心肌细胞特异性Plakophilin-2的缺失足以诱导非心肌细胞的衰老：其与致心律失常性心肌病的相关性

《Journal of the American Heart Association》：Cardiomyocyte‐Specific Plakophilin‐2 Loss Is Sufficient to Induce Aging and Senescence of Nonmyocytes: Relevance to Arrhythmogenic Cardiomyopathy

　　摘要
背景
PKP2的致病性变异是家族性致心律失常性右心室心肌病最常见的原因。本研究探讨了仅在心肌细胞中缺乏plakophilin-2（PKP2）是否足以引发非心肌细胞（即心脏驻留细胞）的过早衰老和促炎性衰老。

方法
我们使用常规和多重成像技术、细胞因子阵列、表观遗传时钟、空间转录组学、扩展显微镜和结构照明显微镜以及相关数据分析，研究了心肌细胞特异性tamoxifen激活的PKP2缺失（心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2）的小鼠模型。我们检测了非心肌细胞和心肌细胞中的过早衰老和衰老现象。

结果
我们在非心肌细胞中观察到了与衰老相关的异染色质聚集区，这些聚集区主要存在于α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞中。非心肌细胞培养基中的细胞因子与衰老相关的分泌表型一致。表观遗传时钟显示存在过早衰老现象。多重免疫组化分析表明，非心肌细胞与心肌细胞混合存在于同一微环境中。空间转录组学分析显示，在左心室心肌细胞丰富的区域，与衰老相关的分泌表型相关转录本显著增加。尽管在心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2的小鼠中未观察到与衰老相关的异染色质聚集区和表观遗传年龄增加，但我们观察到了与过早衰老相关的结构特征。交叉参考分析显示，心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2的小鼠的蛋白质组与实际年龄比其实际年龄大5到6倍的小鼠的蛋白质组以及神经退行性疾病的转录特征具有相关性。

结论
仅在成年心肌细胞中丧失PKP2表达就足以在非心肌细胞中诱导促炎性衰老和整体心脏过早衰老。这是首次将细胞衰老和过早衰老与桥粒相关的心律失常性心肌病联系起来的研究。我们推测，与衰老和神经退行性疾病相关的分子特征、生物标志物和药理学可能对诊断或治疗PKP2相关性右心室心肌病具有意义。

非标准缩写和术语
ARVC：致心律失常性右心室心肌病
Dpi：注射后天数
Ex-SIM2：扩展显微镜-结构照明显微镜
LAD：层粘连蛋白相关结构域
PKP2：plakophilin-2
PKP2cKO：心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2
SAHF：与衰老相关的异染色质聚集区
SASP：与衰老相关的分泌表型
TnI：肌钙蛋白I

研究展望
• Plakophilin-2（PKP2）缺失是遗传性心律失常性心肌病最常见的原因；我们发现仅在心肌细胞中丧失PKP2就足以在非心肌细胞中诱导促炎性衰老和心脏细胞的过早衰老。
• 我们发现PKP2相关性心肌病的分子特征与神经退行性疾病的分子特征有相似之处，因此建议将PKP2相关性心肌病视为一种心脏退行性疾病。

下一步应解决的问题：
• 是否存在针对神经退行性疾病和/或衰老的治疗方法（即使是实验性的），这些方法也可以应用于PKP2相关性心肌病？

Plakophilin-2（PKP2）是桥粒和整个心脏闰盘的组成部分。1 PKP2的致病性变异是家族性致心律失常性右心室心肌病（PKP2-ARVC）最常见的原因，这种病症与年轻人猝死有关。2 疾病进展可能导致终末期心力衰竭和需要心脏移植。2 与其他基因缺陷相关的情况一样，基因缺陷与器官功能障碍之间的具体机制仍不清楚。本研究探讨了“衰老”和“过早衰老”的概念，因此有必要在开始时对其进行定义。细胞衰老被定义为细胞永久停止分裂但仍保持代谢活跃的生物学状态。与衰老相关的特征包括异染色质聚集区（SAHF）和与衰老相关的分泌表型（SASP）。3 衰老细胞的积累在老年生物体中更为普遍，并且可以通过SASP促进邻近细胞的衰老。4 过早（生物学）衰老指的是与年龄相关的分子、表型和功能变化比预期更早出现的过程。虽然后者纯粹反映了自出生以来的时间，但生物学年龄是细胞、组织和器官的分子和功能状态的动态反映，通常表现为细胞表观遗传谱的变化，这可以转化为“表观遗传年龄”。5 大量研究表明，PKP2缺失会导致氧化应激增加、8,9 细胞核膜的完整性和结构变化8,10 以及磷酸化H2A组蛋白家族成员X（γH2AX）的免疫反应性信号增加8，后者是DNA损伤反应和修复的标志物8。这些结果，加上表明桥粒相关性心律失常性心肌病表型具有炎症成分的观察结果11,12,13,14,15，也是细胞衰老和衰老过程中的特征5,16。然而，直接检测桥粒相关性心律失常性心肌病中的衰老相关结构和分子特征的研究仍然缺乏。确定与其他与衰老和过早衰老相关的疾病（如神经退行性疾病和癌症）的共性可能为PKP2相关性右心室心肌病的治疗提供新的方法。

在这里，我们使用了一种先前表征的PKP2缺失的小鼠模型，即tamoxifen激活的心肌细胞特异性PKP2敲除（PKP2fl/fl/αMHC-CreERT2wt/+；称为PKP2cKO）。17 注射tamoxifen后，这些小鼠在较短的时间内经历了PKP2-ARVC的不同阶段：从看似健康的心脏发展到21天后出现以右心室（RV）为主的心律失常性心肌病，随后在28天时左心室（LV）也受到影响，最终在50到60天时100%死亡。17 这一系列可重复的事件使我们能够在特定时间点获取分子快照，并将其与临床表型联系起来。

我们以心肌细胞为中心的模型的一个重要特点是它明确了心肌细胞作为PKP2-ARVC整体心脏表型的根本来源。我们利用这一特点，展示了在tamoxifen注射后21天或28天的PKP2cKO心脏中分离出的非心肌细胞的过早衰老和衰老的形态学、生化和表观遗传特征。有趣的是，尽管存在过早衰老的迹象，但在心肌细胞中并未观察到典型的衰老特征。总体而言，我们的数据强烈表明，PKP2缺失的心脏细胞的细胞和分子表型属于过早衰老、促炎性和衰老的心脏。这些发现对潜在治疗方法的意义将在文中讨论。

数据支持
相关作者可应合理要求提供支持研究结果的数据。动物实验是在表达心肌细胞特异性Pkp2缺失（PKP2cKO）的3至6个月大的小鼠中进行的。所有PKP2缺失小鼠的实验均使用来自同一品系的tamoxifen注射的fl/fl、Cre阴性、性别和年龄匹配的小鼠作为对照。用于这些实验的αMHC-Cre-ER(T2)并非市售的Mer-Cre-Mer (B6.FVB[129]-A1cfTg(Myh6-cre/Esr1*)1Jmk/J)。我们的Cre由Takefuji等人生成19，并证明在我们使用的tamoxifen剂量和研究的时间内（直至tamoxifen注射后28天）没有心脏效应。事实上，接受tamoxifen治疗的杂合PKP2cKO小鼠（即αMHC-Cre-ER[T2]/Pkp2 wt/fl）没有明显的表型变化（见补充图I）。由于先前的观察显示表型没有性别差异8，因此包括了雌性和雄性小鼠。

程序符合美国国立卫生研究院的规定，并获得了纽约大学机构动物护理和使用委员会（IA16-01021）的批准。所有程序详见数据S1。简要来说，通过Langendorff灌注法分离出心室肌细胞和非心肌细胞。非心肌细胞通过差速离心分离后快速冷冻以提取DNA，用甲醛固定用于免疫染色，或培养24小时。非心肌细胞的图像通过共聚焦显微镜获得。条件培养基用于Proteome Profiler Mouse Cytokine Array进行细胞因子分析。CpG岛DNA甲基化分析由Clock Foundation使用Horvath 320K Mammalian Methylation阵列进行。21 心室肌细胞通过常规共聚焦显微镜或扩展显微镜和结构照明显微镜（Ex-SIM2）的组合成像，以约40纳米的光学分辨率确定其分子结构（主要抗体见表S1）。对福尔马林固定、石蜡包埋的心脏组织进行多重Opal 6-plex染色，以确定组织切片中非心肌细胞的位置（抗体见表S2）。从RV和LV收集的样本的空间转录组分析使用Nanostring GeoMx平台进行；从RV和LV自由壁分离出的心肌细胞丰富区域和非心肌细胞区域分别进行分析。

统计分析
数值结果以平均值±标准差报告。对于每个动物只提供一次测量的数据集，使用RStudio进行基于排列的统计比较：多组间的1-way排列ANOVA和成对比较的排列t检验。当进行多个成对比较时，使用Bonferroni校正调整P值。对于每个动物有多次观察的数据集（例如，每只小鼠有多个细胞），22 使用线性混合效应模型（SPSS），将组作为固定效应，将受试者（动物）作为随机效应以解释聚类现象。特定实验使用的检验方法在图例中说明。对于RNA测序数据，使用limma-voom流程进行差异表达分析。计数数据使用voom转换后进行线性建模和经验贝叶斯调整SE。P值使用Benjamini-Hochberg假发现率方法进行调整。分析在R（版本4.2.3）中进行。另一组实验结果在图S2中展示，进一步证实了我们的发现。从PKP2cKO心脏中收集的用4',6-二氨基-2-苯基吲哚染色的心脏组织切片显示，细胞中含有丰富的致密异染色质焦点，这支持了观察到的细胞密度并非解离过程产生的伪影的观点（见图S3）。

图1. 从PKP2cKO心脏中收集的非肌细胞中的SAHF（衰老相关异染色质焦点）。A、B，分别显示了来自对照组（A）或PKP2cKO心脏28天后的非肌细胞的代表性图像，这些细胞被染色以显示H3K9me3（青色）、α-SMA（金色）和DAPI（灰色）；最右侧的面板显示了合并图像。注意对照组中缺乏α-SMA免疫反应性细胞。刻度尺，20微米。C、E、G，显示了对照组（C）和PKP2cKO心脏21天（E）及28天（G）时核面积与SAHF数量（通过核内H3K9me3阳性焦点的数量来量化）之间的相关性图。α-SMA+和α-SMA-细胞的核分别用橙色和黑色圆圈表示。青色水平线表示10个SAHF的阈值。D、F、H，显示了α-SMA表达阳性（橙色）或阴性（黑色）细胞核中的SAHF计数（1个点，1个核）。在对照组中未发现α-SMA+细胞。与α-SMA+细胞相比，α-SMA-细胞的SAHF数量较低（对照组平均±标准差：0.94±2.19；PKP2cKO 21天：2.20±4.92；PKP2cKO 28天：4.90±5.6；所有数字均为每个核的SAHF数量）。未检测到SAHF的核数量在α-SMA-细胞中明显多于α-SMA+细胞（对照组：110个；PKP2cKO 21天：179个；PKP2cKO 28天：130个）。数据F和H使用线性混合模型进行分析以考虑聚类效应。多重比较通过Bonferroni校正进行了调整。数据点/小鼠数量：对照组α-SMA-为140/3；PKP2cKO 21天α-SMA-为248/3和α-SMA+为53/3；PKP2cKO 28天α-SMA-为326/3和α-SMA+为90/3。DAPI表示4',6-二氨基-2-苯基吲哚；dpi表示他莫昔芬注射后的天数；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；SAHF表示衰老相关异染色质焦点；α-SMA表示α-平滑肌肌动蛋白。

在另外的实验中，我们检测了PKP2cKO非肌细胞24小时培养基中是否存在先前与SASP相关的细胞因子。在商业可用的细胞因子阵列中，共有21个位点产生了信号；其中7个在含有PKP2cKO非肌细胞的培养基中显著更丰富，3个显著较少（见图2；如前所述，与SASP相关的细胞因子用红色下划线标出）。其他细胞因子在PKP2cKO细胞培养物中被检测到，但在对照组中未检测到。这些包括白细胞介素-1α、白细胞介素-16和白细胞介素-17，它们属于典型的SASP或其下游效应（见图S4）。完整列表见表S3。在28天时量化时，细胞因子的丰度保持不变或在某些情况下减少。与非肌细胞不同，心脏肌细胞不能在相同的时间（24小时）内培养同时保持其形态和功能。因此，SASP的分析仅在转录水平上进行（见下文）。

图2. PKP2cKO非肌细胞24小时培养基中的细胞因子。目标分子的密度测量相对于参考带。横坐标上的测试分子；红线标记了根据Saul等人定义的典型衰老相关分泌表型。数据以平均值±标准差显示，每只小鼠1个点（每种条件6个样本）。分析的条件包括对照组、PKP2cKO 21天和PKP2cKO 28天。仅显示在对照组样本中出现并在测试组中显示出统计学显著性的细胞因子。显著性通过排列一次方差分析（ANOVA）评估，随后进行多重比较的Bonferroni校正（见表S3）。dpi表示他莫昔芬注射后的天数；ICAM-1表示细胞间粘附分子-1；IL-1RA表示白细胞介素-1受体拮抗剂；IP-10表示干扰素γ诱导的蛋白质10；JE表示单核细胞趋化蛋白-1；MIP表示巨噬细胞炎症蛋白；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；RANTES表示在激活时调节的、正常T细胞表达和分泌的蛋白；TIMP表示组织金属蛋白酶抑制剂；TNF-α表示肿瘤坏死因子-α。

总的来说，上述数据表明，心肌细胞中PKP2的丢失可能导致非肌细胞出现与衰老一致的特征。接下来，我们研究了PKP2的缺乏是否还会触发这种细胞群体的生物年龄增加。从PKP2缺陷心脏中收集非肌细胞，在他莫昔芬注射后28天，使用DNA甲基化时钟（也称为“表观遗传时钟”）计算它们的生物年龄。后者是通过分析基因组中特定位置的DNA甲基化模式随时间可预测的变化来估计生物年龄（也称为“表观遗传年龄”或“DNA甲基化年龄”的算法）。所有用于这些实验的小鼠在研究开始时都恰好6个月大，以避免因年龄差异造成的混淆。使用了四种不同的、先前经过验证的表观遗传时钟，包括两种跨哺乳动物组织的通用时钟（见图3A和3B），以及组织特异性的DNAmAge Heart时钟（图3C）和DNAmAge Fibroblast时钟（图3D）。使用这些工具，PKP2cKO样本的DNA甲基化年龄与对照组相比一致升高。与对照组相比，分析其他时钟也得到了类似的结果（见图S5）。没有专门为小鼠非心肌细胞设计的时钟，因为它们被视为异质群体。因此，相关的参数不是对照组细胞的预测年龄的绝对值，而是对照组样本的时钟预测的年龄与PKP2cKO细胞的年龄之间的差异。

图3. 非肌细胞的预测生物年龄。从酶法分离并立即快速冷冻的对照组和PKP2cKO 28天后的非肌细胞样本中提取DNA，分析其CpG甲基化谱型（表观遗传时钟）。A、B，泛哺乳动物（Pan-Universal）时钟2和3（预测所有哺乳动物物种和所有组织的生物年龄）。C、D，小鼠特异性时钟：心脏特异性（C）和成纤维细胞特异性（D）。显著性通过排列t检验评估。数据以平均值±标准差显示。一个点代表1只小鼠（对照组和PKP2cKO 28天各6个样本）。dpi表示他莫昔芬注射后的天数；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2。

PKP2cKO组织样本中衰老的证据

PKP2cKO心脏组织中的细胞异质性和SAHF

上述数据是从心脏消化和分离后的细胞中获得的。然后，我们询问这种衰老表型是否也会出现在原位细胞中（即，未经过解离处理的细胞）。作为第一步，我们检查了PKP2缺陷心脏组织切片中心肌细胞和非肌细胞的分布。PKP2cKO 28天后的心脏的多重免疫组化显示，富含心肌细胞的区域也包含F4/80、α-SMA、Ly6G、CD3和CD11c阳性的细胞（分别识别巨噬细胞、平滑肌细胞和肌成纤维细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和树突状细胞；见图4）。相比之下，在对照组心脏中，我们只发现了孤立的α-SMA阳性的巨噬细胞和血管（见图S6）。选择用于检测的抗体是基于先前的研究，这些研究强调了巨噬细胞、活化成纤维细胞和免疫细胞在桥粒相关心律失常性心肌病表型中的重要性，并考虑到在同一样本上可以检测的细胞类型有限。总体而言，非肌细胞既存在于特定的微环境中，也混杂在富含心肌细胞的区域中（图S7显示了与图4相同的区域）。另一个例子在图S8A和S8B中展示，是在21天时获得的。图S8A显示了苏木精-伊红染色，用于识别嗜酸性粒细胞丰富的区域；免疫定位在下面的切片中进行，具体是在图S8A中用白色方块标记的区域。

图4. 他莫昔芬注射后28天的PKP2cKO心脏的多重免疫组化。显示了苏木精和伊红染色（A）；小方块标记了B中显示区域的更高放大倍数。C，对下面切片的免疫组化，重点关注B中的区域，使用Opal 6plx染色来标记巨噬细胞（F4/80）、肌成纤维细胞（α-SMA）、中性粒细胞（Ly6G）、T淋巴细胞（CD3）和树突状细胞（CD11c）。相应的图像显示在中间面板中。切片还用desmin染色（左侧面板）以突出显示心肌细胞（desmin阳性但其他标记均阴性）。合并图像显示在右侧面板中。刻度尺：1毫米（A）；100微米（B、C）。PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；α-SMA表示α-平滑肌肌动蛋白；SMC表示平滑肌细胞。

空间转录组学和衰老表型

我们使用组学方法进行了更广泛和深入的衰老分子表型分析。PKP2缺陷心脏中细胞类型的异质性和它们的分布限制了全局（整个器官）组学分析的解释，如之前的研究所示。因此，我们实现了空间转录组学平台（GeoMx）。使用了与多重免疫组化相同的心脏样本。在用于多重免疫组化的切片下方的组织切片上，对心肌细胞的特征性标记物（肌钙蛋白I [TnI]）进行了免疫染色，揭示了富含心肌细胞的区域（TnI染色阳性；此后称为TnI+）和缺乏该标记物的区域（TnI-）。从LV或RV的TnI+或TnI-区域分别收集转录本。图S9显示了染色组织切片的示例以及选为TnI+或TnI-的区域（使用的是图4中相同的心脏样本）。图5A至5D显示了从TnI+区域收集的数据的火山图（21天时，LV和RV分别在图5A和5B；28天时，LV和RV分别在图5C和5D）。我们的转录组数据与SAUL_SEN_MAYO签名数据库中的衰老和SASP相关转录本进行了交叉参考。图5中用绿色标记了与SASP相关的转录本（SASP-相关转录本）。图S10中的火山图中标记了其他与衰老相关的转录本（尽管没有特别归类为SASP）。我们的结果显示，在PKP2cKO心脏21天收集的样本中，有47个在SAUL数据库中被识别为SASP相关的转录本表达过量，2个表达不足（使用log2倍数变化=0.2和P_adjusted=0.05作为标准）。有趣的是，在28天收集的样本中，这个数字减少到21个转录本（19个表达过量，2个表达不足），这表明微环境不仅存在物理变化，还随疾病进展而变化。

图5. 区域特异性差异转录组。样本从PKP2cKO小鼠的RV和LV收集，时间分别为21天或28天。收集仅限于TnI染色丰富的区域（TnI+）或未观察到TnI染色的区域（TnI-）。每个火山图将差异的大小（log2FC）与每个基因的P_adj相关联。灰色点：差异表达的转录本。绿色：根据Saul等人的研究，与典型SASP相关的转录本（log2FC |0.2| 和 P_adj<0.05）。黑色：其他与SASP相关的转录本，在火山图中未显示出显著差异。TnI+或TnI-分别表示Troponin-I信号丰富或明显缺失的区域。使用GeoMx平台分析了从PKP2cKO心脏的LV和RV收集的样本（A、B）或28天（C–F）。对照组（6个样本与21天平行，6个与28天平行），PKP2cKO 21天（6个）和PKP2cKO 28天（6个）的总小鼠数量。数据收集自右心室或左心室自由壁的7到12个感兴趣的区域。为了显示目的，x轴和y轴的范围在各个图中不同。G，从TnI-（横坐标）或TnI+（纵坐标）在28天收集的Log2FC。每个数据点代表1个转录本，仅报告P_adj<0.05的转录本。象限由笛卡尔坐标原点（0,0）划分，并用罗马数字标记。H–J，分析了在TnI+和TnI-区域都下调的转录本的基因本体（GO）术语（H）、细胞区室（I）和细胞器（J）。K，对相同转录本的KEGG通路分析。在前10个富集术语中，报告了氧化磷酸化和与神经退行性疾病相关的通路。应用了|log2FC|≥0.3和P_adj<0.05的阈值。对于RNA测序数据，使用limma–voom流程进行了差异表达分析。计数数据使用voom转换后进行了线性建模和经验贝叶斯调整。P值使用Benjamini–Hochberg假发现率方法进行了调整。分析在R（版本4.2.3）中进行。Dpi表示他莫昔芬注射后的天数；FC表示倍数变化；KEGG表示京都基因与基因组百科全书；LV表示左心室；P_adj表示调整后的P值；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；RV表示右心室；SASP表示衰老相关分泌表型；TnI表示肌钙蛋白I。GeoMx平台还允许我们检查TnI染色阴性的区域的转录组。图5E和5F显示了28 dpi时从TnI-区域获得的转录组的火山图（21 dpi时TnI-区域的大小有限，导致我们无法对该特定组进行适当的转录组分析；完整数据集见表S5）。数据显示，这个群体中也存在与SASP相关的转录本，尽管数量少于21 dpi TnI+组。然而，总体分析来看，TnI+和TnI-区域的转录组之间存在很强的相似性。这一点在图5G中得到了强调。每个数据点对应一个基因，仅显示调整后的P值（P_adj）<0.05的基因。28 dpi时从TnI+区域获得的转录本的log2倍数变化值显示在纵轴上，而从TnI-区域在同一时间点获得的转录本显示在横轴上。笛卡尔图在第一个和第三个象限中数据密集，表明两个心脏区域的变化方向相同（每个象限中存在的所有基因列表见表S6）。对两个数据集中下调的生物过程的基因本体分析显示，参与细胞代谢的分子过度表达（图5H）；具体来说，前5个术语中有3个是需氧呼吸、细胞呼吸和氧化磷酸化（列出的大多数转录本在各种术语中都是共有的；见表S7）。与此一致的是，“细胞区室”的顶级基因本体术语是与线粒体和细胞呼吸相关的（图5I；表S8），根据SubcellulaRVis29，顶级细胞器是线粒体（图5J；表S9），而京都基因与基因组百科全书中的第二大术语是氧化磷酸化（图5K；表S10）。有趣的是，在京都基因与基因组百科全书的分析中，与神经退行性疾病相关的术语很突出，导致这些术语包含的转录本大多与细胞代谢有关（下文也有讨论）。作为下一步，我们探索了心肌细胞本身是否表现出衰老或早衰的迹象。

心肌细胞表现出早衰的迹象
对酶解离的心肌细胞进行分析，无论是在对照组还是PKP2cKO细胞中，都没有发现SAHF的存在（图S11A–S11D）。此外，心肌细胞也没有表现出与对照组相比生物年龄升高一致的DNA甲基化特征（图S11E–S11H）。然而，我们实验室之前的报告已经显示了PKP2cKO心肌细胞中其他早衰的迹象，包括过量的活性氧、γH2AX（DNA损伤反应/修复的标志物）的丰富表达、核膜通透性的增加以及核大小和形态的改变。为了从早衰的角度完成对心肌细胞的表征，我们进一步探讨了其他特定特征：染色质分布以及核仁的形态和功能。

PKP2cKO心肌细胞中的异染色质重新分布
先前的研究表明，在衰老的心肌细胞中，异染色质的空间组织受到破坏。在这项研究中，我们使用了Ex-SIM231，在亚衍射极限分辨率下和三维空间中，研究了成年心室肌细胞的染色质结构。方法的详细信息见图S12和视频S1至S3。图6A显示了通过对照心肌细胞或PKP2cKO心肌细胞核中部的单个光学切片。DNA使用SYTOX橙色标记。更亮的染色对应于压缩的异染色质区域。所显示的切片是从核的中部选取的，平行于其长轴方向，从而将层相关结构域（LAD）可视化为围绕核轮廓的密集压缩染色质环（见图6B中的示意图）。从这些图像中，我们量化了LAD处的SYTOX信号强度相对于核内检测到的总信号强度。我们排除了顶部和底部的切片，因为在这些情况下LAD与光学切片的方向平行。我们观察到，在21 dpi和28 dpi时，PKP2cKO小鼠的LAD处的SYTOX信号强度降低，这可能反映了这些区域中染色质的压缩程度较低（图6C）。

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图6. PKP2cKO心室肌细胞中的染色质重塑。
A. 对照组（左）和PKP2cKO小鼠28 dpi（右）核中部堆栈的代表性图像（排除顶部和底部），用SYTOX橙色染色。细胞经过扩展显微镜处理，并通过结构照明显微镜成像（见方法部分）。比例尺：1.5 μm。
B. 说明用于分析的平面的示意图。
C. 核周缘（LAD）处密集染色质的比例（通过SYTOX）相对于对照组、PKP2cKO 21 dpi和PKP2cKO 28 dpi的总SYTOX阳性信号。数据根据每次实验的平均对照值进行标准化，并以平均值±标准差显示。一个点代表一个细胞；n/N分别为对照组48/7、PKP2cKO 21 dpi 38/6和PKP2cKO 28 dpi 32/4（n=细胞数量；N=小鼠数量）。通过线性混合模型评估显著性，以考虑聚类效应。多重比较通过Bonferroni校正进行调整。Dpi表示他莫昔芬注射后的天数；LAD表示层相关结构域；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2。

核仁作为早衰的标志物
先前的研究发现，核仁的形态和核仁的转录活性是细胞早衰的标志物。作为下一步，我们使用Ex-SIM2系统在亚衍射极限分辨率下，表征了PKP2cKO心肌细胞中核仁的解剖特征。图7A和视频S4及S5展示了示例。尺寸是从显示最大核仁内径的光学切片中收集的，内径是测量到异染色质轮廓的距离。在21 dpi和28 dpi收集的PKP2cKO心肌细胞中，核仁都较大（图7B；圆度测量见图S13）。我们还观察到，在对照心肌细胞中，fibrillarin（一种特异性定位于核仁密集纤维成分的蛋白质）36组织成含有γH2AX（DNA损伤反应/修复的标志物）的玫瑰花环。这种组织在PKP2cKO心肌细胞中受到破坏（图7A的下方面板），并且γH2AX的丰度趋于增加（图7C），这种情况也发生在经历核仁应激的细胞中，这是细胞衰老的一个特征。34, 37 当在超分辨率下观察时（我们的案例约为40–60 nm），4',6-二氨基-2-苯基吲哚的信号和γH2AX的信号没有重叠（见图7A中的“合并”图像），这是预期之中的，因为DNA损伤修复不会发生在压缩的异染色质部位。使用强效DNA损伤诱导剂neocarzinostatin进行的对照实验38显示，核仁中的γH2AX确实增加了；然而，这种增加仅出现在核质中（不包括核仁本身）（见图S14A–S14C；核仁用黄色突出显示；另见Perez-Hernandez等人8）。

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图7. PKP2cKO心肌细胞中的核仁结构和γH2AX丰度。
A. 对照组（上层面板）和PKP2cKO 28 dpi（下层面板）的核仁。白色：DAPI（左侧面板）。金色和青色：γH2AX和fibrillarin。右侧：合并图像。比例尺=300 nm。另见视频S4/S5。
B. 光学切片中部的核仁面积。每个细胞一个点；细胞数量/小鼠数量分别为对照组74/9、PKP2cKO 21 dpi 46/5和PKP2cKO 28 dpi 64/7。垂直线标记标准差。C. 核仁内γH2AX所占的面积。数据根据平均对照值进行标准化；平均值±标准差。每个细胞一个点。n/N分别为对照组60/7、PKP2cKO 21 dpi 53/6和PKP2cKO 28 dpi 56/5。通过线性混合模型评估显著性，以考虑聚类效应。多重比较使用Bonferroni校正进行调整。C. 由于散射，没有观察到统计学上的显著差异，尽管多个PKP2cKO细胞的DDR面积大于对照组观察到的最大值。DAPI表示4',6-二氨基-2-苯基吲哚；dpi表示他莫昔芬注射后的天数；γH2AX表示磷酸化的H2A组蛋白家族成员X；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2。

单独的实验检查了核仁中的转录活性。具体来说，我们量化了核仁纤维中心上游结合因子（核糖体DNA转录的标志物）的丰度。39 数据显示，与对照组相比，PKP2cKO心肌细胞核仁中的上游结合因子丰度增加。图8A显示了个别示例（注意fibrillarin玫瑰花环的组织被破坏，也在图7中提供的图像中观察到）；定量分析见图8B和8C。总体而言，我们发现PKP2cKO心肌细胞的核仁更大，结构更紊乱，转录活性增加。基于图像分析表明核仁中的转录活性增加，并且知道核仁是核糖体RNA转录的特定位置，我们评估了我们的转录组中的核糖体RNA丰度。数据显示，在PKP2cKO转录组中，80个核糖体转录本中有69个（根据核糖体蛋白基因数据库）40在21 dpi和/或28 dpi时过度表达（P_adj <0.05；图8D；表S11）。当分析RV样本时也得到了类似的结果（图S15；表S11）。这些结果与先前关于早衰细胞中核仁转录活性的研究一致。33, 34

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图8. PKP2cKO心肌细胞核仁中的转录活性。
A. 对照组（上层面板）和PKP2cKO 28 dpi（下层面板）的核仁，分别用DAPI（白色）、UBF（金色）和fibrillarin（青色）染色。右侧为合并图像。比例尺=300 nm。
B. 核仁中的UBF聚集物数量。
C. UBF信号所占的面积，根据每次实验的平均对照值进行标准化。数据以平均值±标准差显示。每个细胞一个点。细胞数量/小鼠数量分别为对照组82/8、PKP2cKO 21 dpi 39/4和PKP2cKO 28 dpi 54/6。通过线性混合模型评估显著性，以考虑聚类效应。多重比较使用Bonferroni校正进行调整。
D. 21 dpi和28 dpi时左心室的火山图，显示TnI-阳性差异转录组（与图5A和5C相同），用橙色标记核糖体转录本。核糖体转录本的鉴定基于公共数据库（http://ribosome.miyazaki-med.ac.jp/），最初通过参考文献提供。40 DAPI表示4',6-二氨基-2-苯基吲哚；dpi表示他莫昔芬注射后的天数；FC表示倍数变化；P_adj表示调整后的P值；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；TnI表示肌钙蛋白I；UBF表示上游结合因子。

支持PKP2cKO心脏衰老表型概念的相关研究
为了进一步检查心脏衰老与PKP2缺乏之间的关系，我们将21 dpi时PKP2cKO小鼠的蛋白质组与Takasugi等人通过比较30个月大小鼠和6个月大小鼠的心脏蛋白质组定义的衰老小鼠的心脏蛋白质组进行了交叉参考。41 分析显示，由于PKP2表达丧失而导致的>300个失调蛋白在衰老心脏中也显著不同，假发现率（以P_adj表示）<0.005（列在表S12中）。当阈值降低到P_adj <0.05时，一致的结果数量增加到752个蛋白（表S12）。图9A中的笛卡尔图显示了P_adj <0.005的数据集之间的密切相关性，强烈表明PKP2cKO小鼠的生理年龄约为4到5个月，但其差异蛋白质组相当于其生理年龄5到6倍的老化小鼠。

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图9. PKP2cKO心脏的组学数据交叉参考分析。
A. 对照组与PKP2cKO 21 dpi之间差异蛋白表达的相关性（纵坐标；数据来自8）以及6个月大与30个月大小鼠心脏的蛋白质组（横坐标；数据来自Takasugi等人41）。每个点代表一个蛋白。虚线的交叉点标记笛卡尔图的原点（0,0）。仅包括P_adj<0.005的蛋白。皮尔逊相关系数r=0.7755。
B. 对从LV和RV收集的21 dpi（上）和28 dpi（下）心脏中TnI阳性区域下调转录本的京都基因与基因组百科全书通路分析。前10个显著通路，其中神经退行性疾病用黄色突出显示。应用了|log2FC|>0.5和P_adj<0.005的阈值。Dpi表示他莫昔芬注射后的天数；FC表示倍数变化；LV表示左心室；P_adj表示调整后的P值；PKP2cKO表示心肌细胞特异性条件性敲除plakophilin-2；RV表示右心室。

对PKP2cKO心脏中表达不足的转录本的通路分析显示，神经退行性疾病通路显著富集，特别是阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症，以及氧化磷酸化过程。这些结果强调了细胞代谢失调作为心脏和中枢神经系统细胞过早衰老的常见病理生理机制。这种模式在从TnI+区域（21天和28天时的左心室和右心室；见图9B；表S13）以及28天时的TnI?区域（见图S16；表S14）收集的样本中都有观察到。为了进一步确认，我们将我们的转录组数据集与神经退行性疾病的参考数据库进行了交叉比对，特别是阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症。在TnI+左心室21天组中，共有193个转录本发生失调，其中79个仅在该数据集中出现（P_adj <0.05；具体基因见表S15）。

讨论
年龄是导致死亡的一个高度显著的风险因素，无论其原因是什么。先前的研究表明，慢性疾病和急性疾病（包括退行性疾病）都会加速衰老过程。急性应激源（例如重大手术、怀孕或COVID-19感染）以及慢性压力和疾病（例如肥胖和HIV感染）都可以在各种组织和器官中增加生物学年龄，这是通过分子水平来测量的。衰老已经在获得性心脏病和起源于核膜的遗传性心肌病的背景下进行了研究。据我们所知，这是首次将桥粒相关的心肌病与过早衰老和细胞衰老的诱导联系起来。我们的结果表明，仅在心肌细胞中失去PKP2就足以在非心肌细胞中诱导出促炎性衰老表型，并且心脏的过早衰老与神经退行性疾病具有共同的分子基础（特别是与细胞代谢相关的分子）。

非心肌细胞中的衰老、炎症以及PKP2-ARVC的分子病理生理学
我们的数据揭示了非心肌细胞中衰老和过早衰老的分子特征，即SAHF的存在、显著的SASP水平升高以及表观遗传年龄的增加。衰老与炎症过程之间存在正反馈循环，其中衰老特征促进炎症，而炎症反过来又加速衰老。这种反馈循环可能会对细胞和组织的整体功能造成损害，正如在PKP2-ARVC中观察到的那样。因此，我们的结果为新兴的证据提供了支持，这些证据基于Saffitz小组的开创性工作，表明炎症和免疫反应是桥粒相关心肌病的关键病理生理基础。我们观察到非心肌细胞中的衰老现象，然而PKP2的丢失仅发生在心肌细胞中。这强烈表明心肌细胞可能是衰老反应的初级触发因素，可能是通过与周围非心肌细胞的旁分泌通讯实现的。目前尚不清楚心肌细胞释放的“首个响应”分子或分子集合是什么。我们尝试获得仅包含心肌细胞的时空转录组数据，但未能成功，因为组织学分析显示即使在TnI+细胞丰富的区域也存在非心肌细胞的混杂。然而，我们推测心肌细胞的触发可能与核膜和整个心肌细胞在细胞间粘附丧失后发生的物理损伤有关。同样，也有理由推测，而不是外泌的分子，线粒体可能在PKP2缺乏的心肌细胞中过量存在，并且偶尔也会出现在其周围的细胞外空间（参见Pérez-Hernández等人的研究），它们可能作为全局炎症反应的触发因素，正如在其他系统中所提出的那样。需要进一步的研究来验证这一假设。

心肌细胞结构及其与过早衰老的关系
染色质和核仁结构的变化是衰老的标志之一。正确表征这些特征需要使用低于光衍射极限的光学分辨率进行显微镜观察。在本研究中，我们结合使用了扩展显微镜技术和结构化照明技术（Ex-SIM2）。通过扩展协议，我们将细胞大小增加了6.4倍。规则z-盘分离的持续存在、细胞核形状的规则性以及整体细胞几何结构的保持（包括desmin和α-actinin支架）表明扩展是以比例方式发生的。然后使用SIM2技术对扩展后的细胞进行可视化和图像重建。后者的计算光学分辨率约为60纳米。如果除以扩展因子，我们可以计算出我们的分辨率接近10纳米。即使有所高估，也可以合理认为我们的光学分辨率优于40纳米，因为后者是一个分子对其邻近分子影响的范围。因此，我们的系统允许对细胞核内的分子拓扑进行详细分析，甚至包括直径约为1.5微米的核仁。

LAD处的染色质重塑
我们报告了PKP2cKO心肌细胞中LAD的染色质重组。LAD重组已被报道为细胞过早衰老的一个特征。我们推测，之前报道的由于PKP2丢失导致的核膜结构变化会对下方的异染色质造成物理压力，从而影响其完整性，最终影响其转录活性。这与观察到核膜蛋白lamin A/C的突变可以导致快速衰老或具有某些PKP2-ARVC特征的致心律失常性心肌病的现象相吻合。在跨膜蛋白43（TMEM43）缺乏的模型中也观察到了类似的核膜完整性与生物衰老之间的联系。

核仁作为过早衰老的标志物
Ex-SIM2观察显示核仁的大小增加且圆形度下降。我们还报告了DNA损伤反应信号的增多、由fibrillarin形成的玫瑰花结结构的破坏以及活性转录标记物（上游结合因子）的增加，这些都与核糖体转录本数量的增加相关。所有这些元素共同表明了核仁的压力，这是过早衰老的一个特征，也在接受化疗药物的心脏细胞中观察到。

心脏过早衰老和神经退行性疾病
京都基因与基因组百科全书途径以及直接交叉参考分析表明，先前在神经退行性疾病中报告为失调的几个转录本在PKP2cKO心脏中也发生了失调。这种一致性在分别分析右心室或左心室的样本时都存在，且在服用他莫昔芬后的21天和28天时都存在。显然，神经退行性疾病具有神经元特有的特征。然而，也似乎很明显，非神经元特有的生物过程也是PKP2-ARVC的分子病理生理学的一部分。这些包括在心肌细胞中的代谢功能障碍、核形态改变、核膜屏障受损以及整体γH2AX信号的增加；在这里，我们增加了染色质重塑和核仁压力的存在。正如这些元素导致（或伴随）神经元退化一样，它们也可能导致PKP2缺乏心脏中的心肌细胞丢失。尽管乍看之下这似乎只是语义上的相似，但PKP2-ARVC与神经退行性疾病有一个有趣的共同点，即对细胞分子完整性的主要损伤是通向细胞丢失的过程。这一特征与其他心肌病（例如层状蛋白病）不同，在其他情况下，主要损伤导致细胞生理变化，进而导致心脏功能缺陷。

局限性和未来方向
“非心肌细胞”这一术语涵盖了相当异质的细胞群体。我们的实验无法确定各种细胞类型对所研究表型的确切贡献。然而，我们的细胞培养可能受到在培养皿中分离并存活的细胞的偏见，因此它们不能完全代表心脏细胞的真实情况（实际上，在对照心脏的培养物中未检测到表达α-SMA的平滑肌细胞）。尽管有这一限制，我们的研究表明，在PKP2cKO心脏中肌成纤维细胞非常突出（见图1和图4）。先前的研究表明，这些细胞以及巨噬细胞（在组织样本中检测到；见图4）在PKP2-ARVC表型中起着重要作用。其他细胞类型（神经元？）的重要性仍不清楚，需要进一步研究。我们的动物模型并没有完全再现PKP2-ARVC作为人类疾病的全部特征。尽管在许多方面不完美，PKP2cKO模型已经为影响人类PKP2-ARVC治疗的转化研究奠定了基础，例如将flecainide重新用于抗心律失常治疗，以及为PKP2基因治疗在人类临床试验中的临床前研究。这里呈现的研究为ARVC的新治疗策略提供了尚未测试的方向。事实上，细胞衰老和神经退行性疾病都是已经引发广泛研究的靶点。细胞衰老与细胞分裂的停止相关，因此在癌症治疗中是一个理想的结果。然而，也已经开发出了针对细胞衰老和衰老样状的化合物来治疗多种疾病，例如特发性肺纤维化、阿尔茨海默病和加速衰老综合征等，这些方法仍有待在心脏相关疾病中进行测试。同样，鉴于这里和其他研究的数据，对于PKP2-ARVC等状况，测试旨在以非神经中心方式缓解神经退行性疾病进展的疗法可能是合理的。

结论
我们提供了证据，表明仅在心肌细胞中失去PKP2表达就足以在非心肌细胞中诱导出促炎性衰老表型，并导致心脏的过早衰老。据我们所知，这是首次将细胞衰老和衰老领域与桥粒相关的心肌病领域相结合的实验研究。我们的结果进一步突出了与神经退行性疾病的分子相似性，使我们提出PKP2-ARVC是一种心肌退行性疾病。超越语义层面，这一新的视角可以允许进行药理学上的交叉参考，这可能对治疗目前尚无治愈方法的疾病有益。

临床展望
年龄是导致死亡的主要风险因素。先前的研究已经证明，分子失衡可以加速生物衰老过程，并且已经证明衰老的促炎表型对健康有负面影响。在这里，我们通过使用PKP2缺乏的实验模型，从过早衰老和衰老的角度探讨了致心律失常性右心室心肌病的分子病理生理学。我们的研究表明，心肌细胞中PKP2的缺乏足以引发心脏细胞的过早衰老和非心肌细胞的促炎性衰老表型。讨论了由此产生的分子表型与神经退行性疾病（例如阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩侧索硬化症）观察到的表型之间的相似性。

转化展望
根据其性质，通过实验模型获得的发现的外推需要谨慎进行。然而，在其局限性范围内，本研究中使用的模型为治疗干预提供了宝贵的临床前信息。这里提出的发现支持这样的观点，即正在开发用于针对其他疾病（如阿尔茨海默病）中的衰老细胞的药物工具可以应用于控制心脏生态系统中衰老细胞释放的有害分子，从而减缓疾病的进展。未来的研究将需要测试这一假设。

资金来源
这项工作部分得到了美国国立卫生研究院的R35HL160840（M.D.）和R01-HL169961A（E.M.S.; M.D.）资助，美国心脏协会的24SCEFIA1156995（德克萨斯州达拉斯；Ide.L.）资助，以及心脏节律学会的Wilton W. Webster电生理学奖学金（华盛顿特区；G.B.）的资助。

致谢
我们想要感谢纽约大学格罗斯曼医学院先进研究技术部门的以下核心设施提供的宝贵支持：显微镜实验室（RRID:SCR_017934）、实验病理学研究实验室（RRID:SCR_017928）和基因组技术中心（RRID:SCR_017929）。这些设施部分得到了NYU Langone的Laura和Isaac Perlmutter癌症中心的癌症中心支持资助P30CA016087。此外，实验病理学研究实验室还得到了美国国立卫生研究院S10共享仪器资助S10 OD021747的支持。