《The FEBS Journal》：Long-read sequencing-based atlas of tissue-specific expression of DNM1L transcript variants
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动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1, Drp1）由DNM1L基因编码，对线粒体分裂至关重要，但由于可变剪接产生的异构体特异性效应，其功能作用仍不清楚。短读长RNA测序无法解析涉及远距离外显子的全长异构体，限制了我们的理解。在此，
动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1, Drp1）由DNM1L基因编码，对线粒体分裂至关重要，但由于可变剪接产生的异构体特异性效应，其功能作用仍不清楚。短读长RNA测序无法解析涉及远距离外显子的全长异构体，限制了我们的理解。在此，研究人员应用靶向长读长测序技术，对人左心室和诱导多能干细胞衍生的心肌细胞中的全长DNM1L转录本进行谱分析，恢复了所有注释的异构体，其表达模式保守，其中异构体1–4最为丰富。功能实验表明，异构体的丰度并不能预测其酶活性。将研究扩展到六种不同小鼠组织，研究人员发现了独特的、组织富集的表达谱。在Drp1敲除（knockout, KO）的小鼠胚胎成纤维细胞中进行的挽救实验显示了线粒体分裂的异构体依赖性差异。缺乏A-插入（A-insert）的异构体能强力挽救线粒体分裂，对于同时缺乏B-插入（例如异构体b）的变异体观察到最大活性，这与外显子3在Drp1活性中的调节作用一致。这项跨物种图谱整合了长读长转录组学与功能验证，揭示了异构体多样性如何支撑组织特异性的线粒体动力学和Drp1的生理作用。
研究背景与立题依据
线粒体是真核细胞内通过氧化磷酸化产生能量的核心细胞器，其形态处于融合与分裂的动态平衡中。动力相关蛋白1（Dynamin-related protein 1, Drp1）是该平衡的关键调节因子，主要驱动线粒体分裂。尽管Drp1的重要性已确立，但其确切机制仍不明确，这主要归因于其异构体（isoform）多样性带来的知识缺口。在人类中，DNM1L基因通过外显子3（编码GTP酶结构域）及外显子16、17（编码可变结构域）的可变剪接产生了至少8种异构体；在小鼠中，Dnm1l基因则产生了20种异构体。既往研究表明这些异构体具有组织特异性表达模式，且不同的异构体在细胞增殖、凋亡敏感性及肿瘤生长中发挥不同作用。然而，主流的短读长RNA测序技术因依赖RNA片段化，难以精确解析涉及远端外显子的全长异构体结构，导致各异构体的真实表达水平及其在特定生理或病理条件下的功能长期未被阐明。此外，许多研究未能明确区分所涉及的异构体，或过度聚焦于特定异构体，导致了相互矛盾的发现，阻碍了针对Drp1的有效治疗策略开发。因此，利用能够保留全长RNA分子的长读长测序技术，系统性地绘制DNM1L/Dnm1l异构体的跨组织表达图谱，并解析其功能异质性，成为本研究的核心目标。该研究成果发表于《The FEBS Journal》。
主要关键技术方法
研究人员采用了多项关键技术以达成研究目的。首先，利用靶向纳米孔（Nanopore）原生条形码测序技术，结合优化的cDNA合成与扩增流程，实现了对人类和小鼠样本中DNM1L/Dnm1l全长转录本的高特异性捕获。其次，利用生物信息学手段对测序数据进行质控，包括唯一分子标识符（Unique Molecular Identifier, UMI）去重、覆盖度分析及与GTEx公共数据集的相关性验证，确保了异构体定量的准确性。在功能验证方面，研究结合了重组蛋白生化分析，测定不同Drp1异构体的寡聚状态、GDP结合亲和力及GTP酶活性；同时构建了Drp1敲除（KO）小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast, MEF）模型，通过稳定回补不同的小鼠Drp1异构体，评估其对线粒体分裂缺陷的挽救能力及线粒体形态学变化。样本来源包括人类诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）衍生的心肌细胞、悉尼心脏银行提供的人左心室组织以及来自圣文森特医院生物资源中心的多种小鼠组织。
研究结果
捕获人与小鼠组织中的全长DNM1L/Dnm1l转录本
研究人员建立了稳健的长读长测序流程，能够从微量总RNA起始，通过生物素化引物靶向扩增包含终止密码子前外显子21的转录本，并利用链霉亲和素磁珠纯化。质控分析显示，不同样本间的读长分布一致，模态长度对应于全长转录本。与GTEx数据库数据的强相关性（Pearson's R = 0.89）证实了该方法在异构体比例捕捉上的保真度。此外，研究还检测到了一些低表达的转录本，证明了该方法的灵敏度。跨物种比较显示，人左心室内特定的DNM1L异构体与小鼠心脏组织中的同源Dnm1l异构体表达高度相关，证实了生物学上的保守性。
人心肌细胞和心脏组织中DNM1L转录本变异的多样性
在对人iPSC衍生的心肌细胞和原代左心室组织的分析中，长读长测序成功捕获了所有注释的DNM1L异构体。异构体1、2、3和4在所有样本中表达最为丰富，而异构体7则持续低表达。主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）显示，iPSC衍生的心肌细胞与原代左心室样本略有分离，表明DNM1L的异构体组成与心脏组织身份及发育状态相关。生化分析进一步揭示，虽然异构体3、5和8表现出最高的GTP酶活性，但异构体1、2、4和6活性较低，这一发现明确表明转录本的丰度并不等同于其生化活性，强调了整合表达数据与功能表征的重要性。
原代小鼠组织中Dnm1l转录本变异的长读长RNA测序
在六种小鼠组织（脑、心、肾、肺、骨骼肌、脾）的分析中，研究人员鉴定了完整的22个NM（蛋白编码）、14个NR（非编码RNA）和1个XM（预测蛋白编码）转录本。PCA揭示了明显的组织特异性聚类，例如脑和脾位于不同区域，而富含上皮组织的肺和肾则聚在一起。热图和组织特异性指数（Tissue Specificity Index, TSI）分析量化了异构体的表达模式：异构体e、f、g和j在脑中高表达；异构体l和n在心脏中富集；异构体a和o则在骨骼肌中相对富集。此外，在db/db糖尿病模型小鼠的心脏组织中，Drp1在Ser616位点的磷酸化显著增加，而在脑中未见变化，这与心脏富集异构体的潜在活化相一致。
Drp1异构体对线粒体分裂的差异效应
利用Drp1 KO MEF模型，研究人员测试了四种小鼠异构体（b, d, e, o）挽救线粒体分裂缺陷的能力。结果显示，缺乏外显子3（A-insert）和外显子16/17（B-insert）的异构体b，能够最有效地恢复线粒体碎片化（fragmentation）。相比之下，包含外显子3的全长异构体e或仅缺乏B-insert的异构体o，其挽救能力较弱或不完全。自动化图像分析进一步支持了手动分类的结果，证实包含外显子2和/或3可能会抑制Drp1介导的线粒体分裂。这表明外显子3编码的A-insert在调节Drp1活性中起到了抑制作用。
结论与讨论总结
本研究通过长读长测序技术克服了短读长技术的局限，首次构建了跨物种的DNM1L/Dnm1l异构体表达图谱。研究发现，虽然异构体广泛表达，但特定的异构体组合呈现出组织富集特征，例如脑偏向含有外显子3的异构体，而心脏则偏好缺乏外显子3但含有外显子16的异构体。功能上，异构体丰度与酶活性无直接对应关系，且外显子3的包含与否是调控Drp1介导的线粒体分裂效率的关键开关。具体而言，缺乏A-insert（外显子3）的异构体表现出更强的裂变能力。这些发现不仅解释了既往关于Drp1在癌症和代谢疾病中作用的矛盾报道，也为针对特定异构体开发治疗神经退行性疾病、心血管疾病和癌症的药物提供了精准的分子靶点和理论依据。
