综述：基于核酸的传染病即时诊断技术趋势

《Journal of Biological Engineering》：Trends of nucleic acid – based point-of-care diagnostics for infectious diseases

　　

全球传染病的出现与传播凸显了在即时（PoC）环境中拥有易于获取、分散式检测模式的重要性，该模式需擅长快速识别核酸。基于PoC的核酸检测涵盖了广泛的平台，如侧向层析（lateral flow）、生物芯片和生物传感器，其主要目标始终是在传统实验室设施之外提供灵敏、特异且具有经济可行性的检测。本综述全面概述了针对传染病的基于PoC的核酸检测技术，将其分为三个主要操作步骤：核酸提取、扩增和检测。首先，它描述了可有效作为PoC应用的策略，如基于磁珠、基于纸张和集成微流控方法，同时进一步关注其保持简化、坚固耐用且无需设备的能力。其次，它总结了关键的扩增方法，如聚合酶链式反应（PCR）、基于核酸序列的扩增（NASBA）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP），因为它们都已被改良以有效地在更快速、低功耗和便携的条件下工作。最后，它介绍了所有已知的检测平台，从侧向层析或设备平台中较简单的比色法和荧光法检测，到利用CRISPR/Cas系统和toehold开关原理的创新先进生物传感器，这些技术提供了高灵敏度且可编程的核酸识别。

本文主体部分系统性地阐述了基于核酸的即时诊断（PoC）技术在传染病领域的应用现状、核心方法学及未来发展趋势。文章结构严谨，主要分为诊断全景与方法学框架、核心方法支柱以及创新技术前沿三大部分。

在诊断全景与概念框架部分，文章指出基于核酸的PoC诊断通过三个基本步骤实现：核酸提取、扩增和检测。提取步骤旨在从血液、唾液或拭子等临床标本中分离DNA或RNA，并去除抑制剂。常用的方法包括基于磁珠和基于纸张的提取技术，这些方法因其简便性和成本效益而在资源有限的环境中备受青睐。随后的扩增步骤通过PCR、NASBA、RPA或LAMP等方法增加靶标序列的拷贝数。最后，扩增产物通过比色法、荧光法或侧向层析法（LFA）进行检测。文章强调，自COVID-19大流行以来，针对创新核酸PoC平台的研究显著增加，反映了对可扩展、响应迅速的诊断解决方案的迫切需求。

核心方法支柱部分详细探讨了从样本到结果的关键技术环节。在核酸提取策略中，文章对比了三种主要类型：磁珠法、纸基法和集成微流控法。磁珠法利用功能化磁珠结合核酸，通过磁力分离实现快速纯化，适用于唾液、痰液等多种样本，且在结合CRISPR/Cas系统时显示出良好的兼容性。纸基提取则利用滤纸或改性膜通过毛细作用吸附核酸，成本低廉且无仪器依赖，但存在回收率不稳定等问题。集成微流控平台则将样品制备、提取、扩增和检测整合于单一芯片，实现了真正的“样本进-答案出”流程，尽管在处理复杂样本时仍面临表面化学优化的挑战。

在核酸扩增技术方面，文章深入分析了四种主流技术。聚合酶链式反应（PCR）被视为金标准，其变体如定量实时PCR（qPCR）和多重PCR已通过商业化系统（如BioFire FilmArray和Cepheid GeneXpert）实现了部分PoC化，但这些系统通常体积较大且昂贵。相比之下，等温扩增技术更适合资源有限的环境。基于核酸序列的扩增（NASBA）在约41°C下进行，特别适用于RNA病毒检测，常与CRISPR/Cas或toehold开关传感器联用以提升灵敏度。重组酶聚合酶扩增（RPA）在37–42°C下运行，20–30分钟内即可完成扩增，常与侧向层析试纸条结合，形成如CoRapID等具有高灵敏度的检测方案。环介导等温扩增（LAMP）则利用多组引物在60–70°C下实现高效扩增，其结果可通过浊度、荧光或比色法直观判断，非常适合现场检测。

创新技术前沿部分重点介绍了下一代可编程检测平台。CRISPR/Cas系统凭借其独特的反式切割活性，已成为核酸检测的强大工具。特别是SHERLOCK（基于Cas13a）和DETECTR（基于Cas12a）平台，能够实现对单碱基突变的区分和超灵敏检测。Toehold开关作为一种合成生物学元件，通过与扩增产物（如NASBA生成的RNA）结合触发构象变化，进而启动报告基因的表达，实现了无需仪器的视觉读取。此外，文章还讨论了数字微流控（Digital Microfluidics）和人工智能（AI）辅助数据分析在PoC设备中的应用前景，这些技术有望进一步提升诊断的自动化水平和准确性。

综上所述，该论文主体部分构建了一个从基础理论到前沿应用的完整知识体系，强调了将高效的核酸提取、快速的等温扩增以及智能化的检测读数相结合，是推动传染病PoC诊断在资源有限地区广泛应用的关键路径。