推进法医单核苷酸多态性（SNP）分型技术：来自FORCE小组实验室间研究的见解

《Forensic Science International: Genetics》：Advancing forensic SNP typing: Insights from an interlaboratory study of the FORCE panel

本研究评估了FORCE基因分型面板在扩增子基和捕获基富集技术中的性能，15个实验室使用不同方法（包括myBaits、QIAseq等）分析12份样本（含稀释和抑制样本）。结果显示所有方法均可生成完整FORCE数据，但SNP调用率存在显著差异，捕获方法在降解样本中表现更优，未来需优化实验室参数以提高一致性。

　　

安德烈亚斯·蒂尔马尔（Andreas Tillmar）|金伯利·斯特克-安德烈亚吉（Kimberly Sturk-Andreaggi）|亚当·斯塔迪格（Adam Staadig）|克里斯蒂娜·阿莫里（Christina Amory）|大卫·巴拉德（David Ballard）|埃里克·F·伯格塞特（Erik F. Bergseth）|克劳斯·伯斯廷（Claus B?rsting）|塞莱娜·奇萨纳（Selena Cisana）|迈克尔·科布尔（Michael Coble）|卢辛达·达文波特（Lucinda Davenport）|玛丽亚·德拉普恩特（María de la Puente）|凯瑟琳·B·盖廷斯（Katherine B. Gettings）|艾琳·M·戈登（Erin M. Gorden）|凯莉·格里塞代尔（Kelly Grisedale）|詹妮弗·丹尼尔斯-希金博瑟姆（Jennifer Daniels-Higginbotham）|雷切尔·休斯顿（Rachel Houston）|谢丽·休斯（Sheree Hughes）|里特·雅尔文（Reet J?rving）|凯文·M·基斯勒（Kevin M. Kiesler）|乔纳森·L·金（Jonathan L. King）|查拉·马歇尔（Charla Marshall）

瑞典国家法医学委员会法医遗传学与法医毒理学部门

摘要

本研究评估了使用基于扩增子和基于捕获技术的富集方法生成FORensic Capture Enrichment（FORCE）基因型的能力。FORCE面板是一组为法医应用开发的标准化单核苷酸多态性（SNP）标记。准备了12个DNA样本并分发到各个实验室进行测试：5个对照DNA样本，浓度范围从10 ng到0.03 ng；2个降解DNA样本，平均片段长度分别为200 bp和150 bp；以及1个添加了腐殖酸的抑制样本。来自三个不同大洲的15个实验室参与了这项研究，它们选择了四种制造商提供的富集方法之一来完成实验，并根据自己的偏好和专业知识设置了测序及其他用户定义的步骤参数。共评估了18种方法，其中3个实验室使用了两种方法。结果显示，所有四种方法都能从高质量样本中成功生成完整的FORCE SNP基因型。然而，在不同方法之间以及同一方法内部观察到了显著差异。读取计数的变异性和富集类型导致了调用率的显著差异。在0.3 ng的DNA输入量下，所有方法都表现出稳健的SNP回收率，其中基于扩增子的方法在0.03 ng的DNA输入量下产生了较高的SNP调用率。基于捕获和单引物延伸的方法从150-200 bp片段的降解样本中始终获得了较高的SNP调用率。未来通过优化实验室参数可以减少SNP数据中的变异，从而使各实验室能够公平地采用这些强大的法医标记。

引言

单核苷酸多态性（SNP）在法医身份鉴定、亲缘关系分析和失踪人员搜寻中具有多种优势[1]。目前，SNP基因分型主要采用高通量测序技术和微阵列（SNP芯片）技术[2]。SNP可以通过PCR、引物延伸捕获和杂交捕获方法进行检测，同时也可以结合全基因组测序（WGS），这些方法适用于DNA模板有限或已降解的法医样本[3]。与长度为100-500个碱基对（bp）且突变率较高的短串联重复序列（STR）标记不同，SNP是单个碱基的标记，具有较低的突变率[4]。因此，需要更多的SNP才能实现足够的区分能力，以用于人类身份鉴定和亲缘关系分析[5]。人类基因组计划和其他类似项目已经在全球人类群体中鉴定出了数百万个SNP[6],[7]。基于这些参考SNP，法医领域的科学家们开发了多种基于PCR的SNP面板用于人类身份鉴定[8]。早期的SNP面板包括SNPforID[8]和Kidd面板[9]。随着大规模并行测序（MPS）技术的发展，出现了更大的法医SNP面板，例如Qiagen公司的140-SNP面板（德国希尔登）、Precision ID Identity Panel（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆Thermo Fisher Scientific公司）、ForenSeq DNA Signature Prep Kit（QiAGEN公司）、MPSplex（QiAGEN公司）和ForenSeq Kintelligence Kit（QiAGEN公司）[10],[11],[12],[13]。这些法医SNP面板的测序使用Illumina和Ion Torrent等平台上的合成测序化学方法进行，尽管其他测序化学方法和平台也能够分析这类SNP面板。这些测序方法在化学原理上有所不同，因此需要不同的文库制备方法。此外，生物信息学数据分析也必须根据具体方法进行调整（例如[15]），这导致SNP面板制造商开发了自己的数据分析软件。这使得适用于法医用途的SNP基因分型工作流程多样化。

为了适应全球法医实验室使用的多种MPS技术，FORensic Capture Enrichment（FORCE）面板被设计为一种可以通过多种MPS方法靶向检测的SNP集合[16]。FORCE面板包含约5500个SNP，用于身份鉴定、亲缘关系分析、祖先研究、表型分析以及Y染色体单倍群预测，这些SNP在选定时没有已知的临床相关性。最初的FORCE面板SNP选择基于myBaits杂交捕获技术（美国密歇根州安娜堡Arbor Biosciences公司），旨在平衡用于人类身份鉴定的SNP数量与每个探针的成本。自FORCE面板首次发表以来，多项研究表明该面板能够适应不同的富集和测序方法，包括用于Ion Torrent测序的杂交捕获[17]和QIAseq（QiAGEN公司）技术，以及用于Illumina测序的单引物延伸技术[18],[19]。

在本报告中，通过一项全球实验室间研究测试了使用实验室选定的MPS方法检测FORCE面板的实际能力。除了最初的myBaits杂交捕获与Illumina测序组合外，还评估了以下MPS方法：myBaits杂交捕获与Ion Torrent测序[17]、QIAseq与Illumina测序[19]、AmpliSeq（Thermo Fisher Scientific公司）与Ion Torrent测序，以及xGen（美国新泽西州纽瓦克Integrated DNA Technologies公司）与Illumina测序的组合。2022年成立了一个FORCE面板联盟，由来自三个不同大洲的15个实验室组成。该项目未获得外部资助，各实验室自行负责购买试剂、设备并安排人员时间来从一组受控DNA样本中生成SNP数据。实验室被告知有多种FORCE目标富集选项，并可以选择最适合其实验室环境的方案。这使实验室能够利用现有的设备、内部专业知识和偏好的MPS方法来生成SNP数据。准备了一组12个已知样本，并将其分装后发送到各个测试站点，使用他们选择的FORCE方法进行SNP分析。所有MPS数据文件由一个实验室收集和分析，评估了每种方法的SNP回收率和一致性，并记录了观察到的实验室间差异。本研究首次全面评估了FORCE面板的跨平台适用性，证明了其在不同文库制备方法和测序平台上的适应性，并为法医实验室选择和实施SNP分型方法提供了参考标准。

样本

该项目使用了来自Promega（2800 M）、Coriell（NA12877和NA12878）和NIST（RM 8391（NIST Genome in a Bottle (GIAB) 样本HG-002）、SRM 2391d Component A和SRM 2391d Component B）的6个市售DNA样本。为了评估每种方法的灵敏度，制备了一个从2800 M到0.03 ng的稀释系列。为了评估抑制效应，还向2800 M的DNA样本中添加了腐殖酸。土壤溶液是通过混合制备的

总体质量控制指标

总体而言，四种方法均能从一个或多个样本中成功生成FORCE基因型，但在不同方法之间以及同一方法内的SNP调用率存在显著差异。3.2节“对照DNA样本”、3.3节“稀释系列”和3.4节“降解和抑制样本”的分析主要关注基因型调用率和基因型一致性。然而，图1显示了一些总体质量控制（QC）指标的明显变化

总结与结论

本研究评估了使用四种不同方法（AmpliSeq、myBaits、QIAseq和xGen）生成FORCE基因型的能力，各实验室根据自身偏好选择了不同的工作流程条件。结果显示，所有四种方法都能从高质量样本中生成FORCE数据；然而，SNP调用率存在不一致性，并且取决于所使用的方法。特别是，样本的总读取计数是一个重要因素

伦理声明

NA12877和NA12878 DNA样本来自Coriell医学研究所，使用方式符合相关材料转移协议。该研究获得了瑞典伦理审查机构的批准（2024-07682-01）。

资助

本项工作未获得外部资助，得到了参与项目的所有机构的支持。

CRediT作者贡献声明

亚当·斯塔迪格（Adam Staadig）：撰写——审稿与编辑、方法学、研究。金伯利·斯特克-安德烈亚吉（Kimberly Sturk-Andreaggi）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、项目管理、方法学、研究、概念构思。安德烈亚斯·蒂尔马尔（Andreas Tillmar）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、监督、软件开发、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念构思。里特·雅尔文（Reet J?rving）：撰写——审稿与

利益冲突声明

作为主编，沃尔瑟·帕森（Walther Parson）未参与本文的同行评审过程，也未获取任何有关同行评审的信息。本文的编辑工作完全由另一位期刊编辑负责。除此之外，作者们没有需要声明的利益冲突。

致谢

作者感谢蒂莫西·麦克马洪博士（AFMES-AFDIL）和艾普丽尔·希金斯（SNA International）在行政方面的支持。

免责声明

对于AFMES的作者而言，本文中的观点仅代表作者个人观点，不一定代表美国国防部、国防卫生局或其下属机构（包括武装部队医疗检验系统AFMES）的官方立场。提及商业产品仅出于科学透明度考虑，不应被视为官方立场