《Redox Biology》：Development of a high-throughput screening platform for identification of functional BACH1 inhibitors reveals compounds with anti-invasive potential
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本研究针对转录调控因子BACH1（BTB and CNC homology 1）在氧化应激、炎症及癌症侵袭等病理过程中的关键作用，构建了一种基于HMOX1-luciferase报告基因的高通量筛选体系。通过筛选2,046个小分子化合物，研究人员成功鉴定出四种结构各异的BACH1功能性抑制剂（auranofin、xanthohumol、alantolactone、CH55），这些化合物同时激活NRF2，具备双重调控活性。值得注意的是，研究揭示了传统2D迁移实验在评估BACH1抑制效果时可能出现假阴性，而3D侵袭实验能更准确地反映化合物的抗侵袭作用。该工作不仅为BACH1靶向药物研发提供了高效筛选平台，还为抗转移治疗及氧化应激/炎症相关疾病的干预提供了新的化学骨架。
在生命科学的复杂调控网络中，转录因子扮演着“指挥家”的角色，其中BACH1（BTB and CNC homology 1）因其广泛参与氧化应激响应、铁死亡、炎症及癌症转移等过程而备受关注。它如同一个“刹车片”，能够抑制包括HMOX1（血红素氧合酶1）在内的一系列细胞保护基因的表达。BACH1的功能紊乱与慢性炎症性疾病、纤维化乃至多种癌症的进展密切相关，这使其成为一个极具潜力的治疗靶点。然而，与它的“兄弟”NRF2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2）相比，BACH1的药物开发却相对滞后，已知的药理抑制剂寥寥无几，且缺乏高效、特异的筛选工具。这构成了当前研究领域的一个核心瓶颈：我们如何从海量化合物中，快速、准确地找到那些能精准“松开”BACH1这个“刹车”的分子？
为了破解这一难题，以Kevin X. Ali、Laureano de la Vega等为代表的研究团队在《Redox Biology》上发表了一项创新性研究。他们聪明地利用了BACH1抑制与HMOX1基因表达上调之间的强相关性，构建了一个稳定的报告细胞系。他们选取了人肺腺癌细胞系H1299，通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，将荧光素酶（luciferase）的编码序列精准敲入到内源性HMOX1基因的位点，从而创建了H1299 HMOX1-Luc细胞。在这个细胞中，一旦BACH1的抑制被解除，HMOX1启动子就会驱动荧光素酶大量表达，产生强烈的发光信号，这就如同给BACH1的活性安装了一个高灵敏度的“指示灯”。研究团队首先验证了这个“指示灯”的可靠性：无论是通过CRISPR技术敲除BACH1基因，还是用小干扰RNA（siRNA）降低BACH1蛋白，都能导致荧光素酶信号急剧增强；而敲除另一个相关因子KEAP1（仅激活NRF2）则不能引起强烈反应。同时，已知的BACH1抑制剂（如血红素hemin、TBE56）能强力点亮“指示灯”，而单纯的NRF2激活剂（如莱菔硫烷SFN、CDDO）只能引起微弱发光。这表明，该报告细胞系能有效区分BACH1抑制和NRF2激活这两种不同的作用模式。
研究人员成功将这一检测体系微缩到384孔板格式，并优化了细胞密度等条件，使其适用于高通量筛选。评估参数显示，该筛选体系稳定可靠，信号背景比高，能够清晰区分阳性和阴性结果。
利用这个强大的筛选平台，研究人员对包含2046个化合物的两个小分子文库（CLOUD库和Tocriscreen库）进行了严谨的双重复筛选。筛选设定了一个基于NRF2激活剂CDDO活性的初筛阈值，以及一个基于BACH1标准抑制剂hemin活性的严格阈值。
库筛选与先导化合物发现
经过初筛、浓度-效应关系分析和细胞毒性排除等多轮严格筛选，从两千多个化合物中最终成功“捕捞”到四种命中化合物：auranofin、xanthohumol、alantolactone和CH55。这些化合物在低于10 μM的浓度下即能强效诱导HMOX1报告基因表达，且对细胞活力影响较小。
化合物验证与作用机制初探
研究人员并未止步于筛选结果，而是对这四个“候选者”进行了深入的“身份验证”和“行为分析”。
首先，在BACH1基因被敲除的细胞中，这些化合物诱导HMOX1表达的能力大幅减弱，证明了其作用依赖于BACH1的存在。其次，它们不仅能诱导报告基因，还能在多种细胞中强力上调内源性的HMOX1以及BACH1特有的靶基因（如ZNF469、HTRA3），同时也能激活NRF2的经典靶基因AKR1B10，证实了它们具有双重功能：既是BACH1的功能抑制剂，也是NRF2的激活剂。
进一步的机制研究发现，这四种化合物虽然都含有亲电性基团，但具体作用方式有所不同。其中，xanthohumol能降低BACH1的总蛋白水平，而auranofin、alantolactone和CH55则主要促使BACH1从细胞核转移至细胞质，从而降低其在细胞核内的浓度，使其无法发挥转录抑制功能。这种核输出过程不依赖于经典的核输出蛋白CRM1。所有化合物均能增加细胞核内NRF2的水平。对于xanthohumol可能通过蛋白酶体或自噬途径降解BACH1的猜测，后续实验未能完全证实，其精确分子机制仍有待阐明。
功能学验证：从2D迁移到3D侵袭的范式挑战
BACH1一个非常重要的病理功能是促进癌症细胞的侵袭和转移。因此，研究团队评估了这些化合物对多种癌症细胞系迁移和侵袭能力的影响。结果出现了有趣且具有启发性的分歧：在传统的2D Transwell迁移实验中，只有xanthohumol能一致地抑制所有测试细胞系的迁移，其他化合物的效果则因细胞系而异。这与之前普遍使用迁移实验作为BACH1抑制功能读出的惯例似乎不符。
研究人员推测，这可能是由于2D迁移实验无法模拟体内细胞侵袭过程中必需的细胞外基质重塑等复杂过程。于是，他们转向了更贴近生理状态的3D肿瘤球体胶原侵袭模型。在这个模型中，肺癌细胞形成球体后被包埋在胶原基质中，可以真实地模拟细胞向周围基质侵袭的过程。
3D侵袭分析揭示抗转移潜力
在3D侵袭模型中，结果截然不同：所有四种化合物都能显著抑制小鼠肺癌细胞系（KP及其KEAP1敲除的KPK细胞）球体的侵袭面积和侵袭性突起的数量。这一抗侵袭效果在KEAP1功能正常或缺失的细胞中均存在，说明其不依赖于KEAP1/NRF2通路，更可能源于BACH1的抑制。这一关键发现表明，传统的2D迁移实验可能会漏检BACH1抑制剂的抗侵袭效果，造成“假阴性”；而3D侵袭实验是评估BACH1靶向化合物功能更准确、更相关的读出的方法。
研究结论与重要意义
本研究成功开发并验证了一个基于HMOX1-luciferase报告基因的高通量细胞筛选平台，该平台能够高效、特异地识别功能性BACH1抑制剂。利用该平台，研究者从两千余个化合物中鉴定出四种具有新型化学骨架的BACH1抑制剂（auranofin, xanthohumol, alantolactone, CH55）。这些化合物均能降低BACH1的核内水平，并同时激活NRF2，属于双重功能化合物。研究的一个重要范式贡献在于，它挑战了当前体外功能评估的标准，明确提出并证实了3D侵袭实验相较于传统2D迁移实验，能更稳健、更准确地捕捉BACH1抑制所介导的抗侵袭表型，从而避免假阴性结果。
这些发现具有多重意义：首先，该筛选平台本身为针对BACH1这一重要但尚未被充分开发的靶点的药物发现提供了强大工具。其次，所发现的化合物，如已批准的抗风湿药auranofin和天然产物xanthohumol，具有已知的临床安全性数据，为老药新用或后续药物开发提供了有前景的起点。最后，研究强调了在肿瘤生物学特别是抗转移药物研发中，采用更贴近体内复杂微环境的3D功能模型的重要性。这项工作不仅推进了BACH1靶向治疗领域，也为开发治疗癌症转移以及氧化应激和炎症相关疾病的新型疗法提供了新的化学实体和思路。
