AZD1402（Elarekibep）T细胞表位在健康志愿者和接触过该药物的临床试验参与者中的免疫原性潜力

《Archives of Toxicology》：The immunogenic potential of AZD1402 (Elarekibep) T-cell epitopes in healthy volunteers and drug-exposed clinical trial participants

　　摘要：AZD1402（Elarekibep）是一种新型抗体蛋白，具有工程化的IL-4Rα拮抗剂结合特性，曾用于哮喘的吸入治疗研究。由于其结构与泪液脂质运载蛋白（tear-lipocalin）相似，因此被认为可以降低免疫原性风险；然而，在一项临床研究中观察到了多种类似过敏反应的不良反应。本研究旨在：（i）探讨AZD1402及泪液脂质运载蛋白衍生物肽类对人类T细胞的激活作用；（ii）鉴定AZD1402中包含的T细胞表位；（iii）明确这些反应的性质。研究使用了暴露于AZD1402的研究参与者的外周血单核细胞（PBMC）以及未接触过AZD1402的捐赠者的PBMC，这些细胞与AZD1402及AZD1402衍生的18个氨基酸长的肽类共同培养，并测量了细胞的增殖情况和细胞因子的分泌情况。通过生成T细胞克隆来分析T细胞表位的多样性和对这些肽类的反应性。AZD1402含有多个位于分子“热点”区域的表位，这些表位能够激活来自研究参与者和未接触过AZD1402的捐赠者的PBMC以及MHC II类限制性的CD4+ T细胞克隆。通过突变产生的氨基酸替换改变了AZD1402的结合特性，但在泪液脂质运载蛋白中未发现类似的T细胞表位。检测到对AZD1402及其衍生物肽类有反应的T细胞克隆，表明免疫原性表位是通过AZD1402的加工过程自然形成的。这些数据揭示了AZD1402相关的免疫原性风险，并为评估抗体蛋白或其他大分子治疗药物中修饰序列的免疫原性潜力提供了框架。

引言：脂质运载蛋白是一类低分子量（16–20 kDa）的结合蛋白，在许多生物体内负责运输、储存或隔离维生素和激素等小分子化合物。它们具有高度保守的核心结构，该结构包含4个可变环，这些环在长度、氨基酸序列和骨架构象上有所不同，从而解释了它们广泛的配体特异性（Schiefner等人，2015年）。近年来，通过组合蛋白质工程技术对天然脂质运载蛋白的配体结合位点进行了改造，生成了多种突变库，并从中筛选出具有增强结合能力或新结合功能的变体。由此产生的抗体蛋白与天然脂质运载蛋白具有同源性（Deuschle等人，2021年；Gille等人，2016年；Rothe和Skerra，2018年；Vogt和Skerra，2004年），由于设计过程仅限于氨基酸替换而不涉及插入或删除，因此保持了分子的二级和三级结构（Achatz等人，2022年；Sch?nfeld等人，2009年）。由于蛋白质体积小，抗体蛋白被认为是吸入给药的理想候选药物。AZD1402（Elarekibep）是一种强效且选择性的IL-4Rα拮抗剂，作为潜在的新哮喘治疗药物正在研发中，其结构与人体内源性泪液脂质运载蛋白（Lcn1，也称为lipocalin-1）相似。AZD1402由158个氨基酸组成，与原始蛋白相比有28个氨基酸的突变，其中26个突变位于可变环内，从而影响了分子的结合位点（Matschiner等人，2023年）。在一项临床药代动力学研究中，不同剂型的AZD1402以随机顺序交叉给药，至少间隔5天，以比较雾化剂溶液和干粉剂的效果。在18名健康志愿者中，有5人在第三次给药后数小时内出现了治疗相关的不良反应（https://clinicaltrials.gov/study/NCT03921268）。由于这些不良反应与给药时间接近，并且C反应蛋白水平升高，临床情况提示可能是对AZD1402的过敏反应。临床前毒性研究的结果导致AZD1402的2a期试验和整个开发项目被终止。由于免疫原性涉及将治疗蛋白经过抗原呈递细胞处理后形成的MHC II类相关肽呈递给CD4+ T细胞（Attermann等人，2021年；Barra等人，2020年；Jawa等人，2013年；Moussa等人，2016年；Sauna等人，2020年；Sivelle等人，2023年），本研究旨在探讨无论是否出现不良反应，研究参与者体内是否会产生针对AZD1402蛋白或其衍生物肽类的T细胞反应。此外，该研究还旨在分析T细胞表位的多样性以及T细胞对这些肽类的反应性。

方法：
**研究参与者与伦理考量**：试验单位Parexel International作为招募点，纳入了利物浦大学NHS伦理审查（一项关于药物和化学物质诱导的过敏反应的机制研究[HYST] SA13）。在18名参与药代动力学桥接研究（https://clinicaltrials.gov/study/NCT03921268）的参与者中，有11名参与者（包括3名出现不良反应的参与者E1120、E1122、E1141）被纳入本研究（表1），同时还有来自利物浦的未接触过AZD1402的捐赠者。所有参与者均接受了口头研究说明，并签署了相应的知情同意书。健康捐赠者来自利物浦药理学生物库，招募过程得到了利物浦研究伦理委员会的批准。所有捐赠者均根据《赫尔辛基宣言》提供了书面知情同意，并且未接触过AZD1402。从这些参与者中抽取了最多108毫升的静脉血，置于肝素锂涂层管中（Greiner Bio-One）以研究T细胞反应。由于SARS-Cov2大流行和长时间无法接触部分参与者，血液样本是在他们临床接触AZD1402大约18个月后采集的。使用Chemagic磁分离技术（Chemagen，德国Baesweiler）从11名参与者的PBMC中提取了基因组DNA。随后，美国纽约Histogenetics实验室使用下一代测序技术对HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DPB1和-DQB1这6个位点进行了高分辨率序列分析。

**试剂**：AZD1402及其制剂辅料1（D-(+)-Trehalose Dihydride）和2（L-leucine）由阿斯利康公司（瑞典哥德堡）提供，储备浓度为3.14mM。泪液脂质运载蛋白由Pieris Pharmaceuticals公司（德国慕尼黑）提供，储备浓度为700μM。蛋白质分装后储存在-80°C条件下备用。所有肽类（纯度≥95%）均购自SynPeptide公司（中国上海），并在DMSO中重新配制为25-50mM的储备浓度，分装后储存在-20°C条件下备用。69种AZD1402衍生的18个氨基酸长的肽类是根据AZD1402全长设计的序列步进生成的。为了初步分析PBMC，准备了包含12-16种肽类的AZD1402衍生物肽池（PP1-5，见补充表1）。为了进一步分析T细胞表位和生成T细胞克隆，还制备了一个包含12种AZD1402衍生物肽的肽池（PPP）。泪液脂质运载蛋白衍生物肽是根据相应野生型序列生成的，以对照PPP中的AZD1402衍生物肽。

**外周血单核细胞分离**：静脉血样本被送往利物浦进行即时PBMC分离。全血分层后置于Lymphoprep（Stemcell technologies，英国剑桥）上，以800 g离心20分钟以分离各血细胞成分。含有PBMC的浑浊层被收集起来，并用磷酸盐缓冲盐水洗涤后进行细胞计数。新鲜的PBMC用于后续的淋巴细胞转化试验和PBMC ELISpot检测。剩余的PBMC被冷冻保存（80%胎牛血清，20% DMSO），储存在-150°C的符合人类生物样本标准的冷冻柜中以备后续分析。

**细胞培养基**：T细胞的培养基（R9）由RPMI 1640组成，添加了5%热灭活的人类AB血清、HEPES（25mM）、青霉素（1000U/mL）、链霉素（0.1 mg/mL）和转铁蛋白（25 μg/mL）。EBV转化的B细胞则在含有10%胎牛血清、HEPES（25mM）、青霉素（1000U/mL）、链霉素（0.1 mg/mL）和L-谷氨酰胺（2mM）的F1培养基中培养。

**PBMC增殖抑制试验**：从7名未接触过AZD1402的捐赠者（HD175、HD176、HD176、HD755、HD756、HD757和HD762）中获取的PBMC（1.5 × 10^5/100 μL）与AZD1402或辅料1和2共同培养24小时。随后加入10 μg/mL的PHA，并在最后16小时加入[3H]胸苷（Moravek Biochemicals Inc，美国Brea）。通过闪烁计数法测量细胞增殖情况。本实验的目的是确定PBMC所能耐受的最大测试化合物浓度。需要注意的是，本研究中使用的放射性计数方法可能不适合大规模的免疫原性筛查。在其他实验中，可以使用替代的增殖检测方法或细胞因子分泌检测来替代[3H]胸苷的添加。

**淋巴细胞转化试验**：PBMC（1.5 × 10^5/100 μL）与无毒浓度的肽类（PP1-5）、辅料1和2以及完整蛋白质（AZD1402和泪液脂质运载蛋白）共同培养。培养基作为阴性对照，PHA（10 μg/mL）作为阳性对照。细胞培养6天后，在最后16小时加入[3H]胸苷。增殖情况通过闪烁计数法测量。

**PBMC细胞因子分泌**：ELISpot板先用15 μL的35%乙醇激活，然后用dH2O清洗五次。接着用100 μL/孔的干扰素γ（IFN-γ）捕获抗体覆盖板孔，并在4°C下孵育过夜。次日，用无菌PBS清洗板孔五次，然后用200 μL的R9培养基在室温下封闭30分钟。PBMC（5 × 10^5/100 μL）与不同浓度的肽类、辅料及完整蛋白质共同培养48小时。R9和PHA（10 μg/mL）分别作为阴性和阳性对照。培养完成后，根据制造商说明进行ELISpot分析。

**CD3和CD45RO去除**：使用Miltenyi磁珠LS柱通过正选择法去除PBMC中的CD3+ T细胞和CD45RO+ T细胞。该过程重复多次，直至去除率超过97%。随后将这些CD3和CD45RO去除的PBMC用于上述的淋巴细胞转化试验和IFN-γ ELISpot检测。流式细胞术使用CD3-PerCP-Cy5.5（Biolegend，英国）和CD45RO-PE（Biolegend，英国）荧光抗体进行检测。所有样本的细胞总数为10,000个。阳性与阴性细胞群体的百分比是通过预定义的阈值计算得出的，以确认在耗尽条件下大约有3%的CD3和CD45RO-细胞存活。抗原响应性T细胞克隆的生成是通过将PBMC与AZD1402或AZD1402衍生的刺激肽池（称为PPP，见图4c）共同培养14天来实现的。在第6天和第9天添加IL-2（50IU/mL）以维持细胞增殖。在第14天，通过连续稀释对T细胞进行克隆，每个孔中分别接种3个、1个或0.3个细胞（每个条件至少使用3个96孔板），并加入含有IL-2（200IU/mL）、PHA（5 μg/mL）和辐照的同种异体PBMC（作为饲养细胞；0.5 × 10^6/mL）的刺激混合物。细胞培养5天后，每2天使用R9和IL-2（25IU/mL）进行喂养。连续稀释14天后，使用含有IL-2（50IU/mL）、PHA（5 μg/mL）和辐照PBMC（1 × 10^6/mL）的刺激混合物重新刺激T细胞。大约在重新刺激后14天，选择扩增的克隆并进一步扩增，然后评估其特异性。通过将T细胞克隆（5 × 10^4个/50μL）与自体EBV转化的B细胞（1 × 10^4个/50μL）在有无AZD1402或PPP的情况下共同培养48小时来确定T细胞克隆的特异性。培养后，加入氚标记的胸苷（0.5μCi）再培养16小时，并通过闪烁计数法测量细胞增殖情况。那些刺激指数达到2或更高的克隆在IL-2存在下进行有丝分裂扩增，持续14天，之后评估其表型和功能。

AZD1402及其衍生物肽响应性T细胞克隆的特异性是通过将T细胞克隆（5 × 10^4个/孔）与自体EBV转化的B细胞（1 × 10^4个/孔）在有无AZD1402或PPP的情况下共同培养48小时（37°C，5% CO2）来确认的。T细胞反应性是通过量化增殖或IFN-γ分泌来确定的。T细胞克隆的细胞表型是通过流式细胞术（FACS Canto II，BD）使用CD4-FITC和CD8-PE荧光抗体（BD Pharmingen，美国圣何塞）来确定的。每个样本收集了总共10,000个事件。根据制造商的说明（Mabtech，瑞典Nacka Strand），使用Fluorospot测量AZD1402和PPP响应性克隆分泌的IFN-γ、IL-13和颗粒酶B的量。在加入最佳浓度的AZD1402或PPP（分别为100μM或10μM）之前，T细胞克隆和EBV转化的B细胞还预先用同型（IgG1）或HLA I类（DX17）、HLA II类（Tu39）或HLA-DR（G46-6）阻断抗体（最终浓度均为10 μg/mL，购自BD Pharmingen，美国圣何塞）处理2小时。

结果显示，不良事件与HLA携带情况没有明显关联。尽管发生不良事件的参与者数量非常少（n = 3；表1），但所有3名反应参与者都表达了HLA-DP1*04:01；然而，HLA-DP1*04:01等位基因在欧洲人群中的频率为40-50%。在3名出现类似过敏反应的不良事件的参与者中观察到了特定的HLA I类等位基因（例如，A*021:01，C*06:02）；然而，在没有不良事件的参与者中也检测到了相同的等位基因。

为了确定PBMC刺激研究的最佳化合物浓度，进行了抑制试验。AZD1402在浓度高于100μM时抑制了PHA诱导的PBMC增殖（结果未显示）；然而，在浓度高达800μM时仍有活性的PBMC存在。辅料1（D-(+)-Trehalose Dihydride）没有抑制PHA诱导的增殖（1-1000μM），而辅料2（L-Leucine）在100μM及以上浓度时抑制了增殖。因此，AZD1402、辅料1和辅料2的最大工作浓度分别为800μM、1000 μM和100 μM。AZD1402的重叠肽池（PP1-5，补充表1）在非抑制浓度10μM及以下使用。

来自药代动力学研究参与者和未暴露个体的PBMC在AZD1402衍生物肽的存在下会增殖。PP1-5在不同程度的程度上刺激了研究参与者的PBMC增殖（补充图1）。在报告有和没有不良事件的参与者之间，增殖情况没有明显差异。至少有5名研究参与者的PBMC在PP1、PP3和PP4的刺激下表现出强烈的浓度依赖性增殖。使用全蛋白培养时，3名供体（E1122、E1135和E1114）的PBMC也表现出浓度依赖性的增殖。其中两名供体的PBMC在最高浓度的AZD142下增殖减少，这可能是由于直接毒性所致。当研究参与者的PBMC单独与辅料1或2培养时，没有观察到增殖增加。

在3名未接触AZD1402的供体（HD177）中，有1名的PBMC在PP1-5的存在下被刺激增殖，并且大多数肽池都观察到了浓度依赖性的反应（补充图1）。其余两名未接触AZD1402的供体（HD175和HD176）的肽池特异性增殖反应较弱。AZD142在某些浓度下刺激了供体HD175的PBMC增殖，但没有明显的浓度-反应关系。辅料没有刺激PBMC的增殖，除了供体HD177在最高测试浓度下有轻微的增加。

大多数AZD1402药代动力学研究参与者的PBMC在AZD1402衍生物肽的存在下被刺激分泌IFN-γ（图1b）。供体E1133和E1141是例外，它们在与肽池培养后观察到的IFN-γ分泌水平与溶剂对照孔相似。使用PP1、PP3和PP5培养的PBMC分泌的IFN-γ水平相似，而在一些研究参与者中使用PP2时检测到的IFN-γ水平较低。在有（E1120、E1122和E1141）和没有不良事件的参与者之间没有明显差异。未接触AZD1402的PBMC没有检测到IFN-γ的分泌。暴露于全蛋白AZD1402的研究参与者E1120和E1122的PBMC分泌的IFN-γ水平较低。在剩余的试验参与者和未接触AZD1402的供体中，针对AZD1402全蛋白的响应也较低。与临床研究参与者的PBMC观察到的响应类似，暴露于PP1-5的AZD1402未接触供体的PBMC也检测到了IFN-γ的分泌（图1c）。

AZD1402研究参与者的PBMC和未暴露个体的ELISpot分析显示，PBMC在PP1-5、辅料1-2（Ex1 & Ex2）和AZD1402（工作浓度：肽池10μM、辅料50μM或AZD1402 100μM）的存在下培养48小时，R9培养基作为阴性对照，PHA作为阳性对照。数据以斑点形成单位报告，并附有定量数据（重复孔的平均值）和孔的图像。红色表示出现不良事件的参与者。

所有5个肽池都刺激了所有队列的PBMC分泌细胞因子，无论之前是否接触过AZD1402或是否出现不良事件。检测到了一系列T细胞细胞因子，包括但不限于IFN-γ、TNF-α、MIP-1β和IL-6（图2a）。有趣的是，Th2细胞因子如IL-4和IL-13仅在接近未刺激对照（IL-4）或鉴定下限（IL-13）的水平被检测到，尽管所有5个肽池都观察到了统计学上显著的IL-4分泌。肽刺激没有增加EGF、FGF-2、Eotaxin、Fit-3L、fractalkine、MCP-3、IP-10、VEGF、IL-8、MCP-1、IL-15、IL-17、IL-9和IL-3的水平，超过未处理对照的水平。除了IL-4的未刺激对照外，不同供体组（药物反应性、非反应性、未暴露）之间没有观察到统计学上的显著差异（补充图2）。创建了主成分分析（PCA）图来可视化不同肽处理和供体组之间的细胞因子反应的整体差异（补充图3）。尽管可以区分对照组和肽处理组，但各种肽刺激之间的细胞因子反应没有显著差异（补充图3）。当比较药代动力学研究参与者的肽池刺激的PBMC和未接触AZD1402的供体的PBMC时，没有观察到细胞因子分泌的差异，尽管供体1118的反应似乎比其他供体更大（补充图4）。鉴于从PP1-5处理的PBMC中检测到的强IFN-γ和Th1样细胞因子分泌谱，进行了分析以测量传统上由CD8细胞分泌的细胞毒性分子——颗粒酶B和穿孔素的分泌。与溶剂对照值相比，暴露于PP1-5的PBMC分泌了这两种细胞毒性分子，尽管没有检测到AZD1402暴露或临床研究中出现不良事件的个体之间的相关性（图2b）。

A组AZD1402研究参与者的PBMC和B组未暴露个体的ELISpot分析显示，PBMC在ELISpot板上培养，预先涂有IFN-γ捕获剂，在PP1-5、辅料1-2（Ex1 & Ex2）和AZD1402的工作浓度下培养48小时，R9培养基作为阴性对照，PHA作为阳性对照。数据以斑点形成单位报告，并附有定量数据（重复孔的平均值）和孔的图像。红色表示出现不良事件的参与者。

所有5个肽池都刺激了所有队列的PBMC分泌细胞因子，无论之前是否接触过AZD1402或是否出现不良事件。通过全局多重分析检测到了一系列T细胞细胞因子，包括但不限于IFN-γ、TNF-α、MIP-1β和IL-6（图2a）。有趣的是，Th2细胞因子如IL-4和IL-13仅在接近未刺激对照（IL-4）或鉴定下限（IL-13）的水平被检测到，尽管所有5个肽池都观察到了统计学上显著的IL-4分泌。肽刺激没有增加EGF、FGF-2、Eotaxin、Fit-3L、fractalkine、MCP-3、IP-10、VEGF、IL-8、MCP-1、IL-15、IL-17、IL-9和IL-13的水平。除了IL-4的未刺激对照外，不同供体组（药物反应性、非反应性、未暴露）之间没有观察到统计学上的差异（补充图2）。创建了主成分分析（PCA）图来可视化肽处理和供体组之间的细胞因子反应的整体差异（补充图3）。尽管可以区分对照组和肽处理组，但各种肽刺激之间的细胞因子反应没有显著差异（补充图3）。当比较药代动力学研究参与者的肽池刺激的PBMC和未接触AZD1402的供体的PBMC时，没有观察到细胞因子分泌的差异，尽管供体1118的反应似乎比其他供体更大（补充图4）。鉴于从PP1-5处理的PBMC中检测到的强IFN-γ和Th1样细胞因子分泌谱，进行了分析以测量传统上由CD8细胞分泌的细胞毒性分子——颗粒酶B和穿孔素的分泌。与溶剂对照值相比，暴露于PP1-5的PBMC分泌了这两种细胞毒性分子，尽管没有检测到AZD1402暴露或临床研究中出现不良事件的个体之间的相关性（图2b）。

8名研究参与者的肽池暴露PBMC和5名未暴露AZD1402的供体的细胞因子和细胞毒性分子分泌。PBMC与溶剂对照或PP1-5共同培养5天，并通过珠阵列量化细胞因子/细胞毒性分子的分泌。条形图显示平均值±标准差；点代表个别供体。颜色编码：红色=药物反应性，蓝色=非反应性，灰色=未暴露AZD1402。虚线水平线表示测定的LLoQ/ULoQ。肽处理之间的差异通过双向ANOVA进行分析。肽池与未刺激对照的比较使用了Dunnett检验；显著性用*表示，p < 0.05；**，p < 0.01；***，p < 0.001；****，p < 0.0001。ULoQ-定量上限；LLoQ-定量下限。

当PBMC暴露于跨越AZD1402结构的多种肽时，观察到IFN-γ的分泌（图3a）。图3a总结了3名未接触药物的供体的结果，其中2名供体对某些肽的响应中IFN-γ分泌水平较高。PBMC激活和IFN-γ分泌似乎与该分子中由重叠肽定义的某些区域相关，表明每个肽包含一个共同的T细胞激活表位。根据上述实验，肽被分为4类：第1组，没有点突变但能刺激（通常水平较低）至少一名供体的PBMC分泌IFN-γ的肽；第2组，有点突变且能刺激（通常水平较低）一名供体的PBMC分泌IFN-γ的肽；第3组，有点突变且能刺激2名供体中的PBMC分泌IFN-γ的肽；第4组，有点突变且能刺激所有未接触药物的供体的PBMC分泌IFN-γ的肽。这些组中的每种肽都与另外5至6名未接触AZD1402的供体的PBMC共同培养，IFN-γ分泌以刺激指数表示，以便于供体间的简单比较。第3组和第4组中的大多数肽都刺激了PBMC的IFN-γ分泌；然而，在第1组和第2组的肽培养后没有检测到IFN-γ的分泌（图3b）。基于上述数据，生成了一个包含12种肽的PBMC刺激池，称为主要肽池（图3c显示了肽序列及其在AZD1402中的位置）。

AZD1402刺激肽的特性分析。图3显示了未接触药物的个体PBMC在与单个AZD1402衍生物肽（10μM）共同培养48小时后的IFN-γ分泌情况。数据以斑点形成单位表示。B组肽根据刺激特性分组（来自数据4A），并在5-6名额外血液供体的PBMC刺激后测量IFN-γ分泌。PBMC在单个肽（10μM）的存在下培养48小时。数据以刺激指数表示（测试培养中的斑点形成单位/培养基对照中的斑点形成单位）。C组比较了泪液脂质运载蛋白（顶部）和AZD1402（底部）的氨基酸序列，其中点突变用红色突出显示。用彩色框突出显示的氨基酸序列表示激活供体PBMC的AZD1402序列。AZD1402的刺激表位用红色矩形框标出，并汇总起来创建了一个激活肽池（主要肽池，PPP）。方案显示了AZD1402的3D结构中3个“热点”免疫原性区域的位置。AZD1402不会被泪液脂质运载蛋白衍生的肽激活。上述分析表明，所有能够刺激PBMC的AZD1402衍生肽至少包含一个，通常包含多个氨基酸点突变。为了确认这些点突变是导致观察到的PBMC反应性的原因，进行了实验，将AZD1402刺激肽与天然泪液脂质运载蛋白序列的等效物进行了比较。选择10个AZD1402衍生肽，它们能够刺激4名未接触过该药物的捐赠者的PBMC分泌IFN-γ，而来自泪液脂质运载蛋白序列的相应肽则几乎没有或完全没有分泌作用（图4a）。肽5、23和35都包含多个点突变，并且之前已被证明能刺激很少的细胞因子分泌，因此被用作对照。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

AZD1402衍生肽不会激活T细胞，而泪液脂质运载蛋白衍生的匹配肽也不会。使用未暴露于AZD1402的捐赠者的PBMC进行了IFN-γ ELISpot检测。4名个体的PBMC与刺激性的AZD1402衍生肽或泪液脂质运载蛋白等效物（10μM）在R9培养基中孵育48小时，以R9培养基作为阴性对照。肽23和35含有多个点突变，但显示出低水平的反应性，也被用作额外的对照。

B：从PBMC中去除记忆T细胞会消除PPP特异性IFN-γ的分泌，这是通过ELISpot斑点形成检测到的。来自2名未暴露于AZD1402的捐赠者的PBMC、CD3耗尽的PBMC（上）或CD45RO耗尽的PBMC（下）与PPP的滴定浓度在R9培养基中孵育48小时，以R9培养基作为阴性对照，PHA作为阳性T细胞刺激物。

为了确定观察到的PBMC增殖和IFN-γ分泌的增加是否是T细胞激活的结果，进行了实验，测量了来自CD3+和记忆T细胞耗尽的PBMC群体的PPP特异性IFN-γ分泌。在未接触过AZD1402的个体中，观察到IFN-γ的浓度依赖性分泌。相比之下，用PPP处理的CD3耗尽的PBMC检测到的IFN-γ水平与载体对照孔中的水平相似（图4b）。此外，仅去除记忆T细胞亚群就足以使IFN-γ的分泌恢复到基线对照水平。这些发现清楚地表明记忆T细胞群体是主要的反应细胞类型。

AZD1402和AZD1402肽响应性T细胞克隆的表征：从3名捐赠者（未接触过药物的健康捐赠者HD176，以及没有不良事件的研究参与者E1127和E1143）中生成了T细胞克隆。PBMC暴露于PPP 14天以富集响应性T细胞。使用EBV转化的B细胞作为抗原呈递细胞，并用PPP或AZD1402全蛋白来测试克隆的抗原特异性增殖。从每位参与者中分离出对AZD1402和PPP有响应的T细胞克隆，分别有31个和36个克隆显示出对AZD1402和PPP的增殖反应（刺激指数为2或以上；图5a）。在这些克隆中，超过70%在进一步扩增后以浓度依赖性方式增殖（图5b，20个代表性克隆的浓度-反应特性）。40个克隆中有16个具有交叉反应性，在PPP和AZD1402存在下均能增殖；其余克隆仅由PPP或AZD1402单独激活（图5c，6个代表性克隆）。通过流式细胞术定义了T细胞表型，结果显示所有来自未接触过AZD1402的捐赠者的克隆都是CD4+（数据未显示）。在来自研究参与者的16个克隆中，12个是CD4+，而4个表达CD8（每位参与者2个）。

图5：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

生成和表征对PPP和AZD1402有响应的T细胞克隆：从一名未暴露于AZD1402的捐赠者和研究参与者E1127及E1143中生成了T细胞克隆。PBMC与PPP或AZD1402一起培养以生成T细胞系。然后通过连续稀释和重复有丝分裂扩增来克隆T细胞克隆。T细胞克隆随后与照射过的自体EBV转化B细胞以及AZD1402或PPP一起培养48小时，并加入[3H]胸苷再培养16小时以评估增殖情况。彩色线条表示弱反应（绿色）、中等反应（琥珀色）和强反应（红色深色调）的克隆。所有SI为2或以上的克隆都被进一步扩增以进行表征。

B：用PPP或AZD1402分别刺激的代表性PPP或AZD1402衍生T细胞克隆的浓度依赖性增殖反应。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及PPP或AZD1402的滴定浓度一起培养48小时。

C：代表性T细胞克隆的交叉反应性。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及AZD1402和PPP的滴定浓度一起培养48小时，然后加入[3H]胸苷再培养16小时以评估增殖情况。

D：AZD1402和PPP处理的T细胞克隆分泌的IFN-γ、IL-13和颗粒酶B。克隆与预涂有IFN-γ、IL-13和颗粒酶B的低荧光ELISpot板中的EBV转化B细胞一起孵育48小时，使用R9培养基作为阴性对照。数据以每个孔形成的斑点单位表示，并以Fluorospot图像显示。对于Fluorospot读数，当读取器达到饱和状态（“斑点太多无法计数”）时，记录了一个任意值1000计数。

通过Fluorospot评估了8个选定克隆（4个对PPP有响应和4个对AZD1402有响应）分泌的IFN-γ、IL-13和颗粒酶B的情况。所有暴露于AZD1402或PPP的克隆都分泌了不同水平的IFN-γ和颗粒酶B，无论它们之前是否接触过AZD1402（图5d）。在8个T细胞克隆中有7个分泌了IL-13。

为了研究反应的HLA限制，使用特定抗体在培养过程中阻断了I类和II类MHC分子。MHC II类阻断导致CD4+ T细胞克隆中对PPP和AZD1402的特异性增殖反应消失，而MHC I类阻断几乎没有影响（补充图5）。相比之下，在可测试的单一CD8+克隆中，MHC I类阻断减少了增殖反应，而MHC II类阻断影响很小。IgG同型对照也被包括在检测中，但对PPP或AZD1402依赖的T细胞激活没有影响（数据未显示）。

为了确认赋予分子靶标结合能力的AZD1402中的点突变是否是导致观察到的T细胞反应的原因，使用了9个T细胞克隆进行了实验，比较了AZD1402和AZD1402刺激肽与泪液脂质运载蛋白和天然肽等效物。对AZD1402（n=2）或AZD1402肽P20、P26和P47（n=4）有增殖反应的克隆不会被泪液脂质运载蛋白或相应的泪液脂质运载蛋白衍生肽激活（图6a）。在IFN-γ ELISpot检测中使用了3个对AZD1402和AZD1402肽具有交叉反应性的克隆。发现这些克隆在AZD1402和肽P26或P47存在下分泌IFN-γ，但在泪液脂质运载蛋白或相应的脂质运载蛋白衍生肽存在下则不会（图6b）。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

T细胞克隆用AZD1402和AZD1402衍生肽激活的情况没有在脂质运载蛋白或脂质运载蛋白衍生肽中观察到。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及AZD1402（绿色）或AZD1402衍生肽（蓝色）和脂质运载蛋白等效物（黄色）一起培养48小时。增殖和B IFN-γ分泌被用作T细胞激活的标志物。数据通过双因素ANOVA进行分析，*表示统计显著性P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，**** P<0.0001。

通过评估重叠的AZD1402肽来识别AZD1402 T细胞反应性的关键区域：将个别AZD1402肽与来自AZD1402暴露的参与者（n=11）和未暴露于AZD1402的个体（n=15）的T细胞克隆一起培养，在自体抗原呈递细胞的存在下，以确定AZD1402的关键反应区域表位图（图7a）。来自未暴露捐赠者HD-176的克隆在跨越肽18–28和46–50的2个“热点区域”的肽作用下被激活。来自研究参与者E1143的8个克隆在跨越肽6–10、18–28和42–50的三个热点区域的肽作用下被激活。值得注意的是，与未暴露的捐赠者HD176的克隆结果相比，来自研究参与者E1143的克隆在肽42–50位置被激活的较少。来自研究参与者E1127的3个克隆被扩增到足够的数量以进行表位映射。这些克隆在跨越肽42–50的热点区域的肽作用下被激活（图7b）。AZD1402 T细胞刺激肽的热图（图7c）中，反应性表位的定位与AZD1402的3D结构对齐（图3c）。

图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

AZD1402刺激肽的表征：来自未暴露个体的T细胞克隆（n=15）和AZD1402研究参与者（n=11）与EBV转化的B细胞以及个别AZD1402衍生肽（10μM）一起培养48小时。T细胞克隆随后通过系列稀释和重复有丝分裂扩增。T细胞克隆随后与照射过的自体EBV转化B细胞以及AZD1402或PPP一起培养48小时，并加入[3H]胸苷再培养16小时以评估增殖情况。

B：用PPP或AZD1402分别刺激的代表性T细胞克隆的浓度依赖性增殖反应。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及PPP或AZD1402或PPP的滴定浓度一起培养48小时。

C：代表性T细胞克隆的交叉反应性。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及AZD1402和PPP的滴定浓度一起培养48小时，然后加入[3H]胸苷再培养16小时以评估增殖情况。

D：AZD1402和PPP处理的T细胞克隆分泌的IFN-γ、IL-13和颗粒酶B。克隆与预涂有IFN-γ、IL-13和颗粒酶B的EBV转化B细胞一起在低荧光ELISpot板中孵育48小时，使用R9培养基作为阴性对照。数据以每个孔形成的斑点单位表示，并以Fluorospot图像显示。对于Fluorospot读数，当读取器达到饱和状态（“斑点太多无法计数”）时，记录了一个任意值1000计数。

通过Fluorospot评估了8个选定克隆（4个对PPP有响应和4个对AZD1402有响应）分泌的IFN-γ、IL-13和颗粒酶B的情况。所有暴露于AZD1402或PPP的克隆都分泌了不同水平的IFN-γ和颗粒酶B，无论它们之前是否接触过AZD1402（图5d）。在8个T细胞克隆中有7个分泌了IL-13。

为了研究反应的HLA限制，在培养过程中使用特定抗体阻断了I类和II类MHC分子。MHC II类阻断导致CD4+ T细胞克隆中对PPP和AZD1402的特异性增殖反应消失，而MHC I类阻断几乎没有影响（补充图5）。相比之下，在可测试的单一CD8+克隆中，MHC I类阻断减少了增殖反应，而MHC II类阻断影响很小。IgG同型对照也被包括在检测中，但对PPP或AZD1402依赖的T细胞激活没有影响（数据未显示）。

为了确认AZD1402中的点突变是否负责观察到的T细胞反应，使用了9个T细胞克隆进行了实验，比较了AZD1402和AZD1402刺激肽与泪液脂质运载蛋白和天然肽等效物。对AZD1402（n=2）或AZD1402肽P20、P26和P47（n=4）有增殖反应的克隆不会被泪液脂质运载蛋白或相应的泪液脂质运载蛋白衍生肽激活（图6a）。

图6：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

T细胞克隆用AZD1402和AZD1402衍生肽激活的情况没有在脂质运载蛋白或脂质运载蛋白衍生肽中观察到。T细胞克隆与照射过的EBV转化B细胞以及AZD1402（绿色）或AZD1402衍生肽（蓝色）和脂质运载蛋白等效物（黄色）一起培养48小时。增殖和B IFN-γ分泌被用作T细胞激活的标志物。数据通过双因素ANOVA进行分析，*表示统计显著性P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001，**** P<0.0001。

通过评估重叠的AZD1402肽来识别AZD1402 T细胞反应性的关键区域：将个别AZD1402肽与来自AZD1402暴露的参与者（n=11）和未暴露于AZD1402的个体（n=15）的T细胞克隆一起培养，在自体抗原呈递细胞的存在下，以建立AZD1402的关键反应区域表位图（图7a）。来自未暴露捐赠者HD-176的克隆在跨越肽18–28和46–50的2个“热点区域”的肽作用下被激活。来自研究参与者E1143的8个克隆在跨越肽6–10、18–28和42–50的三个热点区域的肽作用下被激活。值得注意的是，与未暴露的捐赠者HD176的克隆结果相比，来自研究参与者E1143的克隆在肽42–50位置被激活的较少。来自研究参与者E1127的3个克隆被扩增到足够的数量以进行表位映射。这些克隆在跨越肽42–50的热点区域的肽作用下被激活（图7b）。AZD1402 T细胞刺激肽的热图（图7c）中，反应性表位的定位与AZD1402的3D结构对齐（图3c）。

图7：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

AZD1402刺激肽的表征：来自未暴露个体的T细胞克隆（n=15）和AZD1402研究参与者（n=11）与EBV转化的B细胞以及个别AZD1402衍生肽（10μM）一起培养48小时。增殖或B IFN-γ分泌表示T细胞激活。对于ELISpot读数，当读取器达到饱和状态（“斑点太多无法计数”）时，分配了一个任意值250计数。

C：显示来自3名捐赠者的个体克隆的刺激肽的表位图。三个具有广泛点突变的免疫原性热点区域的颜色编码。

讨论：AZD1402是一种基于人类泪液脂质运载蛋白序列的抗脂质运载蛋白制剂，其中包含28个氨基酸点突变，这些突变主要分布在4个环结构（IL4-Rα靶向域）上，以提高靶标选择性和特异性。2019年进行的一项小型AZD1402临床桥接研究观察到，在第三次暴露后（剂量至少间隔5天）的18名试验参与者中有5人出现了各种潜在的AZD1402相关不良事件。在三次暴露后，出现不良事件的试验参与者也检测出对AZD1402的弱阳性ADA。因此，这项分析的目的是调查体外暴露于AZD1402是否能在研究参与者中刺激T细胞回忆反应，如果可以，那么就表征AZD1402响应性T细胞的表型和功能。由于使用生物分子的体外实验往往低估了免疫原性潜力，因此创建并评估了跨越AZD1402结构的重叠肽（间隔2aa），以及制剂辅料和AZD1402全蛋白，在PBMC检测中测量抗原特异性增殖反应和IFN-γ分泌。类似的方法之前已被证明有效用于探索治疗性蛋白（如英夫利昔单抗和利妥昔单抗）的免疫原性（Hamze等人，2017年）。

来自临床研究参与者（无论是否有不良事件）的PBMC对所有5个肽池都显示出反应性，而对全蛋白AZD1402的反应较弱。Luminex分析显示，肽池刺激了高水平Th1细胞因子（例如IFN-γ、TNF-α）和细胞毒性分子（如穿孔素、颗粒酶B）这些热点区域存在于AZD1402的4种环结构中的3种中，每种结构都包含大量氨基酸点突变区域。通过合成和评估泪液脂质运载蛋白中的相应肽段，证实了这些突变对AZD1402诱导T细胞反应性的重要性。从天然泪液脂质运载蛋白序列中提取的相应肽段无法激活T细胞使其增殖或分泌IFN-γ。选择了12种最具刺激性的AZD1402肽段，建立了初步肽池（PPP），并进一步用于生成和表征T细胞克隆。AZD1402和PPP T细胞克隆是从参与AZD1402药代动力学研究的个体中获得的，同时还包括一个未接触AZD1402的供体。在所有三个供体中都检测到了对AZD1402全蛋白和PPP具有增殖反应的CD4+ T细胞克隆。尽管来自供体的克隆在不同AZD1402衍生物肽段的作用下能够增殖并分泌细胞因子，但所有具有反应性的肽段都位于AZD1402蛋白的“热点”区域。供体之间的T细胞表位差异可能与每位参与者表达的HLA等位基因以及肽段与不同MHC II类蛋白的结合有关。正如PBMC实验所显示的那样，使用天然泪液脂质运载蛋白序列衍生的肽段无法诱导T细胞增殖或分泌细胞因子，这证明了AZD1402的特异性反应，并表明所观察到的回忆反应并非针对泪液脂质运载蛋白分子本身。一些T细胞克隆同时对AZD1402和PPP有反应，表明在实验条件下AZD1402的全长分子可以被处理成抗原。然而，其他克隆仅对全蛋白或PPP有高度特异性的反应。这表明：（i）某些对AZD1402有反应的克隆可能被其他AZD1402衍生物肽段激活，这些肽段可能含有不同数量的氨基酸，是通过蛋白质处理产生的；（ii）一些对PPP有反应的克隆可能被非天然产生的肽段激活，或者这些肽段在培养中的抗原呈递细胞中未能以足够数量生成。

在人类蛋白质中引入氨基酸替换可能会产生新的非自身免疫原性表位，这些表位可以被MHC分子呈递并引发新的T细胞反应。另一方面，就像AZD1402的情况一样，新的肽段序列可能与先前遇到的非自身肽段具有足够的相似性，从而激活已存在的记忆T细胞。这种分子模拟的概念最早在20世纪60年代被提出，用于描述病原体与人类细胞表达的肽段之间的相似性（Damian 1965, 1987）。多项研究报告了病原体衍生物肽段与人类细胞表达的肽段之间的序列同源性（Herrath和Oldstone 1996；Johnson和Jiang 2023），这些相似性可以诱导交叉反应性免疫反应。

有趣的是，大约30%的研究参与者对AZD1402产生了不良反应，而其余参与者在服用该分子的所有三个剂量后均未出现临床观察到的不良事件。一种可能性是，在T细胞反应转化为不良事件之前，对AZD1402耐受的参与者可能已经停止了治疗。然而，也有可能是一些参与者由于在药物暴露时具有有利的免疫调节状态而能够耐受AZD1402。存在一个复杂的调节网络，包括Tregs（Benamar等人2023；Georgiev等人2024）、共抑制受体配体相互作用（例如PD-L1、CTLA4）（Ahmadzadeh等人2009；Sakuishi等人2010）和调节性细胞因子（例如IL-10、TGF-β）（Talaat等人2015；Thunberg等人2007），这些因素维持着自然免疫耐受的阈值水平。这种阈值因个体而异，在同一个体的一生中也可能发生变化，尤其是在接触病原体和疾病期间。治疗性蛋白质特异性T细胞通常被认为是体内诱导抗药物抗体（ADAs）的前体（Vaisman-Mentesh等人2020；Jawa等人2020）。然而，治疗性蛋白质特异性T细胞和/或ADAs的存在并不一定会导致临床上显著的不良事件。针对特定生物制剂的耐受性诱导会影响该蛋白质在体内和体外的耐受性。无论是患者特异性的还是由治疗性蛋白质本身引起的耐受机制，都可以减轻效应T细胞反应及其相关的T细胞介导的毒性。这些机制的紊乱可能导致不良事件（Naisbitt等人2020）。这也是为什么HIV感染或囊性纤维化患者更容易出现药物引起的免疫不良事件的一个合理解释（Carr和Cooper 1995；Parmar 2005；Pleasants等人1994）。从免疫肿瘤学领域也可以得到启示，当通过免疫检查点抑制剂疗法阻断共抑制分子信号传导时，伴随用药的免疫相关不良事件发生率会增加（Ford等人2018；Naisbitt等人2020；Hammond等人2022）。考虑到AZD1402以及从内源性蛋白质改造而来的未来分子，如果在长期药物治疗期间免疫环境和调节阈值受到干扰，任何时候都可能发生不良免疫事件。此外，对于针对哮喘和COPD等肺部疾病的吸入性生物制剂，作为标准护理的免疫抑制药物可能会影响明显的免疫激活风险。

AZD1402和阿巴卡韦超敏反应的临床和实验室发现之间存在相似之处。在阿巴卡韦超敏反应中，无论是否接触过该药物，所有表达HLA-B*57:01的个体中都能检测到对药物有反应的T细胞，尽管只有50%的暴露患者出现了不良事件（Bell等人2013；Schnyder等人2013；Adam等人2014；Thomson等人2020）。这些数据清楚地表明，阿巴卡韦对T细胞的激活是关键的分子启动事件；然而，存在对阿巴卡韦有反应的T细胞并不总是会导致临床上显著的不良事件。

总之，AZD1402的结构包含多个位于分子“热点”区域的T细胞表位。而在泪液脂质运载蛋白中并未发现类似的T细胞表位。这些数据描述了与AZD1402相关的潜在免疫原性风险，并提供了一个实用框架，可用于探索潜在治疗性蛋白质的免疫原性。