氮代谢谱分析揭示细胞状态特异性的嘧啶合成途径选择

《Nature Metabolism》：Nitrogen metabolism profiling reveals cell state-specific pyrimidine synthesis pathway choice

　　

研究人员开发了一个能够在30种氮稳定同位素标记的代谢物中进行平行示踪的平台，以对细胞氮代谢进行系统水平的理解。该平台揭示，虽然原始细胞（primitive cells）同时利用从头合成（de novo）和补救合成（salvage）嘧啶合成途径，但分化细胞（differentiated cells）几乎只利用补救途径摄取尿苷（uridine）。细胞状态与嘧啶合成途径偏好之间的联系在小鼠和人类组织中持续存在。在机制上，研究人员发现，CAD（氨基甲酰磷酸合成酶2、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶的融合酶）的S1900磷酸化在分化细胞中由尿苷缺失诱导，并在原始细胞中本底性富集。在分化细胞中模拟CAD S1900磷酸化可本底性激活从头嘧啶合成，而阻断此修饰则会损害细胞对尿苷饥饿的应答。总之，研究人员建立了一种氮代谢谱分析方法，并定义了细胞状态特异性的嘧啶合成途径选择的机制。

氮代谢谱分析揭示细胞状态特异性的嘧啶合成途径选择

研究背景、问题与研究意义

代谢物谱分析和稳定同位素示踪技术的进步加深了对代谢在生理和疾病中影响的理解。然而，这些进展并未在所有生物化学途径中均衡显现。与利用¹³C同位素标记的营养物进行的体内示踪研究改变了我们对器官和肿瘤中碳核心代谢的认识不同，氮整合到代谢组的机制仍相对不明。这种差异很大程度上归因于细胞为支持氮代谢而使用的营养物种类比碳代谢更为多样。广泛覆盖核心碳代谢途径可以通过示踪少量¹³C标记的营养物（如葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸、乙酸和游离脂肪酸）来实现。为了类似地覆盖氮代谢途径，则需要许多¹⁵N标记的示踪剂，这是一个关键挑战，因为当前的实验范式并未针对多路复用的稳定同位素示踪进行优化。

为了应对这一局限，研究人员假设可以构建一个细胞培养基库，用于平行示踪多种¹⁵N标记的营养物，以生成氮代谢程序的系统水平图谱。通过开发这一氮代谢谱分析平台并将其应用于研究恶性和非转化神经细胞，本工作旨在揭示细胞分化状态与嘧啶合成途径偏好之间的基本联系，这对癌症和发育生物学具有潜在意义。相关研究成果发表在《Nature Metabolism》期刊。

主要关键技术方法

研究人员建立并验证了一个氮代谢谱分析平台。关键技术包括：构建一个包含30种不同¹⁵N稳定同位素示踪剂（对应人类血浆中20种蛋白源性氨基酸、非蛋白源性氨基酸、尿素循环中间体、核苷酸前体、离子和氮代谢终产物）的人血浆类似培养基库，以进行平行化稳定同位素示踪。细胞在培养基中培养后，使用高分辨率液相色谱-质谱联用技术分析代谢物提取物，并通过计算流程对所得数据集进行量化和解卷积，生成桑基图、差异标记分数排序列表和各条件下的稳态代谢物水平。此外，研究中还运用了多种细胞模型，包括人胶质瘤干细胞、正常人星形胶质细胞、神经干细胞、人类正常成纤维细胞及其重编程诱导的多能干细胞、神经祖细胞和分化神经元。体内研究使用了携带患者来源异种移植胶质瘤的小鼠模型，通过连续输注同位素示踪剂，结合常规代谢组学和基质辅助激光解吸电离质谱成像对脑组织进行分析。体外验证包括对原代人脑组织（非恶性脑组织和胶质瘤样本）进行器官外植体培养和稳定同位素示踪。机制探究涉及免疫共沉淀-质谱联用、免疫印迹、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。

研究结果

1. 氮代谢谱分析平台的开发与验证

研究人员创建了一个包含30种不同¹⁵N同位素标记示踪剂的HPLM库，旨在平行覆盖单个营养物对氮代谢途径的贡献。通过高分辨率LC-MS分析代谢物提取物，并构建计算流程，该平台可生成描绘全局氮代谢的桑基图、差异标记分数的排序列表以及各条件下的稳态代谢物水平。平台首先通过“重新发现”异柠檬酸脱氢酶突变导致的氮代谢失调机制（即(R)-2-羟基戊二酸抑制BCAT依赖性谷氨酸合成，并补偿性激活GLS依赖性谷氨酸合成）得到了验证。对IDH1突变胶质瘤干细胞BT054使用AGI-5198抑制突变IDH1后，氮代谢谱分析以无偏见的方式揭示了(R)-2HG积累减少了支链氨基酸依赖的谷氨酸生成，并刺激了补偿性的谷氨酰胺依赖性谷氨酸合成，与先前假设驱动的研究一致。该平台能够捕捉到(R)-2HG驱动的谷氨酸代谢变化，包括BCAA和谷氨酰胺代谢的显著差异，并通过低通量稳定同位素示踪实验得到验证，数据证实了平台性能，并表明其可用于无偏见的氮代谢程序发现。

2. 氮代谢谱分析揭示嘧啶合成途径偏好与细胞状态之间的联系

将平台应用于比较恶性（BT054胶质瘤干细胞）和非恶性（永生化正常人星形胶质细胞）细胞，揭示了氮代谢的诸多差异，特别是嘧啶核苷酸合成的底物偏好。NHA细胞几乎只利用尿苷来维持UMP、UDP和UTP嘧啶池，而BT054细胞则主要使用谷氨酰胺。因此，NHA细胞主要依赖嘧啶补救途径，而BT054细胞同时利用从头和补救途径。对一系列细胞系的评估显示，源自IDH野生型和突变型胶质瘤的胶质瘤干细胞本底性激活从头嘧啶合成，而分化的非转化细胞（星形胶质细胞、成纤维细胞）则显示极低的从头合成但强大的补救途径通量。非转化但原始的神经干细胞系显示出与胶质瘤干细胞相当的从头嘧啶合成活性。通过同基因的原始和分化细胞培养物（人正常成纤维细胞、诱导多能干细胞衍生的神经祖细胞和神经元）比较，进一步证实神经祖细胞再现了胶质瘤干细胞和神经干细胞对从头嘧啶合成的偏好，而成纤维细胞和神经元则像其他分化细胞一样主要依赖嘧啶补救。这些发现表明分化状态是嘧啶合成途径选择的细胞内在决定因素。功能实验表明，抑制神经祖细胞的从头嘧啶合成酶DHODH会降低其自我更新能力，且嘧啶补救无法完全补偿此需求。尿苷的可用性促进了神经元分化过程中对神经元功能至关重要的基因程序的表达。

3. 细胞分化状态与原发性脑组织中不同的嘧啶合成程序相关

在体内小鼠模型中，对正常脑组织和胶质瘤异种移植组织进行稳定同位素示踪和空间代谢组学分析。结果显示，尽管谷氨酰胺示踪剂积累在正常脑和胶质瘤中相似，但强烈的谷氨酰胺依赖性UMP标记仅存在于胶质瘤中，而尿苷依赖性UMP标记在正常脑和胶质瘤中相似。空间代谢组学分析也显示，正常脑组织和胶瘤旁脑组织的从头嘧啶合成水平低于胶质瘤异种移植瘤，而尿苷依赖性嘧啶补救在所有组织中均本底性活跃。富含未分化细胞的胎鼠脑组织再现了在胶质瘤异种移植瘤中观察到的升高的从头嘧啶合成水平。对50个人类脑标本的代谢物谱分析显示，从头嘧啶合成途径中间体氨基甲酰天冬氨酸在高、低级别胶质瘤中均较非恶性脑组织增加，而尿苷无差异。利用器官外植体培养对来自患者手术切除样本的非恶性脑和胶质瘤组织进行离体稳定同位素示踪，结果显示胶质瘤但非恶性脑外植体表现出本底性的从头嘧啶合成，而所有外植体均显示强大的尿苷补救活性。这些结果表明从头嘧啶合成途径激活是原发性脑组织中原始细胞群的保守特征。

4. 分化细胞中从头嘧啶合成以尿苷依赖性方式被抑制

对分化细胞（如NHA）的研究发现，在常规培养条件下，虽然它们显示出对嘧啶补救的强烈偏好并快速消耗尿苷，但在尿苷耗竭时并不会出现增殖缺陷。对NHA细胞的动态监测揭示了细胞内氨基甲酰天冬氨酸和培养基尿苷水平之间存在互逆的周期性关系，而UMP、UTP等下游代谢物水平保持稳定。这提示分化细胞会根据尿苷可用性抑制从头嘧啶合成。实验证实，在尿苷剥夺条件下，星形胶质细胞和成纤维细胞迅速激活从头嘧啶合成，而大多数胶质瘤干细胞和神经干细胞的从头嘧啶合成不受尿苷剥夺影响。在尿苷剥夺后的早期（3小时内），即可观察到氨基甲酰天冬氨酸标记的增加，补充尿苷则可在30分钟内抑制此合成。蛋白水平分析显示，短期或长期的尿苷饥饿并未导致CAD、DHODH和UMPS蛋白水平的显著变化。无细胞核的人血小板在尿苷剥夺后也激活了从头嘧啶合成，表明存在转录后机制。尿苷剥夺并未导致UTP或尿酸水平的差异，也未见mTORC1信号激活或CAD S1859磷酸化的持续增加。

5. CAD S1900磷酸化激活分化细胞中的从头嘧啶合成

通过免疫共沉淀-质谱联用分析尿苷存在与否条件下Flag标记的CAD及其相互作用蛋白，发现尿苷剥夺细胞中唯一显著升高的修饰是CAD S1900磷酸化。功能实验显示，在NHA细胞中表达CAD S1900D（磷酸模拟突变体）可在尿苷充足和缺乏条件下均提高从头嘧啶合成活性，而表达CAD S1900A（无法磷酸化突变体）的细胞在尿苷充足条件下与野生型CAD相似，但在尿苷剥夺时无法有效激活从头嘧啶合成途径。全局代谢组学分析进一步证实，CAD S1900A表达细胞在尿苷饥饿时合成标记和总嘧啶池存在缺陷，而CAD S1900D表达细胞则独立于尿苷可用性增加了标记和总嘧啶池大小。这些数据表明CAD S1900磷酸化足以克服分化细胞对嘧啶补救的严格偏好，并且是尿苷剥夺诱导从头嘧啶合成所必需的。

6. CAD S1900磷酸化在胶质母细胞瘤中增加并与原始细胞状态相关

对人类胶质母细胞瘤和非恶性脑组织的蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据的再分析显示，CAD S1900磷酸化在胶质母细胞瘤中较非恶性脑组织升高。相关性分析表明，CAD S1900磷酸化与原始细胞标志物SOX2和OLIG2呈正相关，但与PKA、mTORC1或MAPK信号标志物无关。相比之下，CAD S1406和S1859磷酸化与信号通路标志物相关，而与原始细胞标志物无关。这表明GBM中CAD存在两个独立的调控轴：生长因子信号依赖的S1406和S1859磷酸化，以及细胞状态特异的S1900磷酸化。对其他人类肿瘤（胰腺导管腺癌、头颈鳞状细胞癌）数据的分析也显示，干细胞指数与CAD S1900磷酸化呈正相关，表明此修饰与原始细胞状态之间的联系在不同肿瘤亚型中具有普遍性。序列比对显示CAD S1900及其周围氨基酸残基在哺乳动物中高度保守。基于这些发现，研究人员提出了一个由细胞分化状态控制的嘧啶合成模型：在营养充足的分化细胞中，CAD S1900磷酸化和从头嘧啶合成被抑制，导致补救途径占主导；尿苷剥夺时，CAD被快速磷酸化于S1900，刺激补偿性的从头合成。在原始细胞中，从头和补救途径均本底性活跃，前者与尿苷的调控解耦，这与CAD S1900磷酸化的本底性富集相关。

讨论与结论

研究人员开发、验证并应用了一个实验平台，以解决研究高等生物细胞氮代谢的复杂性。该平台生成了氮代谢程序的高水平表征以及配对培养物之间底物利用差异的定量测量。利用该平台，研究人员探究了分化、非转化星形胶质细胞与原始、恶性胶质瘤细胞之间氮代谢的差异。嘧啶合成底物利用是关键差异之一。数据显示，嘧啶合成途径选择是细胞内在的，独立于微环境营养限制，并与细胞分化状态紧密相关。本研究补充了先前强调表达是促成肿瘤中嘧啶代谢程序因素的工作。在基础条件下，非恶性成人脑组织以及培养的星形胶质细胞、神经元和成纤维细胞尽管本底表达从头途径酶，但仍抑制从头嘧啶合成。这提示在分化细胞中，从头嘧啶合成机制已准备就绪，但需要分子信号来启动。这种调控框架可能在急性营养剥夺期间为细胞提供优势，使其能够比启动转录和翻译更快地上调从头嘧啶合成。

研究发现尿苷耗竭是分化细胞激活从头嘧啶合成的重要信号。在机制上，星形胶质细胞在尿苷饥饿时迅速磷酸化CAD S1900。阻断CAD S1900磷酸化不影响尿苷充足条件下的基础嘧啶代谢，但会导致尿苷限制期间从头合成来源和总嘧啶核苷酸池的耗竭。因此，研究人员得出结论，CAD S1900磷酸化是星形胶质细胞在尿苷限制时激活从头嘧啶合成所必需的，并提出CAD S1900磷酸化是分化细胞应对嘧啶补救破坏的关键组成部分。这些发现表明，细胞以可能与嘌呤感应机制合作的方式监测和响应嘧啶丰度的变化，以促进对核苷酸耗竭和代谢应激的适应。

这些见解加深了我们对调控从头嘧啶合成的变构和翻译后机制的理解。总之，研究人员建立了一种氮代谢谱分析方法，并定义了细胞状态特异性的嘧啶合成途径选择的机制。