《Advanced Science》：QBP1 Peptide as a Potential Anti-Amyloidogenic Therapy for Type 2 Diabetes: An In Vitro Study
编辑推荐：
【编辑推荐】胰岛淀粉样多肽（hIAPP）聚集是导致2型糖尿病（T2D）胰岛β细胞功能障碍的关键因素。本研究聚焦于抗淀粉样蛋白形成肽QBP1，通过体外、细胞及计算机模拟实验，系统评估了其抑制hIAPP β-折叠结构形成、减少毒性寡聚体、保护INS-1E β细胞活力及维持代谢稳态的能力，并揭示了其通过范德华力和π-H相互作用的分子机制，为开发靶向淀粉样蛋白形成的T2D新疗法提供了有力候选。
在2型糖尿病（Type 2 Diabetes, T2D）复杂的发病图谱中，胰岛β细胞的进行性功能丧失和死亡是一个核心环节。而这一切，与一种名为“人胰岛淀粉样多肽”（human islet amyloid polypeptide, hIAPP，也称胰淀素）的小分子密切相关。hIAPP本是由β细胞与胰岛素共同分泌、参与餐后血糖调节的“好公民”。然而，在病理条件下，它却容易“变节”，错误折叠并自我组装成富含β-折叠（β-sheet）结构的寡聚体（oligomers）和原纤维（fibrils），最终沉积形成胰岛淀粉样斑块。这些聚集物，特别是可溶性的毒性寡聚体，被公认为是损伤β细胞膜、引发细胞器应激、导致细胞功能障碍乃至死亡的“元凶”之一。因此，靶向hIAPP的淀粉样蛋白形成（amyloidogenesis）过程，阻止其从无害单体向有毒聚集体的转化，成为预防或延缓T2D进展的一个极具吸引力的治疗策略。
尽管已有像普兰林肽（pramlintide）这样的hIAPP类似物获批用于临床，但其在溶解度、口服生物利用度和生产成本方面的局限，促使科学家们不断寻找更优的肽类抑制剂。其中，短肽抑制剂因其高特异性、低毒性等优势备受关注。本研究将目光投向了一个“多面手”——聚谷氨酰胺结合肽1（Polyglutamine-binding peptide 1, QBP1）。QBP1最初是作为抑制多聚谷氨酰胺（polyQ）疾病（如亨廷顿病）中蛋白质早期聚集的“明星分子”被发现的。有趣的是，后续研究发现它还能抑制α-突触核蛋白（α-synuclein）、TDP-43等其他病理淀粉样蛋白的聚集，显示出广谱的抗淀粉样蛋白形成潜力。那么，这个在神经退行性疾病领域大展身手的“肽斗士”，能否跨界到代谢疾病领域，有效对抗hIAPP的聚集，从而保护珍贵的β细胞呢？发表在《Advanced Science》上的这项研究给出了肯定的答案。
为了系统回答这个问题，研究团队运用了多层次的实验技术。在生物化学和生物物理层面，他们通过硫黄素T（Thioflavin-T, ThT）荧光动力学实验、A11/OC斑点印迹（dot blot）和负染透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）评估了hIAPP的聚集动力学及QBP1的抑制效果；利用圆二色光谱（circular dichroism, CD）和核磁共振波谱（nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR）分析了hIAPP的构象变化。在细胞生物学层面，他们将QBP1与细胞穿透肽penetratin（Antp）融合，构建了Antp-QBP1融合肽，以增强其跨膜能力；随后在大鼠胰岛素瘤细胞系INS-1E及其稳定表达hIAPP的衍生细胞（INS-1E-hIAPP）中，通过细胞活力测定（CellTiter-Glo, AlamarBlue）、免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）和基因表达分析（reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR），探究了Antp-QBP1对细胞存活、细胞内hIAPP积累以及应激/代谢相关基因表达的影响。在计算生物学层面，他们采用了分子对接（molecular docking）和分子动力学模拟（molecular dynamics simulations, MD）来揭示QBP1与hIAPP相互作用的原子级细节和结合模式。
3.1 QBP1优于其乱序变体，能有效抑制hIAPP聚集、延迟成核并减少原纤维形成
研究人员首先在无细胞体系中验证了QBP1的效果。ThT荧光实验显示，hIAPP的聚集呈现典型的S形曲线，而QBP1能以浓度依赖的方式强力抑制这一过程，在1:5（hIAPP:QBP1）摩尔比下几乎完全阻止了ThT荧光信号的上升，表明原纤维形成被显著遏制。相比之下，QBP1的乱序（scrambled, SC）变体SC-M8和SC-M11虽然也有部分抑制效果，但远不及QBP1本身。TEM结果直观地证实了这一点：hIAPP单独孵育会形成致密的原纤维网络，而与QBP1共孵育后，只能观察到稀疏的短纤维和无定形聚集体。
3.2 QBP1减弱hIAPP寡聚体形成并限制其原纤维组装
为了区分QBP1对聚集不同阶段的影响，研究使用了能特异性识别不同聚集形态的抗体进行斑点印迹分析。A11抗体靶向前原纤维寡聚体，OC抗体则识别原纤维寡聚体和成熟原纤维。结果表明，hIAPP单独孵育时，早期出现A11阳性信号，后期转为OC阳性信号。而QBP1的加入，几乎完全阻断了A11和OC抗体的检测信号，说明它既能减少早期毒性寡聚体的形成，也能抑制后期原纤维的组装。
3.3 QBP1阻止hIAPP从无规则卷曲向β-折叠的构象转变
聚集的本质是构象变化。CD光谱分析显示，hIAPP在孵育过程中，其光谱最小值从约202 nm（对应无规则卷曲构象）逐渐移至220 nm附近（对应β-折叠结构）。然而，当存在QBP1时，hIAPP的CD光谱特征在数小时内保持稳定，没有发生向β-折叠的特征性转变。NMR实验进一步佐证，QBP1能有效延缓甚至阻止hIAPP单体的信号衰减（信号衰减意味着形成了大分子量的聚集体而无法被检测），其抑制效果与已知的hIAPP聚集抑制剂表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate, EGCG）相当甚至更优。
3.4 Antp-QBP1保留QBP1的抑制活性并能被INS-1E β细胞高效内化
为了将QBP1送入细胞内部发挥作用，研究人员将其与源自果蝇Antennapedia同源域的细胞穿透肽penetratin（Antp）融合，形成Antp-QBP1。ThT实验证实，这种融合并未损害QBP1本身的抗聚集活性。随后的免疫细胞化学实验显示，用生物素标记的Antp-QBP1处理INS-1E细胞48小时后，可以在细胞内检测到强烈的抗生物素信号，表明该融合肽能被β细胞有效摄取。无论是否存在外源性hIAPP，Antp-QBP1均表现出良好的细胞内化能力。
3.5 Antp-QBP1降低INS-1E β细胞内hIAPP的积累和淀粉样蛋白原纤维的免疫反应性
在证实Antp-QBP1能够进入细胞后，研究人员评估了其对细胞内hIAPP命运的影响。ICC定量分析显示，与外源性hIAPP寡聚体共孵育会显著增加细胞内的hIAPP免疫信号以及OC阳性（原纤维）斑点数量。而与Antp-QBP1共处理，则能显著降低细胞内的hIAPP积累，并减少OC阳性斑点的数量。这表明Antp-QBP1在细胞内也能干扰hIAPP的聚集过程，减少毒性原纤维物种的形成。
3.6 Antp-QBP1保护INS-1E β细胞免受hIAPP诱导的细胞毒性及相关转录应激反应
功能实验表明，外源性hIAPP寡聚体以剂量依赖的方式降低INS-1E细胞的ATP水平和代谢活性，并引起细胞形态恶化。而Antp-QBP1的共处理能显著逆转这些毒性效应，恢复细胞的ATP含量和代谢活力，保护细胞形态。在稳定过表达hIAPP的INS-1E-hIAPP细胞中，Antp-QBP1同样能剂量依赖性地恢复因hIAPP过表达而降低的细胞活力。
基因表达分析揭示了更深层的保护机制。hIAPP处理会上调内质网应激标志物Hspa5（编码GRP78/BiP）以及炎症因子IL-1β和Ccl2的表达，同时下调关键葡萄糖转运蛋白Slc2a2（GLUT2）的表达。这些变化分别对应了hIAPP毒性引发的内质网应激、炎症反应和代谢功能障碍。令人振奋的是，Antp-QBP1的共处理能够显著逆转这些基因的异常表达，将它们的表达水平拉回甚至优于正常对照，从而在转录水平上缓解了hIAPP引发的细胞应激。
3.7 芳香相互作用驱动QBP1与hIAPP淀粉样蛋白核心的结合
最后，通过分子对接和MD模拟，研究人员从原子层面揭示了QBP1的作用机理。模拟结果表明，QBP1能够稳定地结合在hIAPP中央疏水区域（第20-29位残基）形成的沟槽或疏水斑块上，这个区域正是hIAPP形成淀粉样蛋白的核心“热点”。两者的结合主要由范德华力和π-H相互作用介导，QBP1序列中的色氨酸（W， Tryptophan）和苯丙氨酸（F， Phenylalanine）等芳香族残基在其中扮演了关键角色。这种结合可能通过空间位阻和破坏氢键网络，干扰了hIAPP分子间β-折叠结构的形成和延伸，从而从源头上遏制了聚集。相比之下，QBP1与无聚集倾向的大鼠IAPP（rIAPP）的结合则弱得多，解释了其作用的选择性。QBP1的乱序变体由于丧失了特定的空间构象和关键相互作用，其结合稳定性和抑制效果也大打折扣。
综上所述，这项综合性研究首次证实，源自神经退行性疾病研究领域的抗淀粉样蛋白形成肽QBP1，能有效跨界应用于代谢疾病领域。它在体外、细胞内及计算机模拟中均展现出对hIAPP淀粉样蛋白形成的强大抑制能力。其作用机制是多层次的：在分子水平，它通过芳香驱动的作用力直接结合hIAPP的淀粉样蛋白形成核心，阻止其向β-折叠结构的构象转换和寡聚化；在细胞水平，经细胞穿透肽修饰的Antp-QBP1能被β细胞高效摄取，减少细胞内毒性hIAPP聚集体的积累，保护细胞活力，并逆转由hIAPP应激引发的内质网应激、炎症和代谢相关基因的异常表达。
这项研究的意义在于，它不仅为治疗T2D提供了一个以“抑制胰岛淀粉样蛋白形成、保护β细胞”为轴心的全新治疗策略和先导化合物（QBP1），还通过多学科技术融合，清晰地阐明了其从分子到细胞水平的作用机理。QBP1作为一种短肽，具备高特异性、易于修饰（如与细胞穿透肽融合）等优点，具有较好的成药潜力。当然，要将这一“体外明星”转化为临床可用药物，还有很长的路要走，包括其在动物模型中的in vivo（体内）有效性、安全性、药代动力学特性等都需要进一步评估。但毫无疑问，这项研究为对抗T2D中β细胞的进行性丧失，点亮了一盏新的指路明灯。
