抑制HDAC3表达可缓解高葡萄糖引起的感光细胞凋亡和氧化应激

《Journal of Diabetes Research》：Inhibition of HDAC3 Expression Alleviates High–Glucose-Induced Photoreceptor Cell Apoptosis and Oxidative Stress

　　摘要

背景
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的眼部并发症，是工作年龄人群失明的主要原因之一。其发病机制主要与血液-视网膜屏障的破坏、炎症、视网膜神经元损伤、氧化应激以及遗传免疫因素有关。本研究旨在阐明组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）在DR相关视网膜神经元损伤中的作用及其潜在机制。

方法
在本研究中，通过腹腔注射溶解在柠檬酸钠缓冲液中的链脲佐菌素（STZ）诱导小鼠糖尿病模型。在4周、8周和12周时，使用苏木精-伊红染色观察视网膜和感光细胞层的厚度，并通过免疫组化染色评估小鼠视网膜中HDAC3的表达情况。在体外实验中，661W细胞在高糖条件下培养以模拟糖尿病环境。为了研究HDAC3的作用，使用特异性抑制剂RGFP966或HDAC3特异性小干扰RNA（HDAC3-siRNA）抑制其表达。随后检测氧化应激和凋亡水平，以分析HDAC3影响感光细胞损伤的机制。

结果
随着糖尿病持续时间的延长，视网膜层和感光细胞层的厚度变薄，视网膜中HDAC3的表达增加。在体外实验中，高糖处理的661W细胞中HDAC3的表达、凋亡和氧化应激均增加。重要的是，使用RGFP966或HDAC3-siRNA抑制HDAC3可有效减轻这些细胞中的高糖诱导的凋亡和氧化应激。

结论
我们的结果表明，HDAC3与DR感光细胞的凋亡和氧化应激有关，抑制HDAC3可以减少DR感光细胞的凋亡和氧化应激。这提示HDAC3抑制剂的表观遗传疗法可能在DR的预防和治疗中具有治疗价值。

1. 引言
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病（DM）最常见的神经和微血管并发症之一，是全球工作年龄成人视力障碍和失明的主要原因[1, 2]。过去几十年中，由于社会经济发展和生活方式的变化等多种因素，糖尿病的全球患病率有所上升[3–5]。DR是一种多因素疾病，其发病机制复杂[6]。虽然传统上被认为是一种以视网膜血管异常为特征的微血管疾病[7]，但其病理特征还包括血液-视网膜屏障通透性增加、周细胞和内皮细胞丢失、基底膜增厚、毛细血管灌注不足以及由视网膜缺血和缺氧引起的新生血管形成[8, 9]。历史上，对DR的研究主要集中在血管异常上。最近的研究提供了越来越多的证据表明，DR不仅是一种微血管疾病，还涉及视网膜神经退行性变化[10]。此外，视网膜神经退行性变化可能在可检测到的微血管损伤之前就已经发生[11–14]。DR相关神经退行性的临床表现包括暗适应延迟、对比敏感度降低和色调辨别能力受损[15]。感光细胞作为最丰富且代谢活跃的特殊神经元细胞，对光信号转导和视觉功能成像至关重要[16, 17]。目前的研究表明，DR的严重程度和视觉障碍与感光细胞层的变化有关[18]，包括感光细胞的形态萎缩、功能障碍和凋亡[19]。利用光学相干断层扫描（OCT）和光学相干断层扫描血管成像（OCTA）的研究显示，无DR的糖尿病患者的神经血管单元也受到了损伤[20]。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类调节染色质结构的酶，在调控基因表达、细胞增殖、凋亡、迁移、分化和氧化应激及炎症中起着关键作用[21, 22]。哺乳动物有四种HDACs，大量证据表明它们参与了糖尿病及其并发症的发病机制[23]。特别是HDAC3最近被发现在多种糖尿病并发症中起作用，包括糖尿病性肝病、主动脉粥样硬化、骨质疏松症、心肌病和肾病[24–27]。同时，HDAC3在眼部疾病（如DR和视神经损伤）中也起着重要作用。在急性视神经损伤模型中，HDAC3的表达与视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡有关，抑制HDAC3表达具有神经保护作用[28]。在糖尿病小鼠的视网膜组织中观察到HDAC3表达升高。抑制HDAC3表达已被证明可以减缓DR的进展，并减少由DR激活的凋亡和氧化应激[29]。研究发现，db/db小鼠的RGCs中HDAC3表达增加，并与细胞凋亡和自噬呈正相关[30]。这些发现表明HDAC3是影响DR中视网膜细胞氧化应激和凋亡的重要因素。然而，DR进展过程中感光细胞的特定病理变化，以及HDAC3是否以及如何调节感光细胞的病理生理过程，仍大部分尚未探索。在本研究中，我们旨在探讨HDAC3在DR相关视网膜神经退行性变中的作用及其机制。利用糖尿病小鼠模型和高糖条件下培养的661W感光细胞，我们研究了HDAC3表达对氧化应激和凋亡的影响。通过选择性抑制剂和siRNA抑制HDAC3，我们试图确定其作为治疗靶点的潜力。我们的发现可能为基于表观遗传学的DR预防和治疗策略提供新的见解。

2. 方法
2.1. 糖尿病小鼠模型的构建
选择同一批无眼病和内分泌疾病的SPF C57BL/6小鼠，并随机分为对照组和DM组。所有小鼠在开始后续操作前在动物中心适应1周。对照组喂食标准维持饮食。DM组腹腔注射链脲佐菌素（STZ）柠檬酸钠溶液（剂量：0.05 mL/10 g体重），并维持高糖饮食（66.5%标准维持饮食+ 10%猪油+ 20%蔗糖+ 2.5%胆固醇+ 1%胆酸钠）。所有小鼠置于受控环境条件（温度：21°C；湿度：60%；12小时光照/黑暗周期），自由摄取食物和水。定期监测体重和血糖水平（通过尾静脉采样）。本研究中的所有动物实验均获得了南方医科大学珠江医院医学伦理委员会的批准（LAEC-2023-172），并遵循赫尔辛基宣言的指导原则。
2.2. 小鼠视网膜的苏木精-伊红（HE）染色
从每组小鼠中随机采集视网膜组织。标本固定后包埋在石蜡中，切片厚度为4 μm。脱蜡和复水后，使用标准方案用HE染色，在光学显微镜下评估组织病理形态。分析每个区域距视神经相同距离的三个切片的图像，以量化视网膜的总厚度和感光细胞层的厚度。
2.3. 小鼠视网膜的免疫组化染色
从每组小鼠中随机选取视网膜组织。石蜡包埋的组织切片厚度为4 μm。脱蜡和复水后，用柠檬酸钠缓冲液微波加热20分钟进行抗原修复。切片用PBS清洗三次。随后，将切片在4°C下与HDAC3抗体（1:200）孵育过夜。之后，切片用PBS清洗三次（每次5分钟）。根据制造商的说明使用DAB底物试剂盒可视化免疫反应，并在显微镜下仔细监测显色时间。最后，用苏木精复染3分钟，然后清洗、脱水、用二甲苯透明处理，并用盖玻片封片。在光学显微镜下观察染色切片，分析每个区域距视神经相同距离的三个切片中HDAC3的表达。
2.4. 细胞培养和处理
661W细胞系购自无锡新润生物技术有限公司，并通过了短串联重复序列（STR）检测。661W细胞在含有4.5 g/L（24.5 mM）葡萄糖的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养，并添加10%热灭活的胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素溶液。实验中，661W细胞在24.5 mM葡萄糖（对照组）中培养或在55 mM葡萄糖（HG组）中培养，两组均在37°C、5% CO2和70%-80%湿度下培养。实验在细胞融合度达到80%-90%时进行。
2.5. CCK-8细胞计数试剂盒检测
使用CCK-8评估661W细胞的存活率。将细胞以每孔5 × 10^3个细胞的密度接种到96孔板中，每个实验组重复五个孔。处理48小时后，分别加入90 μL培养基和10 μL CCK-8溶液，在37°C下培养2小时。使用酶标记仪器测量450 nm处的光密度，并记录和分析数据。
2.6. 实时PCR
使用Trizol试剂从661W细胞中分离总RNA。通过superscript first strand synthesis系统反转录cDNA。然后使用Power SYBRGreen PCR MasterMix进行定量PCR。引物序列如下：HDAC3（Fwd: 5′-GGCGACCATGACAACGACAAG; Rev: 5′-CATACTTTCCTTCCCACCACAGAG），β-actin（Fwd: 5′-TGGCACCACACCTTCTACAATGAG; Rev: 5′-GAGGCATACAGGGACAGCACAG），Bcl-2（Fwd: 5′-CCAGAGGTCTCAGAGAACAGGATG; Rev: 5′-TCTTGGCACCAYAGCAGCACAG），Bax（Fwd: 5′-ATGGGCTGGACACTGGA; Rev: 5′-GGTGAGCGAGGCGGTGAG），Caspase-3（Fwd: 5′-GGCGACTTCCTGTATGCTTACTC; Rev: 5′-CGACCCGTCCTTTGAATTTCTCC）。
2.7. 西部印迹
从感光细胞和小鼠视网膜组织中提取总蛋白。使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（KeyGEN，中国）定量蛋白浓度。等量的蛋白（每条泳道20 μg）通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（Merck Millipore）。电泳后，膜在室温下用5% BSA封闭1小时。然后在4°C下与以下一级抗体孵育过夜：HDAC3（1:1000，Affinity，美国），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（1:1000，Fude Biotechnology，杭州，中国），Bcl-2（1:1000，Aibotaike Biotechnology，武汉，中国），Bax（1:1000，Abmart，上海，中国），Caspase3（1:1000，Aibotaike Biotechnology，武汉，中国）。膜用0.1% TBST清洗三次，然后在室温下与二级抗体孵育1小时。最后使用ECL-plus western blotting检测系统可视化蛋白条带。使用ImageJ软件分析每个蛋白条带的表达。GAPDH的表达作为内部对照。
2.8. RGFP966溶液的制备
RGFP966是一种高选择性的HDAC3抑制剂，溶解在二甲基亚砜（DMSO）中。通过向1.37 mL DMSO中加入5 mg RGFP966制备15 mM储备溶液，然后超声搅拌以确保完全溶解。溶液分装并储存在-80°C。使用前，将一份溶液在4°C解冻并稀释至所需的工作浓度。为了考虑溶剂的潜在影响，在实验中还包括一个额外的对照组（HG + DMSO），其中细胞暴露于含有等体积DMSO的高糖培养基中。
2.9. siRNA转染
661W细胞在培养板上接种24小时。使用HDAC3特异性siRNA（储备浓度：50 μM）进行瞬时转染。每次转染时，将4 μL siRNA稀释在200 μL jetPRIME缓冲液中，与4 μL jetPRIME转染试剂（Polyplus-transfection S.A.，Illkirch，法国）混合，按照制造商的说明进行孵育。48小时转染后，收集细胞用于后续实验。
2.10. 过氧化甲醛（MDA）含量的测定
使用商业MDA测定试剂盒测量661W细胞中的MDA含量。根据制造商的说明，通过超声裂解细胞。然后用多功能微孔板读数器在532 nm和600 nm处测量吸光度，并根据这两个波长的吸光度差异计算MDA浓度。
2.11. 总超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定
使用商业SOD测定试剂盒测定661W细胞中的SOD活性。根据制造商的协议，通过超声裂解细胞。使用多功能微孔板读数器在450 nm处测量吸光度来测定SOD活性。
2.12. 活性氧（ROS）的检测
将对数生长阶段的661W细胞接种在玻璃盖玻片上。使用基于二氢乙硫（DHE）的ROS测定试剂盒测量细胞内ROS水平，DHE可渗透活细胞并被ROS氧化产生红色荧光。染色完成后，将一滴不含DAPI的抗荧光衰减密封剂滴在玻璃载玻片上，然后将带有细胞的盖玻片倒置放置在培养基上。装片的样本在成像前被放置在黑暗且湿润的培养箱中。图像立即使用尼康倒置显微镜收集并进行分析。

2.13. 通过流式细胞术评估细胞凋亡

细胞凋亡使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行评估。根据试剂盒说明，向661W细胞悬浮液中加入5 μL Annexin V-FITC试剂和5 μL PI试剂（50 μg/mL）。轻轻搅拌混合后，细胞在室温下避光孵育15-20分钟。随后立即进行流式细胞术分析（FITC通道用于Annexin V-FITC，PerCP通道用于PI）。记录数据并进行分析。

2.14. 统计分析

所有实验均独立重复三次。结果使用GraphPad Prism 8（Graphpad公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行统计分析和绘图。数据以平均值±标准差表示。使用Student's t检验或单因素方差分析（ANOVA）比较组间差异。统计学上显著的差异定义为?p < 0.05、??p < 0.01、???p < 0.001和????p < 0.0001。

3. 结果

3.1. 糖尿病小鼠整个视网膜层和感光细胞层的厚度变化

在STZ注射前，对照组和糖尿病组（DM组）之间体重或血糖水平没有显著差异（图1a,b）。连续五天进行腹腔内STZ注射并采用高糖饮食两周后，糖尿病组的平均体重显著降低，随机血糖水平显著升高，超过了糖尿病的诊断阈值（> 16.7 mmol/L）（图1c,d）。糖尿病小鼠还表现出多食、多饮和多尿的症状。这些发现共同证实了糖尿病小鼠模型的成功建立。

3.2. 糖尿病小鼠视网膜中的HDAC3表达上调

免疫组化分析显示，在建模后4周时，对照组和糖尿病组视网膜中的HDAC3表达没有显著差异（图3a）。然而，在建模后8周和12周时，糖尿病组的HDAC3表达显著增加（图3b,c）。这些结果表明，随着糖尿病的发展，视网膜中的HDAC3表达逐渐升高。

3.3. 高葡萄糖条件下661W细胞中的HDAC3表达上调

为了评估高葡萄糖条件下感光细胞中的HDAC3表达，将661W感光细胞分为对照组和高葡萄糖组（HG组）。HG组细胞在高葡萄糖培养基中培养48小时以模拟体外糖尿病微环境。qRT-PCR分析显示，HG组中的HDAC3 mRNA表达显著增加（图4a）。Western blot分析也证实，高葡萄糖处理48小时后HDAC3蛋白表达显著上调（图4b）。

3.4. 高葡萄糖条件促进661W细胞凋亡

视网膜细胞的凋亡是糖尿病性视网膜病变（DR）发生和发展的重要机制。首先，我们使用CCK-8检测方法评估了不同时间点对照组和HG组661W细胞的存活率。结果显示，高葡萄糖刺激48小时后，HG组的细胞存活率显著降低（图5a）。基于这一发现，后续实验选择了48小时的处理时间。

3.5. 高葡萄糖条件增强661W细胞中的氧化应激

氧化应激在糖尿病性视网膜病变过程中起关键作用，并促进疾病进展。MDA、SOD和ROS是反映细胞内氧化应激程度的重要指标。为了评估高葡萄糖条件下661W细胞中的氧化应激程度，我们测量了MDA含量、SOD活性和ROS水平。高葡萄糖处理48小时后，HG组的MDA含量显著升高（图6a），而总SOD活性显著降低（图6b）。ROS荧光染色显示HG组的红色荧光强度更强，表明细胞内ROS水平较高（图6c）。这些结果共同表明，高葡萄糖处理在661W细胞中诱导了显著的氧化应激。

3.6. RGFP966在高葡萄糖条件下抑制661W细胞凋亡

RGFP966是一种高选择性的HDAC3抑制剂，能够有效且选择性地抑制HDAC3的表达。为了研究HDAC3在高葡萄糖介导的细胞凋亡中的作用，将661W细胞分为四组：对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组。qRT-PCR和Western blot分析证实，HG+RGFP966组中的HDAC3表达显著下调（图7a,b）。CCK-8检测显示，HG+RGFP966组的细胞存活率显著降低（图8a）。流式细胞术结果显示，HG+RGFP966组的总凋亡率以及早期和晚期凋亡率均显著升高。进一步分析发现，Caspase-3和Bax的mRNA表达在高葡萄糖条件下显著上调，而Bcl-2的mRNA表达下调（图5c）。Western blot分析证实，HG组中Caspase-3和Bax蛋白水平显著升高，而Bcl-2蛋白表达显著降低。

3.7. RGFP966在高葡萄糖条件下减轻661W细胞的凋亡

RGFP966在高葡萄糖条件下显著抑制661W细胞的凋亡。图8 在图形查看器中打开 PowerPoint

抑制HDAC3活性降低了661W细胞的凋亡水平。(a) 通过CCK8检测法测定对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组中661W细胞的存活率。(b) 通过流式细胞术检测对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组中661W细胞的凋亡水平。计算了每组的总凋亡率，并绘制了条形图。(c) 通过qPCR检测对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组中661W细胞中Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA的相对表达。(d) 通过Western blotting检测对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组中661W细胞中Caspase3、Bcl-2和Bax的相对蛋白表达。内部参考蛋白为GAPDH，使用ImageJ软件绘制条形图以量化三个独立实验中Caspase3、Bcl-2和Bax蛋白的相对表达。n = 3。ns表示无显著性，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。qRT-PCR的结果显示，高葡萄糖暴露显著上调了HG组和HG+DMSO组中Caspase-3和Bax mRNA的表达，并下调了Bcl-2的表达。RGFP966的作用缓解了这些效应，表现为HG+RGFP966组中Caspase-3和Bax mRNA水平降低以及Bcl-2表达增加（图8c）。Western blot结果进一步在蛋白质水平上证实了这些趋势（图8d）。总体而言，这些结果表明RGFP966抑制HDAC3可以减轻661W细胞中的高葡萄糖诱导的凋亡。

3.7. RGFP966在高葡萄糖条件下减轻661W细胞的氧化应激

我们将661W细胞分为对照组、HG组、HG+RGFP966组和HG+DMSO组。细胞黏附后，各组分别处理48小时再进行后续检测。MDA检测显示，HG组和HG+DMSO组的MDA含量显著高于对照组，而HG+RGFP966组的MDA含量显著降低（图9a）。相反，SOD活性在HG组和HG+DMSO组显著降低，但在HG+RGFP966组升高（图9b）。ROS荧光染色进一步支持了这些发现：HG组和HG+DMSO组的红色荧光强度比对照组更强，表明细胞内ROS水平升高。相比之下，HG+RGFP966组的荧光强度明显减弱，表明HDAC3抑制有效抑制了高葡萄糖诱导的ROS积累（图9c）。这些结果表明，RGFP966介导的HDAC3抑制在高葡萄糖条件下减轻了661W细胞的氧化应激。

3.8. HDAC3敲低在高葡萄糖条件下661W细胞中的凋亡

为了进一步验证HDAC3的作用，我们使用HDAC3特异性siRNA敲低了661W细胞中的HDAC3表达。细胞被分为对照组-siRNA组和HDAC3-siRNA组，并在高葡萄糖条件下培养。通过qRT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白质水平上验证了HDAC3的成功敲低（图10a,b）。

HDAC3-siRNA成功下调了661W细胞中的HDAC3表达。(a) 通过qPCR检测对照组-siRNA组和HDAC3-siRNA组中661W细胞中HDAC3 mRNA的相对表达。(b) 通过Western blotting检测对照组-siRNA组和HDAC3-siRNA组中661W细胞中HDAC3的相对蛋白表达。内部参考蛋白为GAPDH，使用ImageJ软件绘制条形图以量化三个独立实验中HDAC3蛋白的相对表达。n = 3，ns表示无显著性，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。CCK-8检测显示，在高葡萄糖暴露48小时后，HDAC3-siRNA组的细胞存活率显著高于对照组-siRNA组（图11a）。流式细胞术分析显示，HDAC3-siRNA组的总凋亡率以及早期和晚期凋亡率均显著低于对照组-siRNA组（图11b）。

3.9. HDAC3敲低在高葡萄糖条件下661W细胞中的氧化应激

为了进一步验证HDAC3在高葡萄糖诱导的氧化应激中的作用，我们将661W细胞转染对照siRNA或HDAC3-siRNA，并在高葡萄糖条件下培养。HDAC3-siRNA组的MDA含量显著低于对照组-siRNA组（图12a）。相反，HDAC3敲低后SOD活性显著增加（图12b）。ROS荧光染色也显示HDAC3-siRNA组的红色荧光强度明显降低，表明细胞内ROS水平相对对照组降低（图12c）。这些结果表明，HDAC3敲低有效减轻了高葡萄糖条件下661W细胞的氧化应激。

4. 讨论

糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的并发症之一，其发病机制非常复杂且多因素，尚未完全阐明。过去几年的研究主要集中在DR的血管异常上。然而，越来越多的证据表明视网膜神经退化对疾病进展具有关键作用。大量研究表明，氧化应激和细胞凋亡在DR的发病机制和进展中起着重要作用，是视网膜神经退化和血管功能障碍的核心事件，并与疾病的发展和进展密切相关[31]。一项研究通过STZ诱导建立了糖尿病大鼠模型，并通过电子显微镜观察视网膜组织。结果显示，在建模后4周就出现了散在的光感受器细胞凋亡，12周和24周时凋亡现象更为明显。然而，其潜在机制仍不清楚[32]，且关于DR中光感受器病理及其相关分子机制的研究仍然有限。在本研究中，我们建立了糖尿病小鼠模型并对视网膜切片进行了HE染色。我们观察到，在糖尿病诱导后8周和12周，糖尿病小鼠整个视网膜层和光感受器层的厚度显著减小，伴有结构紊乱。这些结果不仅证实了光感受器在DR进展中的作用，还强调了阐明其在疾病病理生理学中的具体作用的必要性。HDAC是一类通过调节染色质结构和基因表达来介导表观遗传修饰的酶[33]。其中，HDAC3定位于细胞核和细胞质中，已被发现参与多种生理和病理过程。研究表明，HDAC3与多种疾病有关，包括癌症、炎症、代谢性疾病和神经退行性疾病[34–36]，通过调节细胞增殖、凋亡、血管生成、转移和抗肿瘤耐药性等关键细胞过程[37]。近年来，HDAC3在糖尿病及其并发症中的作用受到越来越多的关注。在DR模型中报告了HDAC3表达升高[38, 39]。一项动物研究发现，DR小鼠的视网膜中HDAC3水平升高，同时伴有氧化应激和凋亡增加。使用HDAC3特异性抑制剂RGFP966处理后，HDAC3表达降低，DR小鼠的视网膜氧化应激、炎症和凋亡得到改善。这些发现表明HDAC3与DR的病理过程密切相关，抑制HDAC3表达可以减轻DR相关的损伤[40]。Lundh等人证明，许多HDAC，特别是经典的I类HDAC，参与了神经退化。他们还发现HDAC家族成员在细胞因子诱导的凋亡中具有不同的调节作用，I类HDAC抑制剂可以减轻细胞因子介导的损伤，而II类抑制剂则没有这种效果。进一步的研究表明，只有敲除HDAC1或HDAC3才能有效减少凋亡。表观基因组分析表明，特异性敲除HDAC3基因会影响NF-κB与iNOS启动子的结合。这些发现强调了HDAC3作为凋亡关键调节因子的显著且独特的作用[41, 42]。进一步的研究表明，抑制HDAC3能有效保护视网膜神经节细胞（RGCs）免受损伤。后续在活体小鼠中的实验表明，HDAC3使细胞在受伤后更快地启动内在凋亡程序。为了解决难以在体内研究的机制问题，研究团队使用661W细胞作为体外模型，发现HDAC3通过激活JNK信号通路和上调p53靶基因PUMA来触发BAX/BAK的激活和内在凋亡。他们的结果为我们的工作提供了宝贵的见解[28]。这些综合结果表明HDAC3在DR发病机制中的核心作用，并支持其作为治疗靶点的潜力。DR的病理机制极其复杂，尚未完全阐明。大量研究表明，氧化应激和凋亡在DR的发病机制和进展中起着关键作用，对视网膜神经退化和血管功能障碍都有重要影响[31, 43, 44]。为了进一步阐明高血糖条件下HDAC3与光感受器细胞中的氧化应激和凋亡之间的关系，我们在体外模型中用高葡萄糖处理661W细胞。我们的结果显示，在高葡萄糖条件下，661W细胞中的HDAC3表达显著上调，这与糖尿病小鼠的体内发现一致。此外，HG组中661W细胞的存活率显著降低，总凋亡率和各阶段的凋亡率也增加。这通过凋亡标志物Caspase-3和Bax的上调以及抗凋亡标志物Bcl-2的下调得到证实。此外，我们还观察到氧化应激标志物（包括MDA和ROS）水平升高，以及SOD总活性降低。这些体外结果表明，在高葡萄糖条件下，光感受器细胞中的HDAC3表达显著上调，并与凋亡和氧化应激的程度呈正相关。为了进一步验证我们的假设，我们使用了HDAC3抑制剂RGFP966，并使用HDAC3-siRNA敲低661W细胞中的HDAC3表达。研究结果表明，降低HDAC3的表达水平可以在高葡萄糖条件下显著提高细胞存活率。这种干预措施还显著降低了整体凋亡率和特定阶段的凋亡率。此外，我们观察到凋亡标志物Caspase-3和Bax的表达下调，而抗凋亡标志物Bcl-2的表达上调。同时，氧化应激标志物MDA和ROS的水平降低，而SOD的总活性增加。上述结果表明，减少HDAC3的表达可以减轻光感受器细胞在高葡萄糖条件下的凋亡和氧化应激。这一证据支持HDAC3在光感受器细胞病理过程中的关键作用。总之，我们的研究证实了在高葡萄糖条件下，HDAC3与光感受器细胞的凋亡和氧化应激呈正相关。抑制HDAC3的表达可以有效减轻661W细胞因高葡萄糖引起的凋亡和氧化应激，提示HDAC3可能是治疗光感受器细胞损伤的潜在靶点。这为早期干预和治疗糖尿病性视网膜病变（DR）提供了新的方法。然而，我们的研究也存在一些局限性：仅在糖尿病小鼠的选定时间点检查了视网膜病变情况，并且HDAC3与氧化应激/凋亡相关因素之间的关联尚未通过体内实验得到验证；HDAC3抑制的保护作用也尚未在体内得到证实；此外，HDAC3调节凋亡和氧化应激的具体分子机制仍需进一步研究。在未来的研究中，我们将通过进行额外的体内动物实验（包括HDAC3敲低实验）并观察MDA和SOD等氧化应激标志物的变化，来加强细胞研究与动物实验之间的联系，并结合更全面的时间进程分析和体内模型，以阐明HDAC3介导的细胞过程的详细机制。HDAC3是一种在细胞中广泛分布的HDAC蛋白，抑制其表达可以对视网膜神经细胞损伤起到保护作用。我们查询了单细胞RNA测序数据库，发现HDAC3在人类视网膜中的多种细胞类型中都有表达，包括锥形光感受器细胞、杆状光感受器细胞、双极细胞、水平细胞、Müller胶质细胞和RGCs。目前的实验研究仅集中在光感受器细胞上。在后续研究中，可以收集一些糖尿病性视网膜病变的样本，以验证HDAC3在视网膜细胞类型中的具体定位。

5. 结论
我们的研究表明，在高葡萄糖条件下，661W细胞中的HDAC3表达上调，氧化应激和凋亡水平增加。抑制或敲低HDAC3能有效减轻这些病理过程。这些发现表明，靶向HDAC3可能为缓解糖尿病性视网膜病变中的光感受器细胞损伤提供一种有前景的治疗方法。

作者贡献
概念设计与研究：冯松福、凌琳
数据收集：方琪、李家丽
数据分析和解释：马玉琳、刘家琪、林秋霞
文章起草：方琪
重要内容的审稿：刘宝义
方琪、李家丽和刘宝义对这项研究做出了同等贡献，应共同作为第一作者。

致谢
作者无需报告任何利益冲突。

资助
本研究得到了珠江医院院长基金会（yzjj2023ms19）和广州市科技计划基础与应用基础研究项目（编号202201020008和2023A03J0584）的支持。

伦理声明
本研究遵循了《赫尔辛基宣言》的原则，并获得了南方医科大学珠江医院医学伦理委员会的批准（参考编号：LAEC-2023-172）。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
本研究使用和分析的数据集和模型可向相应作者提出合理请求后获取。