6 GATA6和SALL1的操控改变MSC支持的皮肤伤口愈合
为了验证上述分子机制的临床应用潜力，研究者在已建立的皮肤肥厚性瘢痕大鼠模型中进行了测试。他们将经过不同处理的MSCs移植到伤口处。结果显示，移植SALL1被敲低的软启动MSCs（模拟“软记忆”擦除），与移植对照硬启动MSCs类似，会导致伤口收缩更明显、胶原沉积更多、α-SMA阳性的MF数量更多。相反，移植GATA6被敲低的硬启动MSCs（模拟“硬记忆”擦除），则能获得与移植软启动MSCs相似的良好效果，即减少纤维化特征。这证明，通过在MSCs体外扩增期间操控SALL1和GATA6，可以有效地调控其治疗性能，改善伤口愈合结局。
3 讨论与结论
本研究系统地阐释了间充质基质细胞“机械记忆”的新型调控环路。研究人员发现，长期的机械培养会重塑MSCs的染色质可及性景观和转录组。在软环境中，HOXA11作为关键的机械敏感转录因子被诱导表达，进而上调SALL1。SALL1通过抑制GATA6的表达，来阻止促纤维化和成骨基因的转录，从而维持MSCs的再生特性。即使细胞后来转移到硬环境，这一抗纤维化程序仍被“记忆”。反之，在硬环境中，SALL1表达被抑制，解除了对GATA6的抑制。高表达的GATA6不仅直接驱动促纤维化基因表达，还可能作为先锋转录因子，通过维持促纤维化基因启动子区域的染色质开放状态（如通过H3K27ac修饰），来“锁定”硬质环境诱导的MF表型。当细胞转移到软环境后，这种开放的染色质状态得以维持，从而形成了“硬记忆”。
该研究的重要意义在于：第一，首次揭示了HOXA11-SALL1-GATA6这一转录因子环路是平衡MSC再生与纤维化“记忆”的核心调控枢纽，深化了对细胞机械感知和命运记忆表观遗传机制的理解。第二，研究提出了“先锋转录因子”（如GATA6和HOXA11）在维持机械记忆中的关键作用，为理解机械信号如何被转化为持久的表观遗传印记提供了新视角。第三，也是最具有转化潜力的，是通过操控这一环路（如敲低GATA6或过表达SALL1），能够在体外“重编程”MSCs的机械记忆，从而制备出抗纤维化能力更强的治疗性细胞。这为优化基于MSC的细胞治疗产品制备工艺、提高其治疗组织纤维化疾病（如皮肤瘢痕、器官纤维化）的疗效，提供了切实可行的分子靶标和策略。最终，这项研究启示我们，通过理性设计细胞扩增的物理微环境或干预特定的基因回路，有望生产出下一代“智能型”治疗细胞，以抵抗病灶区不利的纤维化压力，实现更高效、安全的组织修复与再生。
