静电纺丝法制备的血管外膜衍生ECM/PCL纤维-水凝胶支架：一种新型血管再生方法，具有优异的细胞亲和性和可调节的生物力学性能

《Biomaterials》：Electrospun Vascular Adventitia–Derived ECM/PCL Fiber-Co-Hydrogel Scaffold: A Novel Approach to Vascular Regeneration with Enhanced Cell Affinity and Tunable Biomechanical Properties

　　

谢超|吴忠石|吴启英|陈泽国|陈思成|梁毅|邓超|袁浩勇|卢婷|刘玉红|黄灿

中南大学第二湘雅医院心血管外科，中国湖南长沙

摘要

尽管小直径血管移植物（SDVGs）取得了进展，但它们仍面临重大临床挑战，包括血栓形成、内皮化不足和机械性能不匹配等问题。为了解决这些限制，本研究采用静电纺丝-电喷雾技术结合vaECM自组装凝胶化方法，开发了一种含有肝素的血管外膜细胞外基质（vaECM）/PCL纤维共水凝胶血管支架。该支架结合了PCL纤维的机械强度和vaECM水凝胶的生物活性，而添加的肝素增强了其抗血栓性能。材料表征显示，这种纤维共水凝胶支架具有仿生层状结构、可调的机械性能、自愈能力、低膨胀率以及分级降解特性。与内皮细胞和平滑肌细胞的共培养实验表明，该支架显著促进了内皮细胞的粘附、增殖和迁移，以及平滑肌细胞的成熟。血液相容性测试证实了其优越的抗凝和抗血小板作用。在大鼠腹主动脉置换模型中，该支架在第4周时显著提高了内皮覆盖率，到第16周时支持了成熟血管平滑肌的再生和细胞外基质的有序重塑。这些结果突显了这种纤维共水凝胶支架的显著血管再生潜力，这得益于其生物活性的vaECM水凝胶和与生物组织相匹配的机械硬度，为小直径血管移植物的临床应用提供了有希望的途径。

引言

心血管疾病（CVDs）负担的增加迫切需要小直径血管移植物（SDVGs；内径<6毫米）[1]，[2]，这些移植物在冠状动脉旁路移植和周围血管修复等手术中不可或缺[2]。尽管移植物设计有所改进，但长期临床效果仍不理想，5年通畅率通常低于50%[3]，[4]。较差的血液相容性和延迟的内皮化使得SDVGs容易发生血栓形成[5]，[6]，[7]，[8]。此外，移植物与天然血管之间的机械不匹配可能引发内膜增生和吻合口狭窄[9]，[10]，[11]。因此，开发具有高生物相容性和与血管匹配的生物力学特性的SDVGs已成为研究重点[9]，[12]。

可降解合成聚合物，如聚（L-乳酸-ε-己内酯）（PLCL）、聚己内酯（PCL）和聚（甘油癸酸酯）（PGS），具有优异的机械强度和加工性能，被广泛用于SDVG的制造[13]，[14]，[15]。然而，它们缺乏内在的生物活性基序，限制了体内的组织整合和重塑。相比之下，细胞外基质（ECM）材料富含调节细胞粘附、存活、迁移和表型的结构蛋白和生物活性肽，使其成为下一代血管材料的候选者[16]，[17]。小肠黏膜下层（SIS）是最早被重新用作血管支架的脱细胞组织之一[18]；这类基质保留了生化复杂性、纳米级结构和促进体内功能性组织形成的生物诱导信号[19]。基于这一概念，贾等人结合了ECM来源的胶原蛋白和软骨素硫酸盐以加速内皮化[20]。特别值得注意的是，血管外膜ECM（vaECM）在支持内皮细胞（EC）增殖方面优于其他ECM来源，包括SIS和皮肤胶原蛋白[21]，[22]，[23]。因此，将vaECM纳入SDVGs可能增强血管再生。

支架的硬度是血管重塑的另一个关键决定因素，因为ECM的机械性能会调节血管平滑肌细胞（VSMC）的表型[24]，[25]，[26]。谢等人报告称，较硬的基质会下调VSMC中的收缩标志物（如SM22α、SMMHC、钙调神经磷酸酶）[27]，而胡等人则表明，增加硬度会促进自噬并驱动从收缩型向合成型的转变[28]。尽管这种硬度-表型关系已有充分文献记载[29]，[30]，但在SDVG设计中往往被忽视。因此，合理调节支架硬度以促进VSMC成熟至关重要。

ECM可以溶解并重新组装成水凝胶，从而扩大其在体内的应用范围[31]，[32]。由于其三维结构，ECM水凝胶更接近天然基质的组织结构，能够提供更接近生理条件的微环境，从而促进细胞粘附、增殖和分化[16]，[33]。与天然ECM相比，它们的柔顺性和弹性更容易调节，从而更好地匹配软组织的机械特性[33]。基于ECM的水凝胶血管移植物具有很大的潜力；然而，仍存在一些实际限制。例如，Isik等人使用海藻酸/透明质酸/主动脉ECM生物墨水通过3D打印制备了具有足够强度和压力耐受性的ECM水凝胶血管，但移植物长度有限[34]。Gupta等人用丝素纤维蛋白和Wharton’s jelly制备的ECM水凝胶在兔子体内表现出良好的重塑效果，但仍需要外部PCL增强以满足机械要求[35]。Tu等人用含有ECM的水凝胶涂层PCL移植物以促进再生；然而，通过涂层策略难以精确控制聚合物与ECM的比例，从而难以精确控制复合材料的机械响应[23]。相比之下，静电纺丝结合电喷雾技术可以实现聚合物纤维和ECM的均匀共沉积，并允许系统调节机械性能[36]。

在这里，我们报道了一种通过静电纺丝-电喷雾结合血管外膜ECM（vaECM）自组装凝胶化制备的纤维共水凝胶血管支架。在凝胶化过程中加入肝素以赋予抗凝功能。在这种复合材料中，vaECM水凝胶提供生物活性信号和与血管相匹配的柔顺性，而PCL纤维相提供拉伸强度和结构稳定性。我们系统地表征了支架的形态、机械性能、润湿性、降解性、膨胀行为、血液相容性和细胞相容性，并在大鼠腹主动脉插植模型中评估了其通畅性和再生性能。这项工作验证了将生物活性的vaECM信号与适当的硬度结合可以促进快速内皮化并支持VSMC成熟的假设，从而解决了SDVGs临床转化的关键障碍。

章节片段

材料

聚己内酯（PCL；Mn = 80,000）颗粒购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。六氟异丙醇（HFIP）购自Aladdin（中国上海）。乙醇和二氯甲烷购自天津化学试剂公司（中国天津）。青霉素和链霉素购自华北制药集团有限公司（中国河北）。脱氧核糖核酸酶I（DNase I）购自北京鼎国长盛（中国北京）。低分子量肝素

vaECM凝胶化及其表征

为了优化用于电喷雾处理的vaECM凝胶化，我们建立了六步工作流程（图1A）：(I) 组织采集；(II) 脱细胞；(III) 冷冻干燥；(IV) 溶解；(V) 干燥生成水凝胶前体；(VI) 凝胶化。

讨论

据我们所知，本研究首次将血管外膜细胞外基质（vaECM）作为水凝胶成分用于构建纤维共水凝胶小直径血管移植物。我们进一步证明，外膜层比内膜和中膜更适合制备水凝胶移植物，这与它们不同的ECM组成和处理行为一致。通过结合静电纺丝-电喷雾和肝素辅助的自组装凝胶化，我们

结论

在本研究中，我们证明了血管外膜细胞外基质（vaECM）的结构特征和蛋白质组成使其非常适合用于构建基于水凝胶的血管移植物。通过将静电纺丝-电喷雾与肝素溶液中的vaECM自组装凝胶化相结合，我们开发了一种vaECM/PCL@Hep纤维共水凝胶血管支架，该支架具有层状结构、可调的与血管相匹配的硬度、低膨胀率和分级降解特性。

CRediT作者贡献声明

谢超：撰写——原始草稿、可视化、验证、研究、数据分析。吴忠石：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源协调、项目管理、方法学、研究、资金获取、概念构思。黄灿：监督、方法学、概念构思。刘玉红：验证、资源协调、项目管理、方法学、资金获取。梁毅：撰写——原始草稿、方法学。邓超：方法学。卢婷：

作者声明没有竞争性财务利益。

伦理声明

本研究中的所有动物实验，包括移植物植入和兔子/大鼠血液采集，均获得了中南大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号20240195）。

数据和材料可用性

与本研究相关的所有数据均包含在论文或补充材料中。

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

本研究得到了湖南省重大科学技术项目（2019SK1010）和中国湖南省自然科学基金（资助/奖励编号：2025JJ60800）的支持。作者感谢中南大学高级研究中心高分辨率质谱实验室的所有成员在LC-MS实验中的协助。