《Journal of Controlled Release》：Lysosome-targeted degradation of leucine-rich alpha-2 glycoprotein 1 enables chemosensitization to 5-fluorouracil in colorectal cancer
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吴刚|张可娟|闵欢|杜林|李俊尧|李文正|张银龙|杜胜楠|齐英秋|张伟郑州大学人民医院胃肠外科，河南省人民医院，河南省消化道肿瘤精准控制工程技术研究中心，中国郑州450003摘要富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（LRG1）在结直肠癌（CRC）中显著上调，并与较差的预后相关，但其对药物
吴刚|张可娟|闵欢|杜林|李俊尧|李文正|张银龙|杜胜楠|齐英秋|张伟
郑州大学人民医院胃肠外科，河南省人民医院，河南省消化道肿瘤精准控制工程技术研究中心，中国郑州450003
摘要
富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（LRG1）在结直肠癌（CRC）中显著上调，并与较差的预后相关，但其对药物反应的作用仍不清楚。在这里，我们发现了LRG1与胸苷酸合成酶（TYMS）之间的关联，这种关联影响了CRC对5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性。LRG1的沉默与TYMS表达降低和5-FU的细胞毒性增强有关，这种效应部分是通过PI3K-AKT-mTOR信号通路介导的。基于这些观察结果，我们构建了一种靶向溶酶体的脂质体纳米嵌合物（Lipo-EM@5-FU），将LRG1的靶向降解与5-FU化疗结合，以实现信号通路和代谢过程的协调调节。在摄取后，LRG1的溶酶体降解与PI3K-AKT-mTOR信号通路的减弱和TYMS表达的降低相关，而5-FU进一步抑制了其酶活性，从而导致细胞周期停滞和凋亡。在携带肿瘤的小鼠中，Lipo-EM@5-FU表现出较长的循环时间、增强的肿瘤积累和强大的抗肿瘤效果，并且系统毒性最小。这项工作揭示了LRG1与5-FU反应性之间的功能联系，为结直肠癌治疗建立了一种基于降解的化学增敏机制。
引言
结直肠癌（CRC）仍然是全球癌症死亡的主要原因[1]、[2]、[3]。尽管靶向和免疫疗法取得了进展，化疗仍然是主要的治疗手段，5-氟尿嘧啶（5-FU）是大多数辅助治疗和转移性治疗方案的基石[4]、[5]、[6]。从机制上讲，5-FU抑制胸苷酸合成酶（TYMS），这是一种在新胸苷酸生物合成中起关键作用的酶，从而破坏DNA复制并诱导细胞毒性应激[7]。然而，5-FU的有效性受到狭窄的治疗窗口和通过TYMS上调及更广泛的代谢重塑来恢复核苷酸稳态的适应性细胞程序的限制[8]、[9]、[10]。现有的5-FU脂质体制剂主要集中在改善药代动力学和肿瘤积累上，但没有直接解决这些适应性耐药机制。这些适应性反应体现了一个基本的药理学难题，即细胞毒性抑制无法实现持久的网络重编程。克服这一限制需要从基于占据的抑制转向基于事件的调节，即选择性地消除与疾病相关的蛋白质，而不是暂时阻断它们。靶向蛋白质降解提供了一种方法，利用内源性蛋白水解系统实现信号通路的可持续、可编程调节[11]、[12]。当与常规化疗结合时，降解在信号水平上起作用，而细胞毒性剂在代谢水平上起作用，从而形成一种机制互补的治疗逻辑，而不仅仅是简单的叠加组合。这一理念促使我们研究选择性降解关键信号相关调节因子是否可以重新编程代谢信号，从而改善5-FU的整体药效。
在涉及CRC的细胞外调节因子中，富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（LRG1）已被证明是一种多功能的肿瘤进展调节因子[13]、[14]、[15]、[16]。LRG1通过涉及缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）和信号转导子和转录激活因子3（STAT3）的途径促进血管生成、代谢适应和转移[17]、[18]、[19]。它的细胞外定位使其能够作为肿瘤微环境与细胞内代谢控制之间的中介[20]、[21]、[22]、[23]。除了这些生物学作用外，我们之前的工作还发现LRG1是靶向递送的分子锚点，因为LRG1结合的纳米药物在CRC组织中选择性地积累，同时最小化脱靶毒性[13]、[24]。基于这些发现，我们分析了转录组数据集，并发现了LRG1与TYMS表达之间的强烈正相关关系。实验进一步证实了这一关系：在鼠CRC细胞系（MC38和CT26）中沉默LRG1与TYMS水平降低和5-FU诱导的细胞毒性增强相关。机制研究表明，这种调节涉及PI3K-AKT-mTOR信号通路，表明调节细胞外信号可能与细胞内核苷酸代谢的变化以及5-FU基化疗的功能效率提高有关。
鉴于LRG1在协调信号和代谢反应中的潜在作用，选择性地调节或消除这种细胞外调节因子代表了一种重新编程细胞反应网络的直接策略。最近在溶酶体靶向降解方面的进展使得这种调节成为可能。靶向溶酶体的嵌合物（LYTACs）利用受体介导的内化将结合的蛋白质导向溶酶体降解[25]、[26]、[27]。然而，传统的LYTACs通常需要复杂的连接子优化，并且肿瘤选择性有限，限制了它们的转化潜力。为了解决这些挑战，我们设计了一种脂质体溶酶体靶向纳米嵌合物（Lipo-EM），该嵌合物与LRG1结合的ET肽和甘露糖-6-磷酸（M6P）共同修饰，以结合阳离子独立的甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）[28]、[29]、[30]。这种模块化设计实现了受体介导的内化和LRG1的溶酶体降解，这与PI3K-AKT-mTOR信号通路的减弱和TYMS表达的降低相关。从概念上讲，这种方法表明靶向降解可以作为重塑细胞内信号和协调化疗干预的代谢活动的可控手段。
作为概念验证，我们将5-FU整合到同一纳米平台上，构建了一个双功能系统Lipo-EM@5-FU，将LRG1靶向降解与5-FU化疗结合，以实现基于降解的化学增敏框架。在这个框架中，LRG1的降解与上游信号通路的减弱和TYMS表达的降低相关。同时，共同递送的5-FU进一步抑制了其酶活性，导致细胞周期停滞和凋亡（图1）。值得注意的是，在相同的药物剂量下观察到了这种增强的效果，表明这种改善不能仅归因于递送效率；相反，它可能与信号调节和化疗的联合效应有关。在携带MC38肿瘤的小鼠中，Lipo-EM@5-FU表现出较长的循环时间、选择性的肿瘤积累和强大的抗肿瘤效果，并且系统毒性最小。这些发现共同建立了一种基于降解的化学增敏协调机制，其中靶向蛋白质降解不仅作为蛋白质清除的手段，还作为一种可编程的策略，用于重新配置治疗反应，为协同作用、低毒性的纳米医学提供了一个通用的设计框架。
部分摘录
LRG1敲低可降低结直肠癌细胞中的TYMS表达并提高5-FU敏感性
为了探索LRG1在CRC中的生物学作用，我们首先评估了其临床意义。对公开可用的转录组数据集的分析显示，CRC组织中的LRG1水平显著高于相邻的正常黏膜（图1a）。重要的是，Kaplan–Meier生存曲线表明，LRG1水平升高的患者无复发生存期明显较短（图1b），这建立了LRG1上调与较差临床结果之间的联系。
讨论
在这项研究中，我们开发了Lipo-EM，这是一种靶向溶酶体的双特异性纳米嵌合物，旨在调节与结直肠癌治疗相关的信号通路和代谢通路。基于目前对LRG1作为多功能细胞外调节因子的理解，我们的结果表明，沉默LRG1改变了细胞内核苷酸代谢（图1e-g）并增强了5-FU的药效反应（图1l-m）。该系统不仅依赖于酶抑制
结论
总之，我们发现LRG1是一个先前未被认识的功能调节因子，与TYMS表达相关，并且是CRC中5-FU敏感性的决定因素。LRG1的耗竭与PI3K-AKT-mTOR通路的抑制和TYMS表达的降低有关，这可能有助于提高5-FU的细胞毒性。基于这一机制，我们开发了一种靶向溶酶体的双特异性脂质体纳米嵌合物（Lipo-EM@5-FU），将LRG1的选择性细胞外降解与5-FU结合
材料
5-氟尿嘧啶（5-FU）、胆固醇和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）从Adamas（上海，中国）购买，无需进一步纯化。丙炔基甘氨酸修饰的ESYSAKHRIMLT肽（alkynyl-ET；纯度≥95%）来自安徽国平药业有限公司。DSPE-PEG????-Cy5和DSPE-PEG????-叠氮化物从Ponsure Biotechnology（上海，中国）购买。Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和磷酸盐缓冲液（PBS）也是从那里购买的
CRediT作者贡献声明
吴刚：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，研究，资金获取。张可娟：撰写 – 原稿，可视化，方法学，研究。闵欢：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，资金获取，概念化。杜林：软件，研究，数据管理。李俊尧：方法学，研究。李文正：研究。张银龙：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32371524和32201240）、河南省卫生健康委员会（SBGJ202502008、LHGJ20230024）以及河南省科技研发计划联合基金（235200810080）的支持。作者感谢中国郑州大学高级分析与基因测序中心的技术支持。
