《Systematic and Applied Microbiology》：Novel Methanosarcinaceae species Methanohalophilus methylutens sp. nov., Methanolobus methylotrophicus sp. nov., and Methanococcoides guerreronegronense sp. nov. from Guerrero Negro hypersaline microbial mats in accordance with the SeqCode
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为解决嗜盐微生物席中甲烷古菌长期“有证据、无纯种、功能不明”的认知空白，研究人员通过对瓜纳华托黑人高盐微生物席进行微宇宙实验和宏基因组分析，重建了7个高质量宏基因组组装基因组，据此提出了Methanohalophilales、Methanolobus和Methanococcoides属下的3个新物种。该研究揭示了这些新型产甲烷古菌独特的代谢策略、渗透压和氧化应激适应性及其生态位分布，丰富了Methanosarcinaceae科的系统发育分辨率，为理解高盐生态系统中产甲烷古菌的多样性与生态功能提供了关键的基因组证据。
在浩瀚的宇宙中，寻找生命印记一直是科学家们孜孜不倦的目标。而在地球上一些极端环境中，比如高盐度的盐湖、深海底卤水池，以及我们今天要聚焦的嗜盐微生物席，就生活着一类能够在无氧条件下产生甲烷的古老生命形式——产甲烷古菌。其中，Methanosarcinaceae（甲烷八叠球菌科） 家族以其代谢底物范围广泛而闻名，包含了所有已知的嗜盐、甲基营养型产甲烷古菌。位于墨西哥南下加利福尼亚州的瓜纳华托黑人盐田的嗜盐微生物席，是研究这类生物的天然实验室。尽管有充分的分子证据表明Methanosarcinaceae科的成员在此存在，甚至在某些情况下占据主导地位，但一个令人尴尬的现实是：迄今为止，还没有任何一株来自此地的产甲烷古菌被成功培养或得到正式的科学描述。这就留下了一个巨大的知识缺口：我们既不知道它们的“身份”（具体是哪个物种），也不清楚它们的“生存本领”（代谢潜能）和“生活习性”（生态功能）。为了解决这个难题，揭开这些“看不见的居民”的神秘面纱，一项发表于《系统与应用微生物学》 杂志的研究应运而生。
为了揭示这些未培养产甲烷古菌的“真面目”，研究人员采取了一套组合策略。首先，他们从瓜纳华托黑人的两个蒸发池（A4N5和A5）采集了多层嗜盐微生物席样本，并设置了包含不同产甲烷底物（如三甲胺、甜菜碱、H2/CO2）的微宇宙实验，以富集和刺激目标微生物群落。随后，他们对这些样本进行了宏基因组测序，并利用多种生物信息学流程（包括SPAdes、Megahit、metaSPAdes进行组装，以及MetaWRAP、SemiBin2等进行基因组分箱），从复杂的微生物“大杂烩”中，像玩拼图一样，精心重建出了7个高质量宏基因组组装基因组。这些MAGs随后接受了严格的基因组质量评估（使用CheckM）和系统发育定位分析（基于GTDB数据库，利用平均核苷酸同一性、平均氨基酸同一性、数字DNA-DNA杂交以及基于16S rRNA、mcr基因和53个标记蛋白的系统发育树）。为了解读其功能，研究团队进行了详细的功能基因组注释（使用DRAM、METABOLIC），分析了与产甲烷、碳代谢、渗透压适应和氧化应激相关的基因。最后，他们利用公共数据库（GenBank）中的历史数据和Branchwater地理分布搜索工具，追溯了这些新型产甲烷古菌在当地的生态连续性，并评估了其全球分布的潜力。
Methanosarcinaceae基因组从嗜盐微生物席中得以恢复
通过上述方法，研究从两个地点的微生物席中成功获得了7个高质量（>90%完整性，<5%污染）的MAGs。其中4个与Methanohalophilus属相关，2个与Methanolobus属相关，1个初步鉴定为Methanococcoides属。根据基因组质量、完整的关键基因和遗传相似性，研究者筛选出三个MAGs（E22BA4_117TS、E22_A5_bin58TS 和 E22bin_1538TS）作为各自谱系的代表，用于后续深入研究。
遗传与基因组相关性
通过ANI、AAI、16S rRNA相似性及dDDH值的综合比较，证实这三个代表基因组与已知物种存在显著差异。例如，E22BA4_117与最接近的物种Methanohalophilus portucalensis的ANI值仅为93.19%，低于通常的物种界定阈值（~95%）。E22_A5_bin58和E22bin_1538的ANI值更低，dDDH值也远低于70%的物种阈值，明确支持它们代表三个新的产甲烷古菌物种。
系统发育学
基于16S rRNA、甲基辅酶M还原酶的三个亚基（mcrA、mcrB、mcrG）以及53个标记蛋白的系统发育分析，清晰地显示了三个MAGs在Methanosarcinaceae科内的进化位置。E22BA4_117和E22_A5_bin58分别稳定地归属于Methanohalophilus和Methanolobus属。而E22bin_1538的定位在不同标记基因构建的树中存在不一致，提示它可能代表一个中间或先前未描述的新谱系。综合来看，系统发育基因组树（基于53个标记蛋白）支持E22bin_1538与Methanococcoides属关系更近。
产甲烷代谢
所有三个代表MAGs都编码了完整的核心产甲烷基因，包括fwd/fmd、ftr、mch、mtd、mer、mtr和mcr，表明它们具有完整的甲基营养型产甲烷途径。它们都编码了多种甲基转移酶，可以利用甲醇、一甲胺、二甲胺、三甲胺等甲基化合物。然而，它们缺乏功能性氢化酶和甲酸脱氢酶的关键亚基，因此利用H2/CO2（氢营养型）或甲酸盐进行产甲烷的能力有限。在能量守恒方面，它们编码了Fpo复合体、ATP合酶、Rnf复合体和多种Na+/H+逆向转运蛋白，这是典型的含细胞色素的甲基营养型产甲烷菌的能量守恒机制。
代谢灵活性与底物专一性
通过比较基因组和功能分析，揭示了三个新物种不同的生态策略。E22BA4_117是“通才”，拥有最广泛的底物利用潜力，并对甜菜碱和三甲胺均有响应，基因组中甚至含有从头合成甜菜碱的基因。E22_A5_bin58是“扩展的甲基营养型专才”，拥有最丰富的甲基转移酶库，但主要依赖三甲胺，其能量和碳代谢显示出更高的专一性。E22bin_1538则是“窄范围甲基营养型”，底物谱最窄，主要与三甲胺利用相关。
渗透压适应
为了应对高盐环境，三个MAGs都编码了多种渗透压适应相关基因，显示出结合“盐内策略”（调节离子转运）和“相容性溶质策略”（积累或吸收有机溶质如甜菜碱、脯氨酸）的能力。它们拥有钾离子转运系统、相容性溶质转运系统以及Na+/H+逆向转运蛋白。E22BA4_117和E22bin_1538还额外编码了K+/H+逆向转运蛋白，这可能使它们在应对盐度和pH波动时更具优势。
氧化适应
微生物席环境存在氧化还原波动，三个MAGs都配备了一套对抗氧化应激的“工具箱”，包括过氧化氢酶-过氧化物酶、甲硫氨酸亚砜还原酶、硫氧还蛋白还原酶和核苷酸切除修复系统等。E22_A5_bin58拥有更丰富的过氧化物还原酶基因，可能使其在应对过氧化物胁迫时更具优势。
比较基因组学
比较基因组学分析揭示了与每个谱系相关的独特基因。例如，Methanohalophilus相关的MAGs共享了参与NAD+生物合成和钴胺素转运的核心基因。Methanolobus相关的MAGs拥有与相容性溶质海藻糖生物合成前体相关的独特基因。E22bin_1538则含有与磷酸盐转运、环境感应、CRISPR-Cas系统和毒素-抗毒素系统相关的独特基因，这可能与其在更稳定但寡营养的深层微生物席中生存有关。
生态与地理分布
通过将MAGs的mcrA基因序列与瓜纳华托黑人历史研究中的序列进行系统发育定位，发现这三个新物种的代表序列在2004年至2022年的多个研究中均有检出。这证明了这些产甲烷菌种群在当地生态系统中长期存在并具有生态相关性。有趣的是，其分布模式与早期基于脂质生物标志物和CARD-FISH（催化报告沉积荧光原位杂交）的研究结果吻合，即Methanolobus、Methanohalophilus和Methanococcoides相关类群在微生物席的垂直剖面上存在分层现象。利用Branchwater进行的全球分布搜索显示，E22BA4_117的相似序列在全球多种高盐或厌氧环境（如油田）中被发现，而E22_A5_bin58和E22bin_1538的分布则更为局限，突显了它们的生态新颖性和对特定生境的适应性。
综上所述，本研究基于详实的基因组、系统发育、代谢功能和生态分布证据，正式提出了三个产甲烷古菌新物种，并依照SeqCode（基于序列数据的原核生物命名法典）规则完成了注册命名：
- 1.
Methanohalophilus methylutens sp. nov. （E22BA4_117TS）：一个适应广泛底物、能合成甜菜碱、通过离子交换调节渗透压的“通才”型嗜盐甲基营养产甲烷菌。
- 2.
Methanolobus methylotrophicus sp. nov. （E22_A5_bin58TS）：一个专注于甲基胺利用、依赖吸收相容性溶质、拥有强化抗氧化系统的“专才”型嗜盐甲基营养产甲烷菌。
- 3.
Methanococcoides guerreronegronense sp. nov. （E22bin_1538TS）：一个底物范围较窄、通过离子交换进行渗透压调节、生活在更稳定深层环境中的“窄谱”型嗜盐甲基营养产甲烷菌。
这项研究的意义重大。它首次为瓜纳华托黑人嗜盐微生物席中已知存在但未培养的Methanosarcinaceae产甲烷菌赋予了正式的物种“身份”和详细的基因组“蓝图”，填补了该领域长期的知识空白。通过深入解析其代谢潜能，揭示了它们独特的生态策略（通才、专才、窄谱）和对极端环境（高盐、氧化应激）的精妙适应机制。这些发现不仅极大地丰富了Methanosarcinaceae科的系统发育多样性，为理解产甲烷古菌的进化提供了新视角，也深化了我们对高盐生态系统，特别是微生物席这类复杂、分层的生态系统中，碳循环关键参与者——产甲烷古菌的功能与生态位分化的认识。此外，研究建立的基因组资源和方法也为未来在全球其他极端环境中发现和表征未培养的微生物生命提供了范例。
