整合基因组学与单细胞分析发现Notch1是鼻咽癌中的转移抑制因子，该因子受到AKT/Smad3信号通路的调控

《Biological Procedures Online》：Integrated Genomic and Single-Cell Analysis Identifies Notch1 as a Metastasis Suppressor in Nasopharyngeal Carcinoma Targeted by the AKT/Smad3 Axis

　　

摘要

背景

Notch1在头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中表现出较高的突变率，但其在鼻咽癌（NPC）侵袭和转移中的功能作用尚未完全明了。本研究系统地探讨了Notch1作为NPC转移抑制因子的相关功能和分子机制。

方法

通过免疫组化技术在NPC组织微阵列中评估了Notch1的表达水平，并分析了其与肿瘤分化和转移的相关性。利用TCGA数据库挖掘了突变率信息，并基于EMT相关基因特征对样本进行了聚类分析。通过对TCGA和GEO数据集的整合分析，鉴定出了与Notch1相关的基因，从而实现了患者的分子分类。此外，还对NPC临床样本进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以验证Notch1与肿瘤微环境中的干性及EMT特征之间的关联。进一步在体外通过增殖（CCK-8、菌落形成）、迁移和侵袭（Transwell、伤口愈合）实验，以及在体内异种移植和转移模型中研究了Notch1的生物学功能。通过检测EMT标志物、Smad3磷酸化及核转位，以及通过共免疫沉淀技术研究蛋白质-蛋白质相互作用，来探究其分子机制。

结果

免疫组化结果显示NPC组织中Notch1表达显著降低，这与肿瘤分化不良和淋巴结转移密切相关。TCGA分析显示HNSCC中的Notch1突变率为16.8%。基于EMT相关基因的共识聚类分析发现了Notch1突变状态存在显著差异的亚组。利用整合数据集中的181个Notch1相关基因，将患者进一步分为三个分子亚型（C1、C2、C3），这些亚型在预后、Notch1突变率、EMT状态、免疫特征及铁死亡相关基因表达方面存在差异。值得注意的是，C2亚组的Notch1突变率最高，EMT状态最强，预后最差，且免疫抑制作用最明显。与这些多维数据集的结果一致，对原发性NPC样本的scRNA-seq分析表明，Notch1高表达的肿瘤细胞更倾向于保持分化良好的上皮细胞表型，具有较低的EMT和干性特征，进一步支持了Notch1在临床肿瘤中具有抑制EMT和转移的作用。功能上，Notch1在多个NPC细胞系中表达下调；敲除Notch1显著促进了NPC细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，无论是在体外还是裸鼠模型中均是如此。从机制上看，Notch1缺失增加了EMT标志物的表达，增强了Smad3的磷酸化和核转位，但总Smad3水平未发生变化。研究发现Notch1的细胞内结构域直接与Smad3相互作用，而Notch1缺失后AKT与Smad3的相互作用减弱，导致Smad3磷酸化水平升高和EMT相关基因激活。

结论

Notch1通过调控AKT/Smad3通路来抑制NPC中的EMT和转移。这些发现为NPC的分子分类和靶向治疗策略提供了新的见解。