《European Journal of Neurology》：Identification and Functional Characterization of Novel and Recurrent NTRK1 Variants in Chinese Families With Congenital Insensitivity to Pain With Anhidrosis: A Combined Clinical, Genetic, and Functional Study
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为解决先天性无痛无汗症（CIPA）致病NTRK1变异谱不全及功能机制不清的问题，研究人员对中国4个CIPA家系开展基因测序与体内外功能实验，鉴定出7个变异（含2个新型），明确各变异破坏NGF-TrkA通路（糖基化、磷酸化、结合及下游信号）的具体步骤，建立基因型-表型关联，为精准诊断与个性化治疗奠基。
想象一下，如果一个人失去了痛觉，生活会变成什么样？对于普通人来说，疼痛是身体的一种保护机制，提醒我们远离危险。然而，患有先天性无痛无汗症（Congenital insensitivity to pain with anhidrosis, CIPA，又称遗传性感觉和自主神经病IV型，HSAN-IV）的患者，自出生起就无法感知疼痛，并且全身无汗。这听起来似乎像某种“超能力”，但实际上这是一种极为痛苦的常染色体隐性遗传罕见病。由于缺乏痛觉防护，患者经常会无意识地自我伤害，导致反复的骨折、感染甚至自残；而无汗则导致他们无法通过排汗调节体温，引发反复高热，严重时可危及生命，常伴有智力发育迟缓等问题。
目前研究已知，CIPA的罪魁祸首是NTRK1基因（编码神经生长因子NGF的高亲和力受体TrkA）发生了致病变异。NGF与TrkA结合后，会激活下游一系列至关重要的信号级联反应（如RAS-MAPK、PI3K-AKT和PLCγ/PKC通路），这对痛觉神经元的存活、分化及汗腺的神经支配至关重要。一旦TrkA功能丧失，这些神经元便会凋亡，从而导致痛觉消失和无汗症。
尽管NTRK1基因变异是明确的致病原因，但目前的困境在于：已报道的许多变异缺乏系统的功能验证，这极大地阻碍了对疾病机制的深入理解以及精准的基因诊断。特别是在中国人群中，某些特定变异（如深层内含子变异c.851-33 T > A）虽被广泛报道，但不同变异组合如何精确影响TrkA蛋白功能、进而导致不同严重程度的临床表型（基因型-表型关联），仍是一个巨大的谜团。为了填补这一空白，来自中国苏州大学附属儿童医院吴江院区（苏州市吴江区儿童医院）等机构的研究人员，针对4个中国CIPA家系展开了临床、遗传与功能的综合性研究，该成果最终发表在《European Journal of Neurology》上。
研究人员通过深入的体内外实验，不仅鉴定出NTRK1基因的新变异、拓展了突变谱，还精细地描绘出不同变异破坏NGF-TrkA信号通路的具体“作案步骤”，并成功将分子缺陷与患者的临床严重程度联系起来，为未来的个性化治疗奠定了坚实的理论与实验基础。
主要关键技术方法
研究人员首先招募了4个中国CIPA家系共13名成员（含5名患者），采集外周血提取基因组DNA，分别运用全外显子测序（WES）和全基因组测序（WGS）进行致病位点筛查，并结合Sanger测序验证家系共分离。随后，利用多种生物信息学工具（如SIFT、PolyPhen-2、AlphaMissense等）预测变异致病性与蛋白稳定性，并借助AlphaFold3进行TrkA蛋白3D结构建模。在功能实验层面，研究通过在HeLa和HEK293T细胞（无内源性NTRK1表达）中转染野生型及突变型NTRK1质粒，综合运用了Western blot（检测蛋白表达、糖基化、磷酸化及下游AKT信号）、PNGase F酶解、Co-IP（检测NGF配体结合能力）以及RNA测序（RNA-seq）与qPCR等技术手段。
3 结果
3.1 四个先天性无痛无汗症家系的临床表型与遗传学分析
研究共纳入5名CIPA患者（年龄6个月至12岁），均表现出无痛觉和无汗的核心症状，但临床严重程度不一，有的伴有骨折、反复发热、智力迟滞或自残等行为。遗传学分析在NTRK1基因（转录本NM_001012331.2）中鉴定出7个变异：4个错义变异、2个深层内含子变异和1个插入缺失（indel）变异。其中包括2个首次报道的新型变异：c.2285C > A（p.P762H）和c.1990_1993delinsTGCT（p.G664_M665delinsCL）。此外，c.632 T > A、c.851-33 T > A等为已报道变异。这些变异有的位于细胞外IgC1结构域，有的位于细胞内酪氨酸激酶结构域（TKD）。
3.2 基于生物信息学的NTRK1变异潜在致病效应分析
除已知功能的深层内含子变异外，研究对其余5个变异（4个错义，1个indel）进行了预测。几乎所有工具均预测这些变异具有破坏性（deleterious），且在人群数据库（ExAC、gnomAD等）中频率极低或为零。蛋白稳定性预测显示，这些变异普遍降低了TrkA蛋白的稳定性（ΔΔG值变化）。3D结构建模（AlphaFold3）进一步揭示，变异引起了局部氢键网络的显著改变（如新增或丢失特定氢键），从结构上解释了其对蛋白构象的潜在影响。
3.3 变异对蛋白表达及翻译后修饰的影响
Western blot结果显示，大多数变异蛋白表达水平与野生型相似，但c.632 T > A（p.V211E，位于胞外域）导致140 kDa的成熟糖基化TrkA蛋白完全消失；c.1942C > T（p.R648C）则显著降低了总TrkA水平，尤其是110 kDa的部分糖基化前体。NGF刺激实验表明，除c.632 T > A能保留部分磷酸化能力外，所有位于TKD的变异均完全阻断了TrkA的磷酸化（p-TrkA Tyr490），证明TKD变异严重损害受体的自磷酸化能力。
3.4 NTRK1变异对配体结合及下游通路激活的影响
Co-IP实验显示，所有突变型TrkA与NGF前体（proNGF）的结合能力均较野生型显著降低，部分变异也改变了proNGF与成熟NGF（mNGF）的比例。在下游信号方面，NGF刺激下的AKT磷酸化（p-AKT Ser473）在c.1942C > T、c.1990_1993delinsTGCT和c.2122G > A中完全消失；在c.632 T > A和c.2285C > A中显著减弱；而既往报道的c.2285C > T甚至表现出比野生型更强的磷酸化信号，暗示其可能存在非典型的信号调控。
3.5 RNA测序（RNA-Seq）揭示与CIPA表型、炎症及免疫相关的差异表达基因（DEGs）
RNA-seq分析发现，突变组与野生型组转录谱明显分开，共鉴定出140个DEGs。下调基因中包含多个神经元功能与发育关键基因（如NGF、AKNA、KCNS3、ADAT3、ATG4D）以及炎症调控因子MIF和骨再生相关基因EMILIN2。qPCR验证了这些基因的下调。GO和KEGG富集分析不仅捕捉到“酪氨酸激酶信号通路”、“蛋白磷酸化”等直接受损条目，还显著富集到“破骨细胞分化”及炎症免疫相关通路，为患者出现骨折易感及炎症倾向提供了分子解释。
3.6 NTRK1变异在多步骤上破坏NGF-TrkA信号通路从而解释痛觉缺失
综合上述实验，研究者提出一个精细的机制模型：野生型TrkA功能依赖正确的糖基化、NGF结合、受体二聚化、自磷酸化及下游信号转导。c.632 T > A（胞外域）主要破坏TrkA的正确糖基化；而位于TKD的变异（c.1942C > T、c.2122G > A、c.2285C > A及indel）则主要损害自磷酸化能力。尽管各有侧重，但所有变异均削弱了与NGF的亲和力，并最终阻断或削弱下游信号，导致NGF-TrkA通路功能丧失，引发CIPA。
4 讨论
4.1 导致CIPA的NTRK1变异的分子异质性
本研究再次印证了NTRK1变异类型的多样性。除了已知的深层内含子剪接变异，新发现的c.2285C > A和c.1990_1993delinsTGCT进一步丰富了突变库。值得注意的是，在家族4中，c.1942C > T和c.1990_1993delinsTGCT以顺式（cis）形式存在于同一条等位基因上，构成“双重激酶死亡”状态，虽未加重个体表型（因单个变异已足以完全阻断功能），但揭示了等位基因上变异叠加的分子细节。
4.2 基因型-表型关联提示CIPA临床严重程度取决于结构域及机制
研究观察到明显的基因型-表型等级关联：携带TKD变异（如c.2122G > A或c.1942C > T组合）的患者表型更严重（伴智力迟滞、反复高热等），因为这些变异在多节点（结合、磷酸化、下游信号）破坏通路；而携带c.632 T > A（胞外域，保留部分磷酸化与下游信号）或c.2285C > A（保留部分AKT信号）的患者，症状相对较轻。这强调了单纯基因检测不足以判断预后，必须结合功能表征。
4.3 在细胞过表达模型中TrkA优先与proNGF相互作用
Co-IP中仅检测到proNGF与TrkA结合，而未捕获mNGF，这可能源于HEK293T细胞内proNGF过量及缺乏p75NTR（NGF另一种受体）共受体。但核心结论不变：所有突变体结合proNGF的能力均显著弱于野生型，证明其配体 engagement 受损。
4.4 局限性
研究样本量较小（5名患者），且使用了非神经元细胞系（HeLa和HEK293T）。部分患者的临床随访时间较短，长远表型（如关节畸形）可能尚未显现。未来需在神经元模型（如iPSC来源神经元）中验证。
5 结论
综上所述，本研究在中国CIPA家系中鉴定出7个NTRK1变异（含2个新型变异），通过系统功能表征，精准定位了各变异在NGF-TrkA通路中破坏的具体步骤（从糖基化缺陷到信号转导阻断），建立了清晰的基因型-表型关联层级，不仅拓展了致病突变谱，更为CIPA的分子诊断及未来个性化治疗策略的开发提供了关键基石。
