靶向SHP2隧道变构口袋的偏向性共价片段映射：K492共价标记与变构共价抑制剂开发新起点

《ChemBioChem》：Mapping the SHP2 Allosteric Pocket With Target-Biased Covalent Fragments

为解决SHP2变构共价抑制剂缺乏及常规共价片段库难以命中功能位点的问题，研究者将变构抑制剂药效团与芳基磺酰氟(SF)弹头结合，成功共价标记隧道位点K492，提升抑制活性，为功能相关位点TCI开发提供互补策略。

　　

在抗癌药物研发的广阔战场上，蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2（由PTPN11基因编码）一直是一个令人又爱又恨的关键靶点。作为细胞内的一个关键信号“开关”，SHP2参与调控了受体酪氨酸激酶（RTK）信号转导以及肿瘤微环境，与多种癌症的发生发展密切相关。近年来，针对SHP2的变构抑制剂（Allosteric inhibitors）取得了突破性进展，尤其是那些靶向SHP2三个结构域（N-SH2、C-SH2和催化PTP结构域）界面处的“隧道状变构位点”（tunnel allosteric site）的小分子，它们能将酶稳定在无活性的自抑制构象，目前已有多款进入临床试验。

然而，当前的SHP2药物研发面临着一个棘手的难题：SHP2中常见的激活突变（主要发生在发育性疾病和血液恶性肿瘤中）会破坏SH2与PTP结构域界面的接触，导致自抑制构象不稳定，从而使得许多靶向该隧道位点的抑制剂效力大打折扣。此时，靶向共价抑制剂（Targeted covalent inhibitors, TCIs）因其较长的驻留时间（residence time），有望在应对这些突变体时维持抑制活性。但现实很骨感，目前尚无可成药的靶向SHP2隧道位点的共价抑制剂。传统的共价药物开发往往依赖于已知的强效非共价配体进行改造，或者使用常规的共价片段库进行筛选。问题在于，常规片段库中的亲电片段结构偏差低、结构简单，其与蛋白的结合弱且短暂，往往只能标记表面暴露的氨基酸，很难精准命中像隧道变构位点这样功能相关的特定口袋，且后续难以转化为具有药物样性质的分子。

为了打破这一僵局，发表在《ChemBioChem》上的这项研究开发了一种名为“靶点偏向性共价片段”（target-biased covalent fragments）的新策略。研究人员将成熟的SHP2变构抑制剂中的非共价识别元素（即药效团特征）与芳基磺酰氟（aryl sulfonyl fluoride, SF）亲电弹头相结合，专门用于绘制SHP2隧道变构口袋的可配体位点。研究发现，这种结合了结构偏向性的SF片段能够特异性地共价标记位于隧道位点内的赖氨酸K492，而常规的非偏向性SF片段库则无法靶向该位点。这种共价修饰不仅改善了酶的抑制效果，也为后续开发SHP2靶向共价抑制剂（TCIs）提供了全新的起点。这项工作清晰地证明了非共价相互作用如何引导共价片段的结合，并为在功能相关位点识别合适的弹头和亲核氨基酸提供了新思路。

为开展此项研究，作者主要采用了以下几个关键实验技术：1. 基于DiFMUP的荧光磷酸酶活力检测法，用于评估片段对全长SHP2（SHP2^FL）的抑制率及测定IC₅₀值；2. 完整蛋白质谱（Intact MS）及基于胰蛋白酶消化的串联质谱（MS/MS）肽指纹图谱分析，用于确证片段与SHP2的共价结合及精确鉴定共价修饰的氨基酸位点；3. 动力学失活实验，用于测定共价片段的第二级速率常数（k_inact/K_I）；4. 分子对接（Docking）及共价对接（Covalent docking）模拟，用于预测片段在隧道变构位点中的结合模式；5. X射线共结晶结构解析，用于观察片段在蛋白口袋中的实际结合状态。

2.1 非偏向性片段库 (Non-biased Fragment Library)

研究人员首先使用内部的芳基SF片段库（包含SF1-SF8）对SHP2^FL进行筛选。结果显示，简单的苯基硫酰氟（SF1）和羧基取代的SF2抑制率较弱（17%和6%），而增加分子大小的SF3、SF5抑制率有所提升（25%、32%），IC₅₀分别为41 μM和35 μM，但在苯环对位加甲氧基（SF6-SF8）则完全失去活性，这与对位甲氧基降低SF中硫中心的亲电性有关。质谱分析表明，SF3和SF5虽然能与SHP2共价结合，但表现出明显的泛杂性：它们主要标记了分散在N-SH2域（Y66, Y81）、C-SH2域（K198, K199）和PTP域（H426, Y511）的表面暴露酪氨酸、组氨酸和赖氨酸，唯一定位在隧道变构位点附近的只有Y511（且仅SF3标记）。这说明常规非偏向性SF片段的结合是反应性驱动的，而非特定的非共价相互作用主导，其抑制效果可能源于多点非特异性共价修饰改变了蛋白表面性质，无法用于TCI开发。

2.2 变构隧道位点偏向性片段 (Allosteric Tunnel Site-Biased Fragments)

随后，研究人员设计了带有SHP2隧道变构抑制剂特有药效团的SF片段（SF10, SF11, SF12a, SF12b）。这些片段均含有能与非共价抑制剂一样结合在隧道位点的构象受限伯胺结构。活性测定发现，SF10和SF11的IC₅₀分别为190 μM和160 μM，活性甚至低于某些非偏向性片段，且它们在缓冲液中更易水解；而结构更复杂的SF12a和SF12b则显示出更强的抑制力，IC₅₀分别为5.8 μM和13 μM。质谱标记位点分析揭示了巨大差异：SF10主要标记Y66, Y100, Y179；SF11标记Y66, Y179, K235, K358；而SF12a和SF12b则表现出显著的特殊特异性——除了各自标记一个表面酪氨酸（Y100和Y66）外，它们唯一标记的功能位点内氨基酸就是位于隧道变构位点疏水部分的K492。已知的非共价强效抑制剂SHP099能竞争掉SF12a的共价修饰，证实了其为同一隧道结合位点。动力学参数显示SF12b的k_inact/K_I为88 min^-1M^-1，高于SF12a的12 min^-1M^-1。进一步的对照组实验证明，去除SF12a/SF12b的共价弹头或替换为活性更低的氟硫酸盐（OSF12a/OSF12b），会导致抑制活性大幅降低或消失，这证实了共价结合K492以及增强的非共价相互作用共同贡献了其优异的抑制效果。

2.3 最强偏向性SFs的结合模式 (Binding Modes of the Most Potent Target-Biased SFs)

通过分子对接和共价对接模拟，研究人员发现这些偏向性片段的伯胺基团能与隧道位点内的T108、F113、T253等形成氢键（SF12b的苄胺还能与E249形成盐桥），其芳基SF部分指向K492。共价对接显示K492侧链发生构象变化朝向S(VI)中心以形成加合物，且SF12a在共价结合后仍能保持类似药物分子的良好结合姿态。研究人员还尝试了SF12a与SHP2^FL的共结晶，尽管质谱已证实共价标记，但由于结晶条件（pH 8.5，7天）下SF水解为磺酸根，最终晶体结构捕获到的是水解产物，但也确认了该分子骨架确实结合在目标隧道变构位点内。

3 结论 (Conclusion)

本研究通过对比非偏向性和靶点偏向性芳基SF片段在SHP2全长蛋白上的抑制与共价标记行为，明确了常规SF片段会因弱瞬时的相互作用而非特异性地标记表面氨基酸，无法有效绘制功能相关的隧道变构位点；而融合了变构抑制剂非共价识别元素的“靶点偏向性SF片段”，则能通过增强的非共价相互作用将弹头引导至隧道位点，并实现与K492的特异性共价结合，从而提升抑制活性。这是首次系统性绘制全长SHP2共价相互作用位点并聚焦于隧道变构位点的研究，K492的共价标记此前未被其他SF小分子变构抑制剂报道。

意义讨论

这项研究具有重要的理论与应用价值。首先，它成功实现了利用芳基SF弹头通过靶向K492对SHP2进行变构共价抑制的概念验证。其次，它提出了“靶点偏向性共价片段”这一互补策略，证明在缺乏先验氨基酸反应性知识的情况下，借助已知药效团可以增强非共价驻留时间，从而让原本难以发生的弱亲核性氨基酸（如赖氨酸）的共价结合得以实现。这种方法克服了传统共价片段库难以命中功能位点的瓶颈，为针对验证过的药理靶点（尤其是那些含非半胱氨酸可配体位点的靶点）开发靶向共价抑制剂（TCIs）提供了一条高效的新途径，未来有望助力克服SHP2激活突变带来的抑制剂效力下降问题。