重组腺相关病毒库在混合包装中表现出广泛且依赖长度和同源性的嵌合现象

《Nature Biotechnology》：Pool-packaged AAV libraries exhibit extensive length-dependent and homology-dependent chimerism

本文报道了一项揭示重组腺相关病毒（rAAV）在混合包装过程中存在广泛基因组嵌合现象的研究。为解决复杂功能基因组学筛选（如单细胞CRISPR筛选和MPRA）中因载体基因组组件间错误关联导致信号质量下降的问题，研究人员通过构建包含不同长度和同源性插入片段的双条形码rAAV文库，利用长读长测序技术，系统探究了包装过程中的嵌合体形成。结果发现，rAAV包装会产生大量条形码交换事件，其发生率具有长度依赖性和同源性依赖性，且与衣壳类型无关。这一发现解释了以往基于rAAV的多重筛选实验中观察到的噪声和动态范围有限等问题，对rAAV功能文库的设计和应用具有重要指导意义。

　　

在基因治疗和功能基因组学领域，腺相关病毒（Adeno-associated virus, AAV）因其多功能性、持久性和安全性而被视为首选的基因递送载体。科学家们经常利用重组AAV（rAAV）构建复杂的病毒文库，用于大规模的筛选实验，例如单细胞CRISPR筛选或大规模平行报告基因分析（MPRA）。在这些实验中，每个病毒颗粒理论上应该包装一个特定的、组件间正确关联的基因组“货物”，例如一个指导RNA（sgRNA）与其对应的条形码正确配对。然而，一个长期存在的困扰是，在基于慢病毒载体的类似实验中，由于反转录过程中的模板转换，经常发生基因组重组，导致预期的配对关系被破坏，从而严重干扰实验信号的准确性。那么，在AAV载体中，是否也存在类似的问题呢？此前，尽管有研究通过长读长测序在AAV包装的DNA中观察到了一些意想不到的基因组排列，但关于AAV在包装过程中是否普遍存在基因组嵌合现象，仍缺乏系统性的研究和明确结论。这一问题直接关系到所有基于混合包装rAAV文库的实验数据的可靠性与解读，是领域内一个潜在却尚未被充分认识的挑战。

为了明确回答rAAV在包装过程中是否形成嵌合体，研究人员在《自然-生物技术》（Nature Biotechnology）上发表了一项开创性研究。他们巧妙地设计了一系列实验，构建了具有不同长度和同源性插入片段的高复杂度双条形码rAAV文库，利用牛津纳米孔（ONT）和PacBio等长读长测序技术，对包装前后的DNA进行了无偏见的直接测序分析，从而揭示了rAAV混合包装中普遍存在且程度惊人的基因组嵌合现象。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：1. 复杂双条形码rAAV文库构建：利用分子克隆技术，构建了包含数百万个独特条形码对、并插入不同长度（短约0.2 kb，中约0.8 kb，长约2.1 kb）和同源性（同源 vs. 非同源）片段的AAV2反向末端重复序列（ITR）框架文库。2. 病毒包装与生产：将上述文库分别包装到PHP.eB和AAV2等不同血清型的AAV衣壳中。3. 长读长测序：对质粒来源的插入片段和AAV包装的DNA进行PCR-free的牛津纳米孔技术直接测序，并辅以PacBio测序进行正交验证。4. 生物信息学分析：开发了针对长读长数据的分析流程，精确识别和量化条形码对的一致性，以计算嵌合体（即条形码交换）的比例。

研究结果

通过条形码交换实验揭示rAAV包装过程中的嵌合体形成

研究人员构建了六个不同的rAAV文库，每个文库包含大量唯一关联的条形码对（BC1和BC2），中间被不同长度和同源性的插入片段隔开。将这些文库分别包装成AAV病毒颗粒后，对包装的DNA进行长读长测序。通过比对测序读取到的BC1-BC2配对与已知的正确配对字典，他们可以量化“不一致配对”（即嵌合体）的比例。

分析发现，同源插入片段的文库在AAV包装后表现出戏剧性的条形码不一致率，从短插入片段的约20%到长插入片段的超过60%。相比之下，非同源插入片段文库的条形码不一致率则很低（≤6%），且与插入片段长度无关。这一结果明确表明，在rAAV包装过程中存在广泛的分子嵌合现象，且其形成率依赖于中间同源序列的长度。

观察到的rAAV嵌合现象对长读长文库制备程序具有稳健性

为了排除观察到的嵌合现象是特定测序文库制备方法引入的技术假象，研究人员进行了多项对照实验。他们比较了基于PCR制备的文库与直接（基于退火）制备的ONT测序文库，发现两者在嵌合体比例上高度一致。此外，他们使用了基于Bst2聚合酶延伸的PacBio测序方法进行正交验证，并对测序读长按分子类型（分子内延伸产生或分子间退火产生）进行分层分析。结果显示，无论采用何种文库制备方法或测序平台，嵌合体比例均保持一致，强有力地支持了嵌合现象是包装过程中的生物学事件，而非技术假象。

嵌合现象受包装输入剂量调节，且与衣壳类型无关

研究人员进一步探究了影响嵌合体水平的其他参数。他们通过改变转染细胞时rAAV质粒的输入剂量（在总DNA量不变的情况下，用无ITR的载体质粒补充），发现随着输入质粒剂量的降低，同源文库中的条形码不一致比例呈对数级缓慢下降趋势。这表明嵌合体的形成与包装细胞内接收的不同rAAV基因组分子的数量有关。此外，研究还发现，无论是使用PHP.eB还是AAV2血清型进行包装，都会产生相似水平的条形码交换，说明该现象存在于多种AAV衣壳和包装条件下。

研究结论与意义

本研究首次系统性地揭示并量化了重组AAV（rAAV）在混合包装过程中存在广泛的、依赖于长度和同源性的基因组嵌合现象。这一现象导致病毒文库中预期的基因组件（如条形码对）关联被大量破坏，在极端情况下可影响大部分包装的rAAV基因组。

这项发现具有多重重要意义：

1. 1.
   解释了长期困扰领域的实验噪声：它直接解释了以往在使用rAAV进行的大规模平行报告基因分析（MPRA）或其他多重功能基因组学筛选中经常观察到的高噪声和有限动态范围问题，为重新评估和解读此类历史数据提供了关键依据。
2. 2.
   对实验设计提出重要警示与指导：研究明确指出，基于混合包装的复杂rAAV文库并非“所见即所得”，其基因组完整性受到严重挑战。这要求研究者在设计涉及关联组件的实验（如需要sgRNA与条形码、或调控元件与条形码严格关联的实验）时必须审慎考虑嵌合现象的影响。
3. 3.
   提出了可行的缓解策略：尽管嵌合现象的具体分子机制尚未完全阐明（可能涉及DNA修复通路激活下的模板转换等），但本研究基于其特性提出了部分缓解策略，例如：尽量减少关联组件之间的距离、降低完全同源区域的范围、在可能的情况下降低包装细胞的共转染剂量（尽管会牺牲病毒滴度）、或在可能时完全避免使用条形码。
4. 4.
   区分了AAV与慢病毒的不同机制：与慢病毒在感染细胞后的反转录过程中发生重组不同，AAV的嵌合发生在病毒包装的生产细胞中。这一根本区别对于理解不同病毒载体的特性及优化相应实验方案至关重要。

总之，这项研究照亮了复杂rAAV文库混合生产中的一个此前未被充分认识的关键问题，为未来利用这一重要基因递送工具进行更可靠、更精准的多重化研究奠定了坚实的基础，对基因治疗载体开发和功能基因组学领域均具有重要的理论和实践指导价值。