《Virologica Sinica》：A semi-replicating VSV (srVSV)-based platform for developing broad-spectrum mucosal vaccines against influenza A viruses
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为解决甲型流感病毒（IAV）因高突变率导致疫苗有效性不足，以及现有肌肉注射疫苗难以诱导有效黏膜免疫的问题，研究人员开发了一种新型的半复制VSV（srVSV）疫苗平台。该平台通过构建表达IAV神经氨酸酶（N1/N2）的单/双价疫苗，经小鼠鼻内免疫，成功诱导了系统性（抗体、细胞免疫）和黏膜（sIgA）免疫应答，并对同源及异源（H1N1/H3N2）IAV攻击提供了完全或高比例的保护。该研究为开发安全、高效的广谱呼吸道病毒黏膜疫苗提供了新策略。
每年，季节性流感在全球造成数亿人感染，数十万人死亡，对公共卫生构成持续威胁。罪魁祸首甲型流感病毒（Influenza A virus, IAV）以其“善变”著称，能通过快速的抗原漂移和转换，轻易逃脱我们免疫系统的记忆，导致现有疫苗，尤其是主要靶向血凝素（HA）的疫苗，保护效果常常“捉襟见肘”。更棘手的是，流感病毒从鼻腔、呼吸道等黏膜部位入侵，而当前主流的肌肉注射疫苗却难以在病毒入侵的“第一道防线”建立起有效的黏膜免疫屏障。那么，能否找到一种更聪明的疫苗策略，既能安全高效地训练我们的黏膜免疫系统，又能瞄准病毒身上更稳定、不易变异的“靶点”，从而提供更广泛的保护呢？中山大学公共卫生学院（深圳）的科研团队在《Virologica Sinica》上发表的研究，为我们带来了一个充满希望的答案。他们成功构建了一个基于“半复制”水疱性口炎病毒（semi-replicating VSV, srVSV）的新型疫苗平台，并以此开发出能针对IAV神经氨酸酶（Neuraminidase, NA）的黏膜疫苗，在小鼠模型中展现出卓越的安全性和广谱保护效力。
为验证这一设想，研究人员综合运用了多项关键技术。在平台构建与病毒制备方面，他们通过分子克隆技术构建了缺失G基因（rVSVΔG）或L基因（rVSVΔL）的缺陷型VSV基因组质粒，并在表达T7聚合酶的BHK-T7细胞中分别拯救出病毒。将两种缺陷型病毒在Vero细胞中共培养，使其互补功能，从而获得了具有复制能力但安全性提升的srVSV。在疫苗构建中，研究人员将优化后的IAV N1或N2基因插入上述载体，制备了单价疫苗srVSV-N1和双价疫苗srVSV-N1/N2。在细胞与动物水平评估中，研究采用了空斑形成试验测定病毒滴度与生长曲线，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶联免疫斑点试验（ELISpot）和酶联凝集素试验（ELLA）系统评估了疫苗诱导的体液免疫（包括血清IgG、IgG亚型、黏膜sIgA）和细胞免疫（IFN-γ分泌细胞）应答。动物实验使用了雌性BALB/c小鼠和干扰素-α受体敲除（IFNAR-/-）C57BL/6小鼠模型，通过鼻内途径进行免疫和病毒攻击，监测体重变化和生存率，并通过组织病理学分析和免疫组化评估肺部和脑部的病理变化及病毒抗原表达。
研究结果部分通过一系列严谨的实验，逐步揭示了srVSV平台的特性及其疫苗的巨大潜力。
srVSV在脑组织中的感染性较野生型VSV降低。研究人员首先证实，与野生型VSV（wtVSV）相比，srVSV在体外的复制能力减弱，对I型干扰素反应更敏感。更重要的是，在小鼠鼻内接种后，wtVSV能扩散至脑部并检测到高病毒载量，而srVSV则未在脑组织中检测到感染性病毒颗粒，且致病性在免疫缺陷小鼠中也显著降低。这些结果表明srVSV极大地改善了神经毒性这一安全性顾虑。
srVSV-N1的构建与表征。研究成功构建了表达IAV CA/09株N1蛋白的单价疫苗srVSV-N1。在感染细胞中，srVSV-N1能驱动N1蛋白高效表达并展示在细胞表面，其表达水平和神经氨酸酶活性均显著高于单轮复制载体rVSVΔG-N1。
srVSV-N1在小鼠中引发系统和黏膜免疫应答。单次鼻内免疫srVSV-N1，可诱导高水平的抗N1血清IgG抗体、具有神经氨酸酶抑制（NAI）活性的抗体，以及平衡的Th1/Th2（通过IgG1/IgG2a比率反映）和抗原特异性细胞免疫（IFN-γ+T细胞）应答。尤为关键的是，srVSV-N1还能在支气管肺泡灌洗液（BALF）中诱导出显著的N1特异性分泌型IgA（sIgA）抗体，而rVSVΔG-N1则不能。这证明了srVSV平台诱导黏膜免疫的独特优势。
srVSV-N1完全保护小鼠抵抗同源IAV感染。免疫后的小鼠在经受同源CA/09（H1N1pdm）病毒致死剂量攻击时，即使低剂量的srVSV-N1也能提供完全保护（100%存活，无体重下降，肺内无病毒检出），显著优于仅提供部分保护的rVSVΔG-N1。
srVSV-N1/N2有效抵抗异源IAV感染。为了追求更广谱的保护，团队进一步开发了同时表达N1和N2（来自H3N2病毒）的双价疫苗srVSV-N1/N2。单次免疫即可诱导针对异源PR8（H1N1）和X-31（H3N2）毒株N1、N2的交叉反应性IgG抗体，并对这两种异源病毒的攻击分别提供了80%和60%-80%的保护。
采用初免-加强策略进一步提升srVSV-N1/N2的保护效果。研究探索了“低剂量初免、高剂量加强”的免疫策略。该策略诱导了更高水平的交叉反应抗体，并实现了对异源PR8和X-31病毒攻击的完全保护（100%存活），且抗体滴度与保护效果呈强相关性。
在研究结论和讨论部分，作者总结指出，这项“概念验证”研究首次成功将srVSV开发为疫苗载体平台。该平台巧妙地平衡了安全性与有效性：一方面，其“半复制”特性（两种缺陷病毒必须同时进入同一细胞才能完成复制循环）极大地限制了病毒在肺部和脑部的扩散与复制，解决了复制型VSV载体潜在的神经毒性安全问题；另一方面，其有限的复制能力又足以在感染部位提供高于单轮复制载体的抗原表达量，从而高效地同时激活系统性免疫和至关重要的黏膜免疫（特别是sIgA）。以相对保守的神经氨酸酶（NA）为靶点，进一步拓宽了疫苗的保护范围。研究表明，单剂量的srVSV-N1即可对同源病毒实现“灭菌性免疫”，而采用初免-加强策略的双价疫苗srVSV-N1/N2则能对异源的H1N1和H3N2病毒提供完全保护。
这项研究的核心意义在于，它为解决当前流感疫苗面临的“有效性不足”和“缺乏黏膜免疫”两大瓶颈问题，提供了一个兼具创新性、安全性和高效性的全新解决方案。srVSV平台具有生产便捷（可在Vero细胞中大规模生产）、易于改造（可灵活调整抗原组合与表达水平）以及人群预存免疫力低等优势。它不仅为开发“通用型”流感疫苗带来了新希望，其平台特性也预示了其在对抗其他重要呼吸道病毒（如呼吸道合胞病毒、冠状病毒等）方面的巨大应用潜力。未来，通过优化抗原设计（如使用嵌合NA、纳入更多保守抗原）和免疫策略，这一平台有望催生出新一代能提供广泛、持久且立体防护的呼吸道黏膜疫苗。
