MARCO通过诱导免疫抑制促进胆管癌发生及其靶向抑制可减少肿瘤生长

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：MARCO promotes cholangiocarcinogenesis by inducing immunosuppression and its targeting reduces tumor growth

　　

摘要 胆管癌（CCA）是一组预后不良且治疗选择有限的异质性胆道恶性肿瘤。近期研究强调了免疫系统在肝内胆管癌（iCCA）发生和进展中的作用。本研究中，研究人员探讨了清道夫受体MARCO在iCCA中的作用。通过对人类样本的转录组学、空间蛋白质组学和组织学分析，发现MARCO表达于肿瘤微环境中与免疫抑制和细胞外基质重塑相关的特定亚型肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）上。在人类iCCA肿瘤中，MARCO的高表达与较差的总生存期、T细胞功能障碍以及胶原沉积增加相关。与此一致，MARCO的表达与TH2偏斜的免疫反应相关，并且在暴露于IL-4和IL-13的巨噬细胞中表达增加。Marco?/?小鼠可抵御iCCA的发生，表现为肿瘤负荷减少、与TH2反应相关的先天性免疫细胞减少以及纤维化减弱。此外，Marco?/?小鼠在巨噬细胞和细胞毒性T细胞上表现出较低水平的免疫抑制标志物，在原位肿瘤模型中导致总生存期改善和肺转移减少。使用抗MARCO抗体进一步减少了野生型小鼠的肿瘤体积。本研究将MARCO确定为iCCA中免疫抑制、纤维化和肿瘤进展的关键调节因子，并支持其作为巨噬细胞导向免疫治疗新靶点的潜力。

研究背景与问题

胆管癌（Cholangiocarcinoma， CCA）是全球发病率持续上升的第二大常见原发性肝癌。肝内胆管癌（intrahepatic CCA， iCCA）是其主要亚型之一，早期常无症状，确诊时多已晚期，手术切除率低，复发率高。目前晚期患者的一线疗法（吉西他滨联合顺铂及免疫检查点抑制剂）主要为姑息性，患者5年生存率低（7-20%），平均生存期约6个月，亟需更有效的治疗策略。肿瘤微环境（Tumor Microenvironment， TME）在癌症进展和治疗抵抗中起关键作用。超过60%的iCCA呈现“非炎症”表型，其特征是缺乏CD8⁺T细胞，而免疫抑制细胞（如M2型肿瘤相关巨噬细胞及髓源性抑制细胞）占主导。TAMs不仅促进免疫抑制微环境，还通过与细胞外基质（Extracellular Matrix， ECM）成分和成纤维细胞密切相互作用，促进间质重塑，进一步限制免疫细胞浸润并降低疗法疗效。因此，选择性靶向TAMs可能为iCCA带来治疗获益。然而，iCCA中明确且有效的巨噬细胞相关靶点仍缺乏表征，限制了免疫调节策略向临床干预的成功转化。清道夫受体MARCO（Macrophage Receptor with Collagenous Structure）近期被发现在多种实体瘤中表达于具有M2样免疫抑制特征的TAMs亚型，并与不良预后相关。尽管在乳腺癌、黑色素瘤等模型中，抗体介导的靶向MARCO-expressing TAMs可重编程巨噬细胞、抑制肿瘤生长和转移，但MARCO在iCCA中的功能作用及其在iCCA TME中的细胞性质在很大程度上仍未得到探索。

研究目的与意义

本研究旨在阐明MARCO在iCCA中的作用及其治疗潜力。通过整合人类iCCA样本的转录组学、空间蛋白质组学和组织学分析，并结合多种小鼠iCCA模型，研究人员系统评估了MARCO的表达特征、功能及其作为治疗靶点的可行性。该研究首次全面揭示了MARCO是iCCA肿瘤微环境中免疫抑制、纤维化和肿瘤进展的关键调节因子，为开发针对巨噬细胞的免疫疗法提供了新的理论依据和潜在靶点。相关成果发表在期刊《Signal Transduction and Targeted Therapy》上。

关键技术方法概述

为开展研究，研究人员综合利用了以下关键技术方法：

1. 1.
   多队列生物信息学分析：利用来自哥本哈根、Job、Jusakul、Nakamura、Dong和TIGER等多个独立患者队列的公共转录组数据，以及GSE125449、GSE138709、GSE151530等单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据，分析MARCO的表达模式、预后价值及其与免疫特征的相关性。
2. 2.
   人类样本组织学与蛋白质组学分析：使用来自欧洲CCA组织学登记处（ENS-CCA Histology Registry）的人类iCCA组织样本，通过免疫组织化学、免疫荧光、天狼星红染色等方法评估MARCO蛋白表达、胶原沉积、α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达，并利用空间蛋白质组学技术对比分析MARCO⁺与MARCO^-区域的免疫检查点蛋白表达谱。
3. 3.
   体外细胞实验：用IL-4/IL-13刺激巨噬细胞诱导MARCO表达；通过将iCCA细胞系（SB1细胞）与野生型或Marco^?/?小鼠的库普弗细胞或骨髓源性巨噬细胞（BMDMs）共培养，结合蛋白质组学分析和细胞迁移实验，探究MARCO对肿瘤细胞行为的影响。
4. 4.
   体内小鼠模型验证：在C57BL/6背景的野生型和Marco^?/?小鼠中构建了三种不同的iCCA模型，包括两种致癌基因驱动模型（分别采用myr-AKT/YAP联合部分胆管结扎及IL-33注射，以及myr-AKT/Fbxw7ΔF联合睡美人转座酶系统的 hydrodynamic tail vein injection）和一种同源原位移植模型（注射SB1细胞），用于评估MARCO缺失对肿瘤发生、进展、转移、生存及免疫微环境的影响，并测试了抗MARCO抗体（ED31）的治疗效果。

研究结果

MARCO在人类 iCCA 肿瘤的 TAMs 中表达，并与较差的总生存期相关

通过分析人类单细胞RNA测序数据，发现MARCO在正常和肝硬化肝脏中主要表达于巨噬细胞，在iCCA肿瘤中其表达仅限于肿瘤相关巨噬细胞。免疫荧光证实MARCO在CD68⁺或CD206⁺TAMs的一个亚群中表达。尽管与周围正常组织或正常胆管相比，iCCA肿瘤中的MARCO表达水平总体较低，但KRAS突变和晚期（IV期）肿瘤表现出最高的MARCO表达。蛋白质水平分析也显示，肿瘤内存在MARCO表达。重要的是，在三个独立队列中，肿瘤MARCO高表达（高于中位数）与患者较差的总生存期相关。在蛋白质水平，基于肿瘤内MARCO⁺细胞数量将样本分为MARCO^LOW和MARCO^HIGH，证实MARCO^HIGHiCCA患者的5年总生存期更差。

MARCO⁺TAMs 参与免疫抑制和 ECM 重塑

对iCCA患者单细胞数据的深入分析显示，表达MARCO的TAMs具有异质性起源，同时表达库普弗细胞标记物（如VSIG4, FOLR2）和单核细胞来源巨噬细胞标记物（如CD14, LYZ）。与MARCO^-TAMs相比，MARCO⁺TAMs中上调的基因与中性粒细胞脱颗粒、IL-10信号传导等免疫抑制途径，以及胶原纤维组装和ECM降解等纤维化相关途径有关。相反，下调的基因与免疫系统和干扰素γ信号传导相关。此外，与肿瘤外（健康或周围正常肝脏）的MARCO⁺巨噬细胞相比，肿瘤内的MARCO⁺TAMs失去了库普弗细胞的稳态功能，但获得了与细胞周期和胶原三聚化相关的基因特征。

MARCO表达与 iCCA 中的 T_H2 反应和免疫抑制相关

利用生物信息学工具分析发现，MARCO表达与M2巨噬细胞、成纤维细胞等促癌免疫细胞类型强相关。高MARCO表达肿瘤表现出更高的T细胞功能障碍性，且MARCO与T细胞耗竭标志物（如PD-1， CTLA-4）呈正相关。空间蛋白质组学分析进一步证实，与MARCO^-区域相比，MARCO⁺区域的CD45⁺免疫细胞中PD-L1和PD-1等免疫抑制标志物蛋白表达显著上调。此外，MARCO表达与癌症-免疫循环中涉及T_H2细胞、巨噬细胞募集的步骤正相关，并与T_H2反应相关基因（如IL4, IL13）表达呈正相关。体外实验证实，IL-4和IL-13处理可强力诱导巨噬细胞中MARCO表达，而scRNA-seq分析显示iCCA肿瘤中T细胞是IL-4/IL-13的主要生产者。

MARCO⁺TAMs 在人类 iCCA 中主要位于促结缔组织增生区域

iCCA以富含ECM的促结缔组织增生间质为特征。组织学分析显示，与MARCO^LOW肿瘤相比，MARCO^HIGHiCCA肿瘤具有更高的胶原含量和更多的αSMA⁺细胞。肿瘤内MARCO⁺细胞的数量与天狼星红阳性面积及αSMA⁺面积呈正相关。这些数据表明，表达MARCO的TAMs存在于iCCA肿瘤的组织病理学纤维化病变中。

Marco^?/?小鼠可部分抵御胆道肿瘤发生，并呈现与 T_H2 反应相关细胞的减少

在两种致癌基因驱动的小鼠iCCA模型中，与野生型对照相比，Marco^?/?小鼠表现出更少的肝脏肿瘤、更低的肝体比、更好的肝功能（血清白蛋白水平更高）以及更少的ECM沉积（纤维化减弱）。免疫表型分析显示，Marco^?/?小鼠肝脏中巨噬细胞的CD9表达（疤痕相关巨噬细胞标志）降低，同时产生IL-4/IL-13的2型固有淋巴细胞（ILC2s）和B细胞数量减少，提示T_H2反应减弱。

Marco^?/?小鼠可抵御 iCCA 进展，从而延长生存期

在同源原位iCCA模型中，Marco^?/?小鼠表现出改善的总生存期和更少的肺转移灶。其肿瘤微环境中CD9⁺和CD11c⁺巨噬细胞减少，巨噬细胞上PD-L1表达降低，细胞毒性CD8⁺T细胞上CTLA-4和PD-1的表达也减少，表明免疫抑制环境减弱。共培养实验表明，与Marco^?/?巨噬细胞共培养的iCCA细胞迁移能力下降，蛋白质组学分析提示其细胞骨架组织和迁移相关通路发生改变。最重要的是，在该模型中，使用抗MARCO单克隆抗体（ED31）治疗可显著减少野生型小鼠的肿瘤体积。

讨论与结论总结

讨论部分总结：本研究通过多组学整合分析，首次系统阐述了MARCO在iCCA中的核心作用。MARCO在iCCA的TAMs亚群中表达，其表达受TME中T_H2细胞因子（如IL-4/IL-13）驱动。MARCO⁺TAMs具有异质性起源，并展现出独特的促肿瘤表型：它们获得增殖和ECM重塑能力，同时失去稳态功能；其基因特征与免疫抑制（如中性粒细胞脱颗粒、IL-10信号）和纤维化相关，而与抗肿瘤的IFN-γ信号通路负相关。临床数据分析表明，MARCO高表达是iCCA患者不良预后的独立生物标志物。机制上，MARCO通过塑造T_H2偏斜的免疫微环境、上调免疫检查点分子（如PD-L1/PD-1）表达、促进ECM重塑和胶原沉积，共同营造一个支持肿瘤生长、侵袭和转移的免疫抑制及纤维化生态位。小鼠模型证实，缺失MARCO可通过减少疤痕相关巨噬细胞、削弱T_H2反应、降低免疫抑制信号和改善T细胞功能，从而有效抑制肿瘤发生、进展和转移，并延长生存期。抗MARCO抗体治疗在体内显示出显著抗肿瘤效果，提示其临床转化潜力。

研究结论翻译：总之，在人类数据和实验小鼠模型中一致的研究结果表明，MARCO在iCCA肿瘤微环境中的TAMs内表达，并在驱动肿瘤进展中发挥核心作用。MARCO⁺TAMs通过直接促进癌细胞运动和迁移，以及间接通过重塑ECM、塑造T_H2偏斜和免疫抑制的微环境、调节免疫检查点表达，从而建立一个促肿瘤生态位。与MARCO^LOWiCCA肿瘤相比，MARCO^HIGHiCCA肿瘤与增加的肿瘤负荷、增强的转移潜能和显著降低的总生存期相关。这些结果表明，MARCO是开发克服iCCA免疫抑制屏障的新治疗策略的一个有希望的靶点。