整合单细胞与批量转录组揭示骨肉瘤中染色体外DNA相关基因的预后与免疫学特征

《Cancer Immunology, Immunotherapy》：Integrating single-cell and bulk transcriptomes to reveal prognostic and immunological features of ecDNA-related genes in osteosarcoma

　　

背景：染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）相关基因在骨肉瘤中的作用在很大程度上尚未被探索。本研究旨在探讨ecDNA相关基因与骨肉瘤预后及肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）之间的关联。 方法：通过对GEO数据集进行差异基因表达分析，以识别骨肉瘤中的ecDNA相关基因。基于批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据，利用101种机器学习算法的集成框架，开发了一种新的ecDNA相关基因预后评分模型（ecDNA-related Gene Prognostic Score Model, EGPSM），并在训练、测试和外部队列中进行了验证。研究人员综合评估了风险评分、预后和TME特征之间的关联。进一步分析了单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据，以阐明EGPSM与骨肉瘤中促肿瘤行为及免疫调节之间的关系，并识别参与肿瘤进展的关键预后基因。最后，研究人员进行了体外和体内实验，以表征MTDH的生物学作用，并阐明其对CD8+T细胞功能的调节效应。 结果：研究人员构建了一个稳健的EGPSM，显示出卓越的预测准确性，最大一致性指数（C-index）为0.803。高危患者表现出较差的生存率、较高的转移潜力以及以CD8+T细胞/NK细胞浸润减少和效应功能受损为特征的“免疫冷”（"immune-cold"）TME。单细胞分析证实，在高危组中，恶性细胞富集，而T/NK细胞群耗竭且效应评分较低。MTDH被确定为一个关键驱动因子；功能实验表明，它能促进增殖和侵袭，同时抑制细胞凋亡。值得注意的是，敲低MTDH可通过增加颗粒酶B（granzyme B）、干扰素-γ（IFN-γ）和穿孔素（perforin）的水平来增强CD8+T细胞的细胞毒性。 结论：新开发的EGPSM是骨肉瘤预后评估和治疗分层的有效工具。MTDH可能成为一个有前景的预后生物标志物和治疗靶点。

研究背景、问题与目的

骨肉瘤是青少年和年轻人中最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有侵袭性强、早期转移、高致残率和预后差的特点。尽管局限性骨肉瘤患者的5年生存率超过78%，但转移性或复发性患者的5年生存率降至25%。传统的放化疗及包括免疫检查点阻断在内的联合免疫疗法疗效有限，骨肉瘤的治疗已进入平台期。结构变异（Structural Variations, SVs）和拷贝数畸变（Copy Number Aberrations, CNAs）是骨肉瘤的主要基因组特征，反映了其广泛的基因组不稳定性和染色体异常。染色体外DNA（extrachromosomal DNA, ecDNA）是一种独特的无着丝粒环状DNA，是基因扩增的重要机制，含有癌基因、增强子和免疫调节基因，在多种癌症类型中与不良预后相关。然而，ecDNA相关基因在骨肉瘤发生发展、预后及肿瘤免疫微环境（Tumor Microenvironment, TME）重塑中的作用尚不明确。因此，深入研究ecDNA在骨肉瘤中的作用，对于揭示其发病机制、寻找新的预后标志物和治疗靶点具有重要意义。本研究旨在通过整合多组学数据和机器学习方法，探索ecDNA相关基因在骨肉瘤预后和免疫微环境中的作用。

关键技术方法概述

本研究采用了整合多组学与机器学习的分析框架。主要技术方法包括：1) 利用GEO和TARGET公共数据库获取骨肉瘤的批量RNA-seq数据集（GSE21257、GSE39055、GSE33382、TARGET-OS）和单细胞RNA-seq数据集（GSE162454，包含6个初治骨肉瘤标本），并进行标准化处理和批次校正。2) 通过差异表达分析和文献交叉，鉴定骨肉瘤中的ecDNA相关差异表达基因。3) 采用包含10种经典算法（如LASSO、RSF、GBM、plsRcox等）的101种机器学习组合，在训练集（GSE21257）上构建ecDNA相关基因预后评分模型（EGPSM），并在内部验证集（GSE33382）和外部独立验证集（GSE39055）中评估其性能。4) 利用CIBERSORT、ssGSEA、ESTIMATE、TIDE等算法进行免疫浸润、肿瘤微环境特征及免疫治疗响应预测分析。5) 对单细胞数据进行质量控制、降维聚类、细胞注释、拟时序分析、细胞通讯分析（CellChat）和虚拟基因敲除分析（scTenifoldKnk）。6) 在体外（143B和U2OS细胞系）和体内（BALB/c小鼠原位骨肉瘤模型）进行功能验证，包括CCK-8、克隆形成、Transwell、凋亡、伤口愈合、T细胞杀伤实验及流式细胞术分析。

研究结果

1. EGPSM的构建与验证

研究人员通过对GSE28424数据集进行差异表达分析，并与已报道的ecDNA相关基因取交集，获得了135个骨肉瘤ecDNA相关差异表达基因。基于101种机器学习组合，构建了EGPSM，其中stepCox[backward]+plsRcox模型在训练集、内部验证集和外部验证集中表现出最高的平均C指数（0.803），显示出卓越的预测稳健性。时间依赖性ROC曲线分析显示，EGPSM在三个数据集中对1年、3年、5年生存率具有高预测效能（AUC最高达0.97）。根据中位风险评分将患者分为高危组和低危组，Kaplan-Meier生存分析显示，高危组患者在各数据集中均表现出显著更差的总体生存率。

2. 独立预后评估与列线图模型构建

单变量和多变量Cox回归分析均证实EGPSM评分和转移状态是骨肉瘤患者预后的独立预测因子。转移患者的EGPSM评分显著更高，且EGPSM可有效预测转移状态。研究人员整合EGPSM评分和临床病理参数构建了列线图模型。该模型的校准曲线与理想对角线高度一致，决策曲线分析表明其具有显著的临床净获益，AUC优于单独使用EGPSM或其他参数，提高了预后预测的准确性。

3. 功能富集分析与免疫浸润分析

对高危组和低危组间的差异表达基因进行功能富集分析，发现高危组富集了与肿瘤进展和免疫调节相关的通路，如线粒体外膜通透性调控、NF-κB转录因子活性正调控、氧化磷酸化、Wnt信号通路等。GSVA分析显示，高危组中DNA修复、MYC靶点V1、G2/M检查点等促癌通路被激活。免疫浸润分析表明，高危组表现出“免疫冷”表型：肿瘤纯度评分更高，而ESTIMATE评分、免疫评分和基质评分更低；多种杀伤性免疫细胞（如活化的B细胞、树突状细胞、肥大细胞、中性粒细胞）的浸润显著减少。低危组中多种免疫检查点分子、MHC分子、趋化因子、细胞因子等免疫调节因子的表达显著上调。TIDE算法预测显示，高危组的TIDE评分、功能障碍评分、排斥评分和癌症相关成纤维细胞（CAF）评分均显著更高，且对免疫检查点抑制剂治疗敏感的患者比例（41%）低于低危组（53%）。此外，高危组具有更高的肿瘤突变负荷（TMB）和瘤内异质性（MATH评分）。药物敏感性分析发现，高危组对包括Cediranib、RO-3306在内的9种化疗药物更敏感。

4. 基于单细胞转录组学的EGPSM分析

对6例骨肉瘤样本的单细胞数据进行分析，鉴定出10个细胞亚群。根据EGPSM相关基因对细胞进行评分并分组。结果显示，高危组中骨肉瘤细胞和破骨细胞比例更高，而T/NK细胞比例降低。拟时序分析表明，随着骨肉瘤细胞分化，高危恶性细胞逐渐富集，EGPSM评分呈进行性升高趋势。此外，高危组细胞表现出更高的拷贝数变异（CNV）负荷。差异表达基因的富集分析再次证实了肿瘤进展和免疫相关通路的改变。代谢分析显示两组间存在不同的代谢特征。这些结果共同表明，EGPSM评分促进了肿瘤细胞的恶性进展，并有助于塑造“冷”的肿瘤微环境。

5. 单细胞RNA测序分析显示EGPSM评分相关的T细胞具有不同特征

对T/NK细胞进行亚群细分，发现高危组中细胞毒性CD8（CD8_Cyt）和NK细胞比例减少，而初始CD4（CD4_Nai）细胞比例增加。功能状态评分分析显示，高危组的T细胞抑制性和初始样特征增强，而活化、共刺激和细胞毒性特征减弱。CellChat细胞通讯分析发现，骨肉瘤细胞与CD8_Cyt和CD4_Nai细胞之间存在强烈的相互作用，且这种作用在高危组中更强。差异信号通路分析显示，高危组中TIGIT通路显著富集，这为免疫排斥提供了机制解释：肿瘤细胞利用TIGIT介导的抑制性信号早期拦截和抑制T细胞，从而阻止其有效浸润。

6. MTDH促进骨肉瘤的肿瘤进展

单细胞数据分析发现，MTDH、XRCC6和ULBP2在骨肉瘤细胞中特异性高表达，其中MTDH的表达最高且特异性最强。批量数据验证表明，MTDH在骨肉瘤组织中过表达，且高表达与不良预后相关。qRT-PCR检测发现，在骨肉瘤细胞系中MTDH和MYC的拷贝数异常升高。体外功能实验证实，敲低MTDH可显著抑制143B和U2OS细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力，并促进细胞凋亡；而过表达MTDH则产生相反的效应。这些结果表明MTDH促进了骨肉瘤的恶性进展。

7. 破坏MTDH可增强CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫

对单细胞数据进行MTDH虚拟敲除分析，其下游差异调控基因的富集分析显示，T细胞受体信号通路、T细胞活化与增殖、Fc-γ受体信号通路及干扰素-γ反应通路等免疫激活相关通路被激活。体外T细胞杀伤实验表明，与MTDH敲低的肿瘤细胞共培养后，CD8⁺T细胞对肿瘤的杀伤作用显著增强，且其颗粒酶B、IFN-γ和穿孔素的表达水平升高；而过表达MTDH则削弱了CD8⁺T细胞的杀伤功能和细胞因子产生。体内小鼠原位成瘤实验进一步证实，与对照组相比，MTDH敲低组的肿瘤负荷显著减轻，肿瘤内CD8⁺T细胞浸润增加，且这些T细胞中颗粒酶B⁺、IFN-γ⁺和穿孔素⁺细胞的比例显著升高。这些结果说明MTDH通过抑制CD8⁺T细胞功能，削弱了抗肿瘤免疫力，从而促进了骨肉瘤的生长。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出骨肉瘤预后差，传统疗法效果有限，其基因组高度不稳定，而ecDNA是癌基因扩增和肿瘤进化的重要驱动因素，但其在骨肉瘤中的作用尚不明确。本研究构建的EGPSM模型具有良好的区分和校准能力，能有效预测骨肉瘤患者的预后和免疫治疗反应。研究发现，高危患者呈现“免疫冷”的肿瘤微环境特征，包括免疫细胞浸润减少、抗原呈递减弱和T细胞功能抑制，这与ecDNA在其它癌种中促进免疫逃逸的报道一致。研究人员鉴定出MTDH是骨肉瘤中关键的促癌基因，其高表达与不良预后相关。功能实验证明MTDH不仅直接促进肿瘤细胞的增殖、侵袭并抑制凋亡，还能通过抑制CD8⁺T细胞的细胞毒性功能来塑造免疫抑制微环境。这提示靶向MTDH可能成为骨肉瘤治疗的新策略。本研究首次系统地揭示了ecDNA相关基因在骨肉瘤预后和免疫微环境中的作用，为骨肉瘤的预后分层、免疫治疗疗效预测及联合治疗靶点开发提供了新的见解和潜在工具。

研究结论（翻译自原文）

新开发的EGPSM代表了骨肉瘤预后评估和治疗分层的有效工具。MTDH可能成为一个有前景的预后生物标志物和治疗靶点。