多模态分析揭示未定带（ZI）的细胞多样性与发散性神经环路

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Multimodal analysis reveals cellular diversity and divergent circuits of the zona incerta

　　

摘要： 未定带（zona incerta, ZI）在多种行为功能中扮演重要角色，并且是治疗神经系统疾病的深部脑刺激（deep brain stimulation, DBS）的新兴临床靶点。尽管其重要性，ZI的细胞类型组成以及连接特定ZI细胞类型与全脑环路的解剖学环路组织仍不清楚。在本研究中，研究人员利用单细胞核RNA测序（single-nucleus RNA-sequencing, snRNA-seq）、空间RNA分析、离体电生理学和解剖学环路追踪技术，构建了ZI的多模态细胞图谱，并表征了特定ZI细胞类型的全脑单突触输入。研究人员定义了四种遗传学上不同的ZI GABA能神经元群体，它们表现出独特的空间分布、特化的内在电生理特性、发散的传出投射以及细胞类型依赖的突触输入模式。最后，通过光纤光度法，研究人员揭示了一个围绕由食欲性和先天厌恶性刺激产生的趋近-回避冲突的行为学检测中，不同ZI细胞类型之间的反应差异。因此，这项研究为未来旨在理解ZI的组织和功能的实验设计与阐释提供了基础性资源。

一、 研究背景、问题与目的

未定带（zona incerta, ZI）是一个位于丘脑下的脑区，在运动、感觉门控、疼痛、防御行为以及多种情境依赖性动机驱动（如摄食和新奇探索）中发挥重要作用。近年来，ZI在深部脑刺激等神经与精神疾病治疗中的潜力也日益受到临床关注。然而，尽管ZI的功能多样性被广泛认知，其内在的细胞与环路基础仍然存在许多根本性空白。现有研究对ZI的边界划分不够精确，对其组成细胞类型的描述不完整，关于其内部神经元神经递质身份和相对丰度存在相互矛盾的报道，也缺乏一个全面的细胞分类学框架来整合和指导新发现。这使得理解ZI如何实现其多样化的功能充满挑战。为了填补这些空白，本研究旨在构建一个多模态的ZI细胞图谱，系统阐明其细胞类型多样性、环路连接以及功能特性，为理解ZI在生理和病理过程中的作用奠定基础。

这项研究结果发表在国际权威期刊《Proceedings of the National Academy of Sciences》（PNAS）上。

二、 主要关键研究方法简述

本研究综合运用了多模态技术。细胞和分子层面，研究人员对成年野生型小鼠ZI区域神经元进行了单细胞核RNA测序（snRNA-seq），并结合荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization, FISH）进行了空间转录组学验证。环路和结构层面，利用多种病毒工具（如AAV1-CAG-FLEX-GFP、RV?G-4GFP、RV?L-5Cre等）和逆行追踪染料（如霍乱毒素B亚基），在小鼠品系（如Vgat^Cre、Slc30a3^Cre、Spp1^Cre、Nos1^Cre）中进行了特定细胞类型的传出投射顺行/逆行追踪以及全脑单突触输入（通过狂犬病病毒示踪）的绘制。生理功能层面，对急性脑片中的特定基因标记神经元进行了全细胞膜片钳记录，并在活体小鼠中，通过将通路特异性钙指示剂（AAV-syn-FLEX-jGCaMP8m）与光纤光度法结合，监测了在行为学任务中（一种结合了奖励摄取和威胁刺激的趋近-回避冲突任务）特定投射路径的神经元群体活性动态。

三、 研究结果

1. 转录组学与解剖学特征揭示ZI主要由GABA能神经元构成

通过snRNA-seq和覆盖ZI内外侧范围的系统性FISH分析，研究人员发现ZI主要由GABA能神经元构成（约87.9%），仅含少量谷氨酸能神经元（约12.1%，主要富集于ZI尾极）。利用GABA能神经元特异性小鼠品系（Vgat^Cre）进行的顺行示踪显示，ZI GABA能神经元向多种中脑、脑桥和丘脑结构发出密集的下行抑制性投射。

2. 背侧与腹侧ZI GABA能神经元的转录组学与解剖学差异

snRNA-seq聚类和FISH分析鉴定出区分ZI背腹侧的主要遗传标志物。背侧ZI神经元高表达Kcng2和Ptprk，而腹侧ZI神经元高表达Pax6和Meis2。这些基因标记的神经元在空间分布上存在显著分离。逆行追踪结合FISH分析进一步表明，背侧ZI神经元主要投射至被盖脑干结构（如红核RN、脑桥网状核PRN），而腹侧ZI神经元则更多投射至高级脑区（如上丘SC、丘脑后内侧核POm）。这种投射逻辑支持了背腹侧ZI在功能输出上的分工。

3. 腹侧ZI的两种不同GABA能神经元亚型

在腹侧ZI内部，研究人员发现了两种在遗传、电生理和投射上均有差异的神经元亚型。Slc30a3⁺神经元主要位于ZI前内侧，细胞较小，膜电阻较高，动作电位发放频率适应性较强，并独特地投射至中脑导水管周围灰质（PAG）的背内侧和腹外侧分区。Spp1⁺神经元则主要位于ZI后外侧，细胞较大，表现出更快的动作电位发放动力学和较小的频率适应性，与表达Pvalb（小清蛋白）的特性一致。

4. 背侧ZI的两种不同GABA能神经元亚型

与腹侧ZI类似，背侧ZI也包含两种主要的GABA能神经元亚型，分别由Nos1（一氧化氮合酶1）和Spp1标记。两者在Kcng2⁺神经元群体中几乎不重叠，Nos1⁺亚型数量更多。在电生理特性上，Spp1⁺背侧ZI神经元比Nos1⁺神经元具有更高的膜电容、更低的膜电阻和更快的动作电位动力学。尽管两者都向脑桥网状核等脑干被盖结构投射，但具体的投射模式存在差异。

5. 特定ZI神经元群体的中尺度输入连接性

利用狂犬病病毒逆向跨单突触示踪技术，研究人员绘制了四种特定投射-遗传定义的ZI神经元亚型（ZI-SC^Spp1+、ZI-SC^Slc30a3+、ZI-PRN^Spp1+、ZI-PRN^Nos1+）的全脑输入图谱。分析发现，ZI-SC^Slc30a3+亚型接受来自腹侧膝状体核和下丘脑后区的输入比例相对更高，而来自SC、前顶盖前核（APN）、中缝大核（MRN）和黑质网状部（SNr）的输入比例相对较低。总体上，ZI神经元接受广泛的输入，主要来源包括大脑皮层（特别是第5层）、下丘脑、顶盖前区、SC、MRN以及ZI内部的局部输入。不同亚型的输入权重存在差异，例如，PAG对ZI-PRN亚型的输入贡献比例高于对ZI-SC亚型。

6. 未定带-脑桥与未定带-上丘亚网络的功能差异

为了探究特定ZI亚网络的功能，研究人员设计了一个行为学任务，让小鼠在摄取液体奖励时，面对由头顶扩张圆盘（looming stimulus）产生的先天威胁刺激，从而引发趋近（摄食）与回避（逃跑）的行为冲突。利用光纤光度法分别记录投射至上丘（ZI-SC）和投射至脑桥网状核（ZI-PRN）的ZI神经元群体活动，发现了它们在不同行为阶段的差异性调制。在奖励摄食舔舐（lick bout）期间，ZI-PRN神经元活性在舔舐开始时被强烈抑制，且抑制程度与舔舐持续时间相关，并在舔舐结束时迅速恢复；而ZI-SC神经元仅在长时间舔舐期间出现抑制。在威胁刺激触发逃跑行为时，两个群体的活性均在逃跑开始后大幅增强。然而，在逃跑后于庇护所内的僵滞（freezing）期间，ZI-SC神经元的抑制程度显著强于ZI-PRN神经元。这些结果表明，ZI-SC和ZI-PRN通路在协调运动输出和应对环境冲突中扮演了不同的角色。

四、 讨论与结论总结

本研究通过多模态分析，为理解ZI的细胞多样性提供了一个框架，强调了四种独特ZI神经元亚型的区别。数据支持将ZI视作一个主要由抑制性神经元构成的结构，其GABA能群体可通过转录组身份、空间分布、投射偏好、内在生理特性、行为募集模式和突触输入组织进行区分。ZI并非一个功能均一的节点，而是包含了在定位上可差异性参与脑干、顶盖和丘脑网络的细胞类型。

一个主要结论是，ZI细胞类型最清晰地由转录组身份定义，但这种身份是沿着结构化的连续体而非严格的离散类别来组织的。 在宏观层面，Kcng2和Pax6区分了背侧和腹侧ZI群体，而Spp1、Slc30a3和Nos1则在这些亚区内解析了额外的多样性。同时，存在中间表型和双阳性细胞，表明相邻群体之间存在不完全的分离。因此，ZI的不同亚区在转录组学上是相关的，这可能是由于这些神经元群体沿着共同的发育谱系不完全分离所致。

在传出连接上，研究描述了一个分级的ZI传出组织：背侧ZI主要向脑干被盖提供输出，而腹侧ZI则更多地靶向顶盖和丘脑的高级结构。特定的ZI输出通路通常由多种ZI神经元亚型构成，其细胞类型依赖的生理特性可能在共享的输出通道内扩展了可用的计算能力。

功能上，在威胁-奖励冲突任务中观察到的ZI-PRN和ZI-SC通路的差异动态表明，它们对两种形式的运动静止（摄食舔舐和恐惧僵滞）可能有不同的贡献。ZI-PRN在舔舐期间更强的抑制和ZI-SC在僵滞期间更强的抑制，可能反映了选择特定运动输出的去抑制机制。

综上，该研究建立的ZI细胞类型与环路框架，为未来探究ZI在多种行为和疾病模型中的作用机制，以及开发针对特定ZI细胞类型的精准神经调控疗法，提供了重要的基础和资源。