2,4,5-三取代的7H-吡咯[2,3-d]嘧啶衍生物的设计、合成及其生物学评价：作为针对C797S获得性耐药突变的强效EGFR酪氨酸激酶抑制剂

《Bioorganic & Medicinal Chemistry》：Design, synthesis and biological evaluation of 2,4,5-trisubstituted 7H-Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine derivatives as potent EGFR tyrosine kinase inhibitors against the C797S acquired resistance mutation

　　张浩|兰天龙|李瑞|李广燕|袁江|王松宁|张振军|张振宇|刘静|刘华|徐丽娟|李玉婷|潘思娜|潘丽红|王希双|王宪珍|徐晓丽|肖贺|文一潇|王恩莉|张桂敏
中国临沂市经典方剂与现代中药整合创新国家重点实验室，273400

**摘要**
表皮生长因子受体（EGFR）中的C797S突变在治疗非小细胞肺癌（NSCLC）时构成了重大挑战，因为它会导致对奥西替尼的耐药性。为了解决这个问题，我们设计并合成了新型的7H-吡咯[2,3-d]嘧啶衍生物，这些衍生物能够在存在C797S突变的情况下与EGFR激酶结构域结合。代表性化合物cis-32（LN-B72）不仅对EGFRDel19/T790M/C797S和EGFRL858R/T790M/C797S突变体表现出显著的激酶抑制活性，IC50值分别为8.7 nM和7.9 nM，同时还显示出强烈的抗增殖活性，在相应的突变细胞模型中IC50值达到0.046 μM和0.060 μM。此外，LN-B72对包括携带外显子20插入突变的EGFR突变体也具有广谱抑制作用。机制研究表明，LN-B72通过阻止关键下游蛋白的磷酸化来破坏EGFR信号通路。体内抗肿瘤活性实验表明，LN-B72显著抑制了肿瘤生长。这项工作为开发针对携带C797S突变的NSCLC患者的新治疗策略奠定了有希望的基础。

**引言**
根据世界卫生组织（WHO）的最新数据，2022年肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率分别为12.4%和18.7%，仍然是主要的全球健康问题。非小细胞肺癌（NSCLC）占肺癌病例的约80%-85%，是对人类健康构成严重威胁的主要亚型。目前，针对EGFR的疗法仍是NSCLC治疗的关键研究领域。EGFR突变是NSCLC的主要致癌驱动因素，其中外显子19缺失（Del19）和外显子21突变L858R是最常见的类型，占约85%-90%，而EGFR外显子20插入突变（EGFR ex20ins）占第三位，占1%-12%。针对这些突变是EGFR抑制剂的主要治疗策略。目前，EGFR抑制剂已经发展到第四代。第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs），如吉非替尼（化合物1，图1），可逆地结合到ATP结合位点，有效阻断下游信号通路，从而在治疗的初期抑制肿瘤细胞生长。然而，大多数接受第一代EGFR-TKIs治疗的肺癌患者在治疗开始后大约一年内会发展出药物耐药性。在大约49%-63%的患者组织样本中检测到了T790M突变，这被认为是对第一代EGFR-TKIs耐药性的主要机制。第二代EGFR-TKIs，如阿法替尼（化合物2，图1），不可逆地结合到酪氨酸激酶激活结构域，可以部分克服T790M耐药性。然而，第二代EGFR-TKIs的临床疗效受到其缺乏对野生型EGFR和突变型EGFR选择性的限制。这类抑制剂强烈抑制野生型受体，导致剂量限制性的毒性副作用，限制了其临床应用。值得注意的是，第三代EGFR-TKIs，以奥西替尼（化合物3，图1）为代表，既能抑制野生型EGFR，又能克服T790M突变介导的耐药性。这种双重机制使这些药物具有更好的耐受性和疗效，成为NSCLC的一线治疗选择。但由于癌症的复杂性，约30%-40%的奥西替尼治疗患者出现了新的C797S突变。第三代EGFR抑制剂通常依赖丙烯酰胺亲电试剂通过迈克尔加成与Cys797形成不可逆的共价加合物，从而实现强效的激酶抑制。C797S突变通过将亲核的半胱氨酸替换为丝氨酸残基来导致耐药性。由于丝氨酸羟基的亲核性不足，关键的迈克尔加成无法发生，导致共价结合完全丧失，进而引发药物耐药性，最终促进肿瘤进展。与此同时，Mobocertinib（化合物4，图1）是一种针对EGFR ex20ins突变的第三代EGFR-TKI，于2021年获得FDA批准上市。然而，武田研究总裁Andy Plum在2023年第一季度财务报告中宣布，由于该试验未能达到主要终点，针对携带外显子20ins突变的NSCLC患者的一线治疗的Mobocertinib三期试验被自愿终止。结构上，Mobocertinib包含一个用于与Cys797共价结合的丙烯酰胺基团和位于嘧啶骨架上的异丙基酯，以优化与关键残基的相互作用。尽管这种双重设计策略成功针对了EGFR ex20ins突变并取得了初步的临床疗效，但它仍然容易受到C797S突变的影响。这种突变消除了迈克尔加成所需的亲核硫醇，导致共价抑制完全丧失，从而使药物失去治疗效果，最终终止了三期试验。目前，开发第四代EGFR抑制剂以对抗C797S突变介导的耐药性是肿瘤学领域亟待解决的需求。已经出现了几种针对C797S突变的高活性EGFR-TKIs。根据其作用机制，这些抑制剂可以分为不可逆抑制剂（化合物6和9）和可逆抑制剂（化合物7、8、brigatinib（10）、TQB3804（11）和BLU-945（12）以及别构抑制剂EAI045（5），如图1所示。这些化合物对C797S突变表现出强效的抑制活性，其中BLU-945（目前处于二期临床试验阶段）对EGFRL858R/T790M/C797S的IC50值为0.5 nM。然而，在NCT04862780试验中观察到的临床剂量限制性毒性可能阻碍其临床开发。尽管EGFR靶向治疗取得了显著进展，但至今尚未有第四代EGFR-TKIs获得批准。我们的目标是设计和发现高效第四代EGFR-TKIs，为新型化合物的开发提供坚实的理论基础，并加速这一药物类别向临床应用的转化。

**方法**
为了开发针对EGFR Del19/T790M/C797S和L858R/T790M/C797S三重突变的新候选化合物，我们采用了基于结构的药物设计（SBDD），借鉴了奥西替尼和阿维替尼的药效团结构，设计了7H-吡咯[2,3-d]嘧啶骨架（图2）。关键的结构优化包括：通过环融合引入氢键供体（吡咯[2,3-d]嘧啶的NH基团），以与保守的铰链区域建立三齿氢键。

**结构-活性关系（SAR）分析**
在上述战略框架的指导下，我们设计了一个初始的7H-吡咯[2,3-d]嘧啶衍生物库（表1）。在BHP区域，所有化合物都包含一个4-氟苯基基团（R4）。关键的SAR研究表明，7H-吡咯[2,3-d]嘧啶的NH基团对活性至关重要，而R3被甲基哌嗪基团取代，R1保持为NH。

**化学合成**
目标化合物13–50的通用合成路线如图1所示。从2,4-二氯-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶（58）开始，通过Friedel-Crafts酰基化反应生成中间体59。随后用各种胺或醇对59进行SnAr亲核取代，得到4-氯取代的中间体63。最后，63与不同的苯胺衍生物进行Buchwald-Hartwig偶联反应，得到目标化合物13、LN-B72和33。

**结论**
在这项研究中，我们设计并合成了一系列基于7H-吡咯[2,3-d]嘧啶的衍生物，其中化合物cis-32（LN-B72）作为先导候选物表现出对多种EGFR突变体的卓越抑制活性。对于EGFRDel19/T790M/C797S，LN-B72表现出单数字纳摩尔级的激酶抑制活性（IC50 = 8.7 nM）和强效的细胞抑制活性（IC50 = 46 nM）；对于EGFRL858R/T790M/C797S，其激酶抑制活性为7.9 nM。

**作者贡献声明**
张浩：撰写、审阅与编辑、概念化；
兰天龙：方法学；
李瑞：撰写、审阅与编辑、初稿撰写；
李广燕：方法学；
袁江：研究；
王松宁：研究；
张振军：研究；
张振宇：研究；
刘静：研究；
刘华：研究；
徐丽娟：研究；
潘思娜：研究；
潘丽红：方法学；
王希双：研究；
王宪珍：方法学。

**资助**
本研究得到了国家重点研发计划前沿生物技术重点专项（2023YFC3402400）的支持。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。

**致谢**
作者感谢ReadCrystal Biotechnology Co., LTD在X射线晶体学实验中的协助。同步辐射实验在上海同步辐射设施（SSRF）的BL02U1、BL10U2和BL19U1光束线上进行。