《Translational Stroke Research》：Characterizing Infiltrating Macrophages in Intracranial Aneurysm with IA Animal Models and Spatial Transcriptomics
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颅内动脉瘤（Intracranial Aneurysm, IA）在普通人群中的患病率可高达3%。大多数IA无症状，为偶然发现。然而，IA可引起蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH），导致高死亡率和高致残率。目前尚无有效的药物
颅内动脉瘤（Intracranial Aneurysm, IA）在普通人群中的患病率可高达3%。大多数IA无症状，为偶然发现。然而，IA可引起蛛网膜下腔出血（Subarachnoid Hemorrhage, SAH），导致高死亡率和高致残率。目前尚无有效的药物疗法来控制IA并降低SAH风险。因此，理解IA的病理生理学以识别潜在治疗靶点是一项重要的临床目标。IA通常形成于动脉分叉处，并以巨噬细胞浸润为特征。巨噬细胞是先天性免疫细胞，可向适应性免疫细胞呈递抗原并促进炎症。当抑制巨噬细胞募集可遏制动脉瘤形成或生长时，即证明了巨噬细胞在IA中的潜在作用。空间转录组学的最新进展使得在动脉瘤病变内研究浸润性巨噬细胞，并识别以往难以探测的致病性变化成为可能。虽然样本的可及性可能限制空间转录组学的应用，但审慎地使用IA动物模型将有助于进行转化研究，以解决未满足的临床需求。借助空间视角和精制的动物模型，研究人员可以识别浸润性巨噬细胞的关键特征，包括其个体发生、转录组谱以及与其他细胞亚群的相互作用。本文综述总结了目前对IA中浸润性巨噬细胞的理解，并介绍了用于研究巨噬细胞浸润的可用IA动物模型和空间转录组学方法。
引言
颅内动脉瘤是脑血管的局限性扩张，在普通人群中患病率可达3%。破裂的IA导致SAH，与高死亡率和致残率相关。目前尚无批准的药物疗法来预防IA的发展或进展，手术或血管内介入治疗存在不可忽视的风险，因此存在明确的、未被满足的有效药物治疗临床需求。理解IA的免疫学机制可加速药物疗法的开发。非生理性血流动力、低壁剪切力和被破坏的层流被认为促进了IA的病理生理学。在后期阶段，动脉壁因血流动力而变薄扩张，并伴有免疫细胞浸润。巨噬细胞构成了免疫细胞浸润的主体，抑制巨噬细胞浸润在动物研究中也被证明可减少IA的生长和破裂。然而，巨噬细胞浸润与IA之间的因果关系仍不清楚，需进一步研究。免疫系统由异质性细胞群组成，探查特定细胞亚群对病理的贡献具有挑战性。空间转录组学可将RNA表达模式映射到组织结构上，从而发现先前未被识别的结构，并深入理解免疫细胞的空间分布和活动谱。在IA中，可对浸润性巨噬细胞进行空间转录组学分析，揭示它们在内膜、中膜和外膜以及邻近的脑组织或颅外淋巴结构中的存在。与单细胞转录组学不同，空间转录组学可以确定位于内膜和外膜的浸润性巨噬细胞是否具有相似的转录组谱，提供难以单独通过单细胞转录组学获得的见解。使用空间转录组学研究IA中浸润性巨噬细胞的一个关键障碍是高质量人类样本的可用性有限，需要合作收集足够样本。已建立的动物模型将缓解部分困难。研究IA的临床病程将取决于动脉瘤大小、位置、形态、风险因素以及年龄或性别等人口统计学信息。动脉分叉处的IA暴露于独特的血流动力应激，这可能通过机械转导改变转录组模式。女性性别是一个风险因素，动脉瘤常在绝经后女性中破裂；其性别二态性、性激素及其对IA病理的潜在影响值得深入研究。
The Anatomy of IA (IA的解剖学)
IA可根据形态学分为囊状或非囊状（梭形、夹层等）。囊状和非囊状动脉瘤在生长和破裂风险上存在差异。本文综述将仅关注囊状IA。大多数IA形成于Willis环。构成Willis环的脑动脉包括大脑前动脉、前交通动脉、大脑中动脉、颈内动脉、大脑后动脉、后交通动脉和基底动脉尖端。大脑前动脉、前交通动脉和颈内动脉组成前循环。后循环包括大脑后动脉、基底动脉和椎动脉。大多数IA见于前循环，但IA可形成于颅内的任何位置。
颅内动脉在结构上不同于外周动脉，尽管有相似之处。脑动脉的中膜较薄，且缺乏外弹性膜，使其更易受血流动力应激影响。此外，脑动脉通常缺乏滋养血管，并在病理条件下（如IA）发育形成。在IA中，巨噬细胞广泛浸润脑动脉，存在于内膜、中膜和外膜。虽然浸润性巨噬细胞的确切来源尚不清楚，但它们可能部分通过滋养血管募集并穿过内皮屏障。除了脑动脉结构和免疫细胞浸润，动脉分叉也促进IA的发病机制。脉动性血流动力应激可冲击动脉分叉处的内皮。机械应激可触发免疫反应是已知的。考虑到IA进展所需的时间，动脉瘤形成可能涉及慢性炎症；血流动力介导的免疫反应是这种炎症的一个可能来源。有几个已确立的风险因素与IA形成相关，例如吸烟、年龄较大（>50岁）、女性性别、常染色体显性多囊肾病等遗传性疾病以及高血压。女性性别对腹主动脉瘤是保护因素，但对IA是风险因素。虽然2型糖尿病是动脉粥样硬化和其他血管疾病的风险因素，但可能是IA的保护因素，可能提示动脉粥样硬化和IA之间存在异质性机制。每个临床风险因素如何转化为更高的IA发病率和随时间推移的生长仍有待确定。
Infiltrating Macrophages in IAs (IA中的浸润性巨噬细胞)
大多数浸润性巨噬细胞来源于循环单核细胞。发生炎症时，单核细胞被动员并粘附于血管内皮，随后浸润血管并分化为巨噬细胞。浸润性巨噬细胞可释放炎性细胞因子，包括TNF-α、IL-6和IL-1β。除了释放炎性细胞因子，巨噬细胞还可通过分泌蛋白酶（包括基质金属蛋白酶，MMPs）促进血管壁降解。在IA背景下，MMP-2和MMP-9被认为在疾病发展中尤为显著。病理学调查揭示了IA中显著的补体沉积，补体系统是浸润性巨噬细胞可能促进IA发病的另一途径。作为抗原呈递细胞，分化的巨噬细胞还可摄取抗原并将其呈递给适应性免疫细胞（如T细胞）。活化的T细胞反过来可刺激巨噬细胞，增加其寿命和炎症潜能。当单核细胞在炎症期间被募集并分化为单核细胞来源的巨噬细胞时，这些细胞可构成组织驻留巨噬细胞群的很大一部分。另一方面，也存在MDM募集很少发生的器官。封闭器官（如大脑）中的组织驻留巨噬细胞来源于胚胎和胎肝巨噬细胞，并通过自我更新持续存在。巨噬细胞来源的小胶质细胞以及边界相关巨噬细胞通过自我扩增填充脑实质、脑膜和脉络丛。鉴于IA邻近大脑，当IA充分扩大时，BAMs可能存在于动脉瘤病变处。另一方面，由于解剖限制（如脑脊液间隙），BAMs向IA部位的募集可能有限，浸润性巨噬细胞可能主要是MDMs。研究浸润性巨噬细胞与BAMs的个体发生相似性将有助于确定浸润是BAMs还是MDMs募集的结果，为未来治疗开发提供额外见解。
巨噬细胞可经典地分为M1和M2巨噬细胞。然而，值得注意的是，M1/M2二分法现在被认为是过于简单化的。巨噬细胞状态，如M1或M2，最好描述为连续体上的特定状态。因此，虽然本综述使用经典M1样和M2样巨噬细胞等术语，但提请读者注意这些术语的局限性；此后，我们将其简化为M1样和M2样。此外，在IA研究领域，巨噬细胞状态的表征仅限于M1样和M2样状态。在这方面，空间转录组学可为IA中的巨噬细胞状态提供新见解。M1样巨噬细胞是促炎的，而M2样巨噬细胞抑制炎症并促进组织修复。尽管报告不一致，但有报道称M2样巨噬细胞在破裂动脉瘤中比M1样更常见，而未破裂IA中则相反。虽然巨噬细胞表型与动脉瘤破裂之间的关系尚不清楚，但巨噬细胞的表型变化可能与破裂密切相关。然而，表1中描述的巨噬细胞表型研究存在技术限制（例如，依赖有限的标记物，如HLA-DR用于M1样，抗CD163用于M2样）。空间转录组学可以更有效地通过更全面的空间转录组特征识别与动脉瘤破裂相关的特定巨噬细胞状态。
浸润性巨噬细胞可通过促进单核细胞来源的树突状细胞的生成来促进IA发病。考虑到IA发病的慢性特性，病理可能涉及先天和适应性免疫反应，例如特定的CD4+T辅助细胞轴。鉴于DCs作为专业APCs的能力，Mo-DCs可能作为IA背景下先天免疫和适应性免疫之间的联系。浸润性巨噬细胞与免疫细胞的相互作用将取决于位置、环境特征和系统状况（如感染）。在IA背景下，浸润性巨噬细胞不可避免地与中性粒细胞接近，中性粒细胞是早期炎症期间动员的细胞。无论募集顺序如何，巨噬细胞与中性粒细胞的相互作用可能影响巨噬细胞的活性，其具有高度可塑性。除了中性粒细胞，巨噬细胞或单核细胞必须与血管内皮细胞相互作用才能成功浸润颅内动脉。虽然血管腔主要由内皮细胞组成，但肌成纤维细胞或成纤维细胞可能存在于血管结构中，特别是在外膜，并可能促进疾病进展。
T和B淋巴细胞在IA病理中也具有相关性。鉴于IA发病的慢性性质，适应性免疫系统很可能参与IA的生长和破裂。巨噬细胞和Mo-DCs可迁移至次级淋巴器官，在那里它们作为APCs并激活针对IA病变处存在的自身或外来抗原的特异性T淋巴细胞。然后T淋巴细胞可迁移至IA部位或在生发中心激活B淋巴细胞。或者，由系统原因触发的适应性免疫反应可能间接促进IA或SAH，如感染的情况。微生物组失调也可导致免疫介导的炎症。研究报告显示，IA患者中牙龈炎和牙周炎的患病率高于对照组，表明IA患者口腔微生物群失调。该研究还发现，IA患者血清中抗牙龈卟啉单胞菌和伴放线聚集杆菌的IgA滴度显著更高，IgG滴度更低。此外，一项针对未破裂和破裂IA患者的肠道微生物组研究发现，色氨酸代谢物数据可以高精度地区分破裂与未破裂IA。鉴于CNS体液免疫的构成依赖于肠道微生物组，需要进一步研究以阐明微生物群在IA发病机制中的作用。
Sexual Dimorphism (性别二态性)
与其他细胞一样，浸润性巨噬细胞表现出性别二态性。考虑到女性性别是一个已证实的风险因素，研究性别二态性对浸润性巨噬细胞及其与IA病理的联系的影响至关重要。事实上，巨噬细胞与多种女性生殖疾病有关。此外，免疫系统的性别二态性已被广泛且一致地报道。鉴于免疫系统的异质性，IA中的浸润性巨噬细胞可能表现出独特的性别二态性。在研究其他解剖部位和其他细胞群的性别二态性时需要谨慎解释，但仍可获得见解。还应注意，动脉瘤在绝经后女性中破裂更频繁，这意味着雌激素耗竭导致动脉瘤恶化。雌二醇（一种活性形式的雌激素）据报道可在体外促进M2极化，并增加IL-10分泌，从而减轻炎症。雌二醇也被报道可调节大脑中小胶质细胞的活性。动物模型适合通过卵巢切除术或激素替代疗法等操作来研究IA的性别二态性。完善的模型将缓解获取患者样本的困难，并填补转化研究中的空白。
Mechanotransduction (机械转导)
物理刺激长期以来被认为是免疫反应的来源。免疫细胞配备有传感器，包括TRPV4和Piezo1，并且可以在不同压力下对相同刺激做出不同反应。类似地，组织或器官的物理刺激可以激活先天免疫细胞并诱导炎性细胞因子的释放。这种影响可能是直接的或间接的。例如，Piezo1+肠神经元可以响应机械力间接调节肠道免疫反应。此外，外部压力可以影响内皮细胞与循环免疫细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）之间的相互作用。因此，更多的免疫细胞可以渗出或浸润血管，而内皮细胞受到外部压力。对内皮细胞的最新研究表明，细胞和线粒体膜可能会因层流破坏引起的剪切应力而改变。鉴于内皮细胞可以作为APCs，血流动力介导的膜变化可能通过调节人类表面MHC表达影响其APC功能。
动脉分叉处的血流动力使浸润性巨噬细胞及其邻近细胞暴露于湍流。事实上，大多数IA发生在动脉分叉处，那里层流可能被破坏，内皮细胞暴露于剪切应力。虽然尚不清楚血流动力是直接还是间接调节IA发病，但考虑时间效应是可取的，因为细胞在不同时间点可能受到不同影响。直接研究机械转导对IA发病的贡献可能具有挑战性。然而，研究年龄相关血管硬化（整个生命周期）或短期时间效应（例如，昼夜节律）的更广泛研究领域可能为机械生物学对早期与晚期IA的贡献提供间接线索。理解血流动力转化为IA的机制可为治疗药物的开发和预测难以在低风险IA中检测到的高风险IA提供新的见解。
IA Animal Models (IA动物模型)
自Hashimoto引入经典的IA大鼠模型以来，已开发了许多改进和变体用于IA转化研究。虽然猪和灵长类等大型动物可用于空间转录组学研究，但处理、相关成本和伦理考虑可能成为限制因素。本文综述将聚焦于Hashimoto啮齿动物模型，并简要讨论Hassler兔模型。大多数开发经验是通过两种Hashimoto大鼠和小鼠模型获得的。大鼠模型的动脉瘤诱导步骤包括颈总动脉结扎以改变Willis环的血流模式、β-氨基丙腈等赖氨酰氧化酶抑制剂以干扰胶原和弹性纤维交联、高盐饮食（通常伴随肾动脉结扎）以及脱氧皮质酮醋酸酯以增加血容量并诱发高血压。原始IA大鼠模型报告动脉瘤诱导率为37%，需要11-21周。随后对模型的改进导致更高的诱导率和更短的动脉瘤发展时间。大鼠模型密切复制人类病理，可靠，广泛应用，并已在文献中报道。
Hashimoto小鼠模型涉及与大鼠模型相似的诱导步骤，例如颈总动脉结扎、高盐饮食（有时伴随肾动脉结扎）和血管紧张素II给药。然而，小鼠模型利用弹性蛋白酶注射到脑脊液间隙以削弱Willis环中的血管。原始模型报告诱导率高达60%至80%。小鼠模型还具有诱导期短的优点，仅需两到三周即可完全诱导动脉瘤。其他优势包括基因修饰的广泛可用性：整合特定的基因修饰将花费更少的时间。然而，小鼠模型产生的样本尺寸较小，可能限制其在利用空间转录组学研究某些问题时的效用。鉴于空间转录组学的相关成本，建议制作组织微阵列以同时研究多个样本。
所述啮齿动物模型的一个重要限制是它们使用BAPN或弹性蛋白酶来削弱血管以诱导动脉瘤。在这方面，这些模型偏离了更慢性、渐进的IA发病机制，可能没有完全复现人类IA的病理生理学，特别是免疫环境。然而，这些应用密切模拟人类病理：细胞外基质的退行性变化、内弹性膜的破坏和胶原纤维降解被有力地观察到。此外，此类应用显著促进了IA动物动脉瘤的诱导和生长，从而缩短了观察期并提高了可重复性。最后，大鼠和小鼠模型均报告卵巢切除术后破裂率更高，而激素替代后破裂率降低，复制了女性在50岁后破裂率升高的情况。
