《npj Dementia》：Alzheimer’s disease DNA methylation index (AD-DMI) and its association with late-life cognitive function
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阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）由遗传和表观遗传因素共同驱动。目前，在应用DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）捕捉AD特异性信号方面仍存在知识缺口。研究人员开发了AD DNA甲基化指数（AD DNA Meth
阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）由遗传和表观遗传因素共同驱动。目前，在应用DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）捕捉AD特异性信号方面仍存在知识缺口。研究人员开发了AD DNA甲基化指数（AD DNA Methylation Index, AD-DMI），这是一个基于大脑来源的风险指数，由弹性网络逻辑回归（elastic-net logistic regression）从尸检背外侧前额叶皮层（postmortem dorsolateral prefrontal cortex）组织的甲基化数据中识别出的100个CpG位点构建而成。研究在722名老年人（包括认知正常、轻度认知障碍和AD个体）中评估了AD-DMI。使用广义线性模型、逻辑回归和路径分析（path analyses）测试了AD相关关联，并进行了相应的协变量调整。更高的AD-DMI得分与更低的整体认知功能、更大的整体AD神经病理负担以及更高的主观记忆主诉（subjective memory complaints）几率相关。AD-DMI可独立于认知和病理状态，预测贯穿整个疾病谱的临床诊断。与皮质时钟（Cortical clock）相比，AD-DMI在认知和病理结局方面显示出更强、更特异的关联。映射到AD-DMI CpG位点的基因与AD全基因组关联研究（genome-wide association studies, GWAS）中识别出的8个基因位点（包括RELN、LRP1B和PDE9A）重叠。AD-DMI与APOE、HOXA3和ANK1中CpG位点的甲基化增加显著相关。AD-DMI为连接疾病相关的甲基化变化与AD的认知和病理结局提供了一个基于生物学的框架。
阿尔茨海默病DNA甲基化指数（AD-DMI）的构建及其在认知与神经病理学中的关联研究解读
一、 研究背景、问题与目的
晚发型阿尔茨海默病（Late-onset Alzheimer's disease, LOAD）是导致痴呆的主要病因，也是最普遍的神经退行性疾病，其发病率预计将随人口老龄化而上升。该病由遗传、环境和生活方式等多种复杂因素共同驱动，给个人、家庭和医疗系统带来了沉重的社会经济负担。尽管在AD生物标志物的鉴定方面取得了显著进展，但早期检测和风险分层仍是主要挑战。
DNA甲基化（DNAm）作为一种重要的表观遗传修饰，已成为衰老和包括认知衰退、痴呆在内的年龄相关疾病的有前景的生物标志物。基于DNAm的生物标志物，通常被称为表观遗传时钟（epigenetic clocks），已被证明能够预测多种组织和疾病状态下的生物年龄。然而，大多数现有的DNAm时钟是为了估算实际年龄和生物衰老速度而开发的，而非疾病风险，这限制了它们预测特定疾病（如AD）发生和进展的能力。越来越多的证据表明，表观遗传修饰，特别是DNAm，可能在AD发病机制中发挥作用，而不仅仅是反映与衰老相关的变化。DNAm改变已在与神经炎症、突触功能和线粒体调节相关的基因中被发现，这些都是AD中已知失调的关键生物通路。这些发现凸显了DNAm作为一种工具，在识别AD风险个体方面，以及作为淀粉样蛋白、tau蛋白和神经影像学等现有生物标志物的补充方面的潜力。
尽管支持DNAm在AD中作用的证据不断增多，但目前尚未有专门开发的DNAm生物标志物能够反映AD状态、病理负担或认知衰退。为了填补这一空白，本研究引入了阿尔茨海默病DNA甲基化指数（AD-DMI），这是一种从尸检脑组织中衍生的新型表观遗传风险指数，旨在捕捉与认知障碍和AD病理相关的疾病特异性表观遗传变异。研究人员假设，基于脑组织甲基化谱开发的AD-DMI能够捕捉具有生物学意义的表观遗传变异，并且比反映大脑普遍衰老的表观遗传指标（如皮质时钟）更能强烈地反映AD相关的认知和病理结局。这项研究发表在《npj Dementia》期刊上。
二、 主要技术方法概览
本研究采用了多步骤的分析框架。研究样本来自宗教秩序研究（Religious Orders Study, ROS）和记忆与衰老项目（Memory and Aging Project, MAP）（合称ROSMAP）队列的722名参与者，该队列提供了生前详细的纵向临床、认知评估数据以及死后的神经病理学数据和脑组织样本。AD-DMI的构建是核心步骤：研究人员利用来自背外侧前额叶皮层的DNAm数据（通过Illumina 450K芯片检测），采用弹性网络逻辑回归（一种监督机器学习方法）在AD患者与认知正常对照者中识别出100个最能区分AD状态的CpG位点，并基于此计算加权和未加权的AD-DMI得分。随后，研究通过一系列统计分析评估了AD-DMI的效用，包括：1）使用t检验、方差分析和相关性分析检验AD-DMI在人口统计学、临床和神经病理学因素中的变异；2）运用广义线性模型（Generalized linear models, GLMs）和逻辑回归评估AD-DMI对认知功能、神经病理负担、临床诊断和主观记忆主诉的预测能力；3）采用路径分析模型探讨AD-DMI影响认知和病理结局的可能中介路径（如通过特定认知域或Braak分期、CERAD评分）；4）将AD-DMI与已有的脑组织表观遗传时钟——“皮质时钟”进行性能比较；5）对构成AD-DMI的CpG位点进行基因组特征、功能富集分析和遗传重叠分析，并检验其与已知AD相关基因（如APOE、ANK1）甲基化的关联，以评估其生物学相关性。
三、 研究结果
1. 阿尔茨海默病DNA甲基化指数（AD-DMI）的构建
AD-DMI通过应用于背外侧前额叶皮层组织DNAm数据的弹性网络逻辑回归构建而成。该模型筛选出100个CpG位点，基于这些位点的甲基化水平计算加权和未加权两种形式的AD-DMI得分。研究流程通过示意图清晰展示。
2. AD-DMI在人口统计学、临床及神经病理因素中的变异
AD-DMI在多种因素中存在显著差异。女性AD-DMI得分高于男性，APOE ε4携带者显著高于非携带者。报告有主观记忆主诉的个体AD-DMI水平也更高。AD-DMI在认知诊断组（NC、MCI、AD）中呈递增趋势，在AD组达到峰值，且与CERAD评分和Braak分期呈正相关，表明更高的神经病理负担对应更高的AD-DMI水平。双变量相关分析进一步证实，更高的AD-DMI得分与更低的五个认知域及整体认知功能显著相关，并与皮质时钟、死亡年龄呈正相关。
3. AD-DMI预测死亡前的整体认知功能
在调整了协变量的广义线性模型中，较高的AD-DMI是较低整体认知功能的显著预测因子。当与皮质时钟共同纳入模型时，AD-DMI的预测作用仍然显著，而皮质时钟的作用不再显著，模型比较也支持AD-DMI是更强的预测指标。路径分析表明，AD-DMI对整体认知功能的影响主要通过其对五个核心认知域（情景记忆、语义记忆、知觉速度、视觉空间能力和工作记忆）的影响所介导。
4. AD-DMI预测整体AD病理负担
AD-DMI同样与更高的整体AD病理（Gpath）负担显著相关。在包含皮质时钟的模型中，AD-DMI的关联性保持显著，而皮质时钟的关联性被削弱。路径分析显示，AD-DMI对Gpath的影响分别由Braak分期和CERAD评分部分介导，表明AD-DMI可能通过影响这些既定的神经病理学标记物来影响整体病理负担。
5. AD-DMI预测认知诊断
有序逻辑回归分析表明，更高的AD-DMI得分与更严重的临床诊断（从NC到MCI到AD）几率增加显著相关，且该关联独立于整体认知功能和神经病理负担。相比之下，皮质时钟在模型中显示出负向关联。接受者操作特征曲线（ROC）分析进一步显示，AD-DMI在区分不同诊断组（特别是AD vs. NC, AD vs. MCI）方面比皮质时钟具有更高的曲线下面积（AUC），表现出更好的判别能力。路径模型支持AD-DMI对诊断的影响部分由整体病理和认知功能介导。
6. AD-DMI与主观记忆主诉的关联
逻辑回归分析发现，在调整协变量后，AD-DMI与报告主观记忆主诉的几率增加显著相关，而皮质时钟则无此关联，这表明AD-DMI可能作为晚年主观认知担忧的潜在标志物。
7. AD-DMI CpG位点的基因组与调控特征
对构成AD-DMI的100个CpG位点的分析显示，它们在基因组中分布广泛，在1、3、12和19号染色体上富集，其中19号染色体包含APOE基因。从功能区域看，这些CpG位点分布在基因间区、基因体、启动子区（TSS1500, TSS200）、非翻译区（UTR）等多种区域。从CpG岛特征看，近半数位于开放海（OpenSea）区域，部分位于CpG岛、岸（shore）和架（shelf）区域。有相当比例的位点位于增强子、DNase I超敏感位点（DHS）和启动子相关区域，提示它们可能参与转录调控。功能富集分析（GO和KEGG）虽未产生经多重检验校正的显著条目，但排名靠前的条目涉及突触翻译、细胞凋亡、脂肪酸代谢、阿尔茨海默病和自噬等与AD病理相关的生物过程和通路。
8. AD-DMI与GWAS识别的AD基因的遗传重叠
映射到AD-DMI CpG位点的基因中，有八个（RPTOR, PDE9A, LRP1B, LRIG1, CACNA2D3, RELN, SLC2A13, RCN2）与既往AD全基因组关联研究（GWAS）发现的基因位点重叠，特别是RELN, LRP1B和PDE9A涉及神经退行性过程、突触可塑性和淀粉样蛋白代谢，这提示AD-DMI捕捉了与AD易感性相关的已知基因位点的表观遗传变异。
9. AD-DMI与EWAS识别的AD相关CpG位点甲基化的关联
线性回归分析显示，较高的AD-DMI得分与APOE、ANK1和HOXA3基因中特定CpG位点的甲基化水平增加显著相关。这些位点在之前的表观基因组关联研究（EWAS）中被发现于AD病例中呈现高甲基化。这一发现进一步强化了AD-DMI作为AD相关表观遗传改变指标的生物学相关性。
四、 讨论与结论
本研究的核心是开发并验证了AD-DMI，这是一个基于脑组织、旨在区分AD与认知正常对照的新型表观遗传风险指数。研究发现，AD-DMI与较低的认知功能、较大的神经病理负担、更高的主观记忆主诉几率以及更严重的临床诊断显著相关。路径分析揭示了其影响认知和诊断的可能中介路径。重要的是，与广泛使用的脑老化表观遗传标志物“皮质时钟”相比，AD-DMI在预测AD相关的认知和病理结局方面表现出更强、更特异的关联性和判别能力，表明其捕捉的是疾病特异性的表观遗传变异，而非普遍的衰老信号。研究还发现AD-DMI在女性、APOE ε4携带者中更高，与其作为AD风险因素的角色一致。
对AD-DMI CpG位点的生物学特征分析为其相关性提供了支持。这些位点富集于与AD风险相关的染色体区域（如19号染色体上的APOE），并位于增强子、启动子等调控区域。它们所映射的基因与AD GWAS发现的基因存在重叠，且AD-DMI得分与APOE、ANK1、HOXA3等已知AD相关基因的甲基化变化相关联。这些发现共同表明AD-DMI反映了与AD发病机制相关的、具有生物学意义的表观遗传调控变异。
研究结论：
AD-DMI是一个有前景的、基于脑组织的表观遗传风险指数。它与认知功能、AD病理学和临床诊断密切相关，并且在区分AD相关结局方面优于通用的脑老化表观遗传指标。AD-DMI捕获了位于已知AD风险基因和调控区域的表观遗传变异，为其生物学相关性提供了支持。尽管需要在纵向研究和外周组织中进行进一步验证，但AD-DMI代表了向开发针对AD的疾病特异性表观遗传风险指数迈出的重要一步。未来的研究整合多组学方法、多样本人群和功能验证，对于将AD-DMI转化为用于AD风险评估和早期干预的临床信息工具至关重要。
