Nature发布新技术，可实现11 kb大片段的精准插入

　　

大片段DNA的靶向插入在基因组工程和基因治疗领域拥有广阔前景。此前的twin prime editing技术虽能实现较大片段的插入，但对于超过400 bp的片段，插入效率仍然很低。

近日，马萨诸塞大学医学院的研究人员开发出一种名为prime assembly的新技术，能够在哺乳动物细胞中插入多达11 kb的DNA片段。这种方法避免了基因治疗领域的一个瓶颈——供体DNA的双链断裂，这种断裂可能产生毒性并杀死细胞。

这项研究成果于4月29日发表在《Nature》杂志上，有望将基因治疗从消除致病突变扩展到替换整个基因。

第一作者兼共同通讯作者、马萨诸塞大学医学院的Bin Liu称：“利用这种方法，我们是在进行基因组组装，而不是对基因进行小规模编辑。如果将基因组想象成一本书，我们可以删除一段文字，然后用新的段落替换它，甚至可以重写一章。”

Bin Liu认为，这种区别很重要：有些疾病涉及到数百个突变，因此在进行基因治疗时需要数百次基因编辑，而每次编辑都需要获得联邦政府的批准。

“这项技术最大的影响在于我们可以一次性纠正1,000个异质性的突变，” 他说。

在这项使用哺乳动物细胞的研究中，研究人员表明，prime assembly技术能够有效插入100 bp至11 kb的DNA片段，而其他方法最多只能成功插入约800 bp。

“我们试图达到这项技术的上限，看看我们能插入多大的片段，” Bin Liu谈到。“我们的设想是利用这种方法建立一个通用平台，将健康的基因拷贝直接植入患者体内，无论他们携带了何种基因突变。”

prime assembly技术的创新之处在于利用了twin prime editing（twinPE）方法在目标DNA上生成的flap片段，将DNA插入基因组。供体DNA的末端与这些flap片段互补，避免了双链断裂。

Bin Liu表示，这种插入确实会诱发单链DNA断裂，但与双链断裂相比，单链断裂对细胞的毒性更小。

他认为，在哺乳动物细胞培养物中对插入效率进行评估证明了prime assembly方法的前景。

这些编辑步骤消除了对同源定向修复（HDR）机制的依赖，而这种修复机制一直是基因编辑中的关键部分。通过排除这一修复步骤，prime assembly技术可以整合单链和双链DNA供体，并用于神经元和心肌细胞等非分裂细胞的治疗。

“以往依赖同源定向修复的应用在细胞中效果良好，但在动物模型中，其效率往往很低，” Bin Liu指出。“这也是prime assembly技术拥有巨大优势的原因。”

研究团队之所以将这项技术命名为“prime assembly”，是为了致敬经典的实验室技术“Gibson assembly”，这种分子克隆技术实现了DNA的无缝连接。

研究人员表示，未来还有许多工作要做，包括确定递送供体DNA片段和编辑器的最佳载体——很可能是脂质纳米颗粒或腺相关病毒。此外，他们将与合作者一起测试体内编辑的有效性。