《Nature》：Vaccination generates broadly cross-neutralizing antibodies to the HIV Env apex
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作为一种慢性复制病毒，HIV进化出了极端的序列变异性，并通过宿主来源的聚糖（glycans）有效屏蔽了功能受限的刺突蛋白决定簇1。尽管罕见，但从HIV感染者体内可分离出广泛中和抗体（bNAbs），揭示了保守的包膜糖蛋白（Env）位点作为疫苗开发的关键靶点2–4
作为一种慢性复制病毒，HIV进化出了极端的序列变异性，并通过宿主来源的聚糖（glycans）有效屏蔽了功能受限的刺突蛋白决定簇1。尽管罕见，但从HIV感染者体内可分离出广泛中和抗体（bNAbs），揭示了保守的包膜糖蛋白（Env）位点作为疫苗开发的关键靶点2–4。其中一个靶点即为Env刺突的顶端（apex）。在此，研究人员确定了一种接种策略，该策略利用共价偶联至脂质体的异源HIV Env三聚体进行多价展示，结果在所有三聚体-脂质体免疫的非人灵长类动物（NHP）中诱导产生了交叉中和HIV血清抗体反应。至关重要的是，研究人员从多个猕猴中分离出单克隆抗体（mAbs），这些抗体能够交叉中和不同的HIV临床分离株。来自四只不同猕猴的单克隆抗体的高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构分析表明，它们以与人类感染诱导的、靶向顶端的广泛中和抗体PG9高度相似的方式靶向Env三聚体顶端，这代表了HIV疫苗开发的实质性进展。
论文解读：靶向HIV Env顶端的疫苗策略诱导非人灵长类产生广泛中和抗体
研究背景与立项依据
开发能够有效降低病毒传播的有效预防性HIV疫苗仍然是公共卫生领域的高度优先事项。然而，HIV在感染宿主内的慢性复制推动了免疫逃逸，使得疫苗开发极具挑战性。病毒表面唯一的 neutralizing 决定簇是三聚体包膜糖蛋白（Env）刺突，其已进化出通过结合宿主来源的N-聚糖并在复制过程中改变可变域来逃避宿主抗体反应的能力。广泛中和抗体（bNAbs）虽在HIV-1感染者中极少产生，但其能够穿透糖基屏障并共识别糖链屏蔽及潜在蛋白结构，从而揭示病毒的脆弱位点，其中包括Env三聚体顶端。其中，靶向顶端的bNAbs尤其引人关注，因为与其他HIV bNAbs相比，此类抗体通常需要较低水平的体细胞超突变（somatic hypermutation）即可获得广泛中和活性。先前的研究表明，嵌合猿猴-人类免疫缺陷病毒（SHIV）感染可在非人灵长类（NHP）中诱导产生靶向顶端的bNAbs，验证了猕猴作为评估旨在刺激此类反应的疫苗的合适模型。然而，复制型病毒感染引发的B细胞激活和一般免疫刺激与重组蛋白亚单位疫苗诱导的反应存在显著差异。亚单位疫苗接种是否能在动物模型中诱导出可比的靶向顶端的中和抗体反应，是迈向可转化的人类疫苗策略的重要第一步。
主要技术方法概述
本研究采用了多种前沿技术手段。研究对象为十二只成年印度起源的恒河猴（Macaca mulatta），分为两组进行免疫。关键技术包括：利用生物层干涉术（BLI）和差示扫描量热法（DSC）筛选并表征稳定的近天然柔性连接（NFL）Env三聚体；将三聚体共价阵列于合成脂质体上形成高多价免疫原；通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和钙流实验评估B细胞激活；采用流式细胞术分选Env特异性记忆B细胞并克隆单克隆抗体（mAbs）；利用电子显微镜多聚集体表位映射（EMPEM）分析血清多克隆抗体与三聚体的结合表位；最终通过高通量冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析抗体-三聚体复合物的高分辨率结构。
研究结果
Env与种系回复抗体的结合
研究人员首先筛选了一组原生样HIV Env三聚体，利用顶端靶向的bNAb RHA1及其推断的种系（IgL）回复变体来鉴定潜在的启动免疫原。基于其对成熟RHA1 bNAb的强效结合及对IgL RHA1 mAb的可检测结合，选择了Q23.17毒株来源的NFL稳定三聚体。为了增强B细胞启动，研究人员将Q23三聚体共价阵列于合成脂质体上。相较于可溶性三聚体，脂质体阵列化的Q23 NFL三聚体显示出更强的结合能力以及对小鼠初级B细胞的钙通量诱导能力，表明该多价阵列可能更有效地激活初始B细胞。
顶端交叉中和血清抗体
十二只NHP分别接种可溶性Q23 NFL三聚体或共价偶联至脂质体的Q23 NFL三聚体。结果显示，所有接种三聚体-脂质体组的NHP在第二次异源ZM233 NFL三聚体加强免疫后，均产生了针对Q23.17和ZM233M.6假病毒的自体中和抗体。EMPEM分析证实，这些血清IgG衍生的抗原结合片段（Fab）复合物在Q23 NFL三聚体上显示出结合密度，且主要集中在三聚体顶端。随后的异源三聚体（WITO.33, 001428-2.42等）加强免疫进一步扩大了交叉中和活性。在第六次免疫后的P6时间点，所有六只接种三聚体-脂质体的NHP的血清IgG对包含67种不同HIV-1毒株的病毒面板实现了超过49%的中和率，其中Q8和Q12个体分别中和了70%和64%的病毒。
疫苗诱导的单克隆抗体的中和作用
为了定义介导交叉中和的抗体特异性，研究人员从外周血单核细胞（PBMCs）中分选Env特异性记忆B细胞并分离单克隆抗体。通过分析具有V2顶端特征的mAbs，研究人员发现来自NHP Q12的抗体具有最广泛的活性和最强效力，特别是Q12BBM-069、Q12QBM-007和Q12BBM-023，它们分别中和了27、21和22种分离株。结构分析显示，这些mAbs的重链互补决定区3（HCDR3）较长且具有负电荷特征，这是顶端靶向bNAbs的典型标志。值得注意的是，部分疫苗诱导的mAbs能够克服Asn130聚糖的潜在空间位阻，实现对携带该聚糖的病毒的中和。
冷冻电镜揭示的Env顶端靶向
研究人员利用高分辨率冷冻电镜解析了四种mAbs（Q9M-023, Q10M-055, Q12BBM-069, Q12QBM-007）与NFL三聚体复合物的结构。结果显示，这些疫苗诱导的mAbs结合在BG505 NFL三聚体的四聚体表位上，与感染诱导的人源bNAb PG9的结合模式高度重叠。mAb-三聚体的相互作用主要由β-发夹结构的HCDR3环介导，该结构与所有三个原体（protomers）中Asn160位置的聚糖发生接触。去除Asn160聚糖的遗传修饰实验证实，该糖基是中和活性的关键决定因素。晶体结构分析进一步显示，在无配体状态下，这些mAbs的HCDR3环处于无序状态，而在结合三聚体时发生构象重排以容纳Env顶端的结构特征。
HIV Env V2表位图谱分析
通过对被Q12BBM-069中和的病毒Env C链（残基164–172）序列分析，研究人员确定了其特征序列为164-ELRDKKQKV-172。该V2序列在所用疫苗免疫原中高度代表。对于具有不同C链序列的病毒，如WITO.33，研究人员发现血清IgG及特定的mAb（如Q7M-675）仍能实现中和。通过构建C链敲除病毒变体（如K168E, I169E/K171E），研究证实了V2 C链是诱导的顶端靶向抗体反应的主要靶标，且通过改变该区域的氨基酸组成可以克服自然耐药性。
讨论与结论
本研究描述了一种利用近原生NFL稳定Env三聚体共价阵列于脂质体上，从而在NHP中诱导产生强健的顶端靶向交叉中和抗体反应的疫苗策略。该研究不仅证明了利用天然Env序列启动顶端定向前体是可行的，更重要的是，通过异源三聚体加强免疫，驱动了亲和力成熟，产生了能够交叉中和多种Tier-2多亚型临床分离株的抗体。
研究人员得出结论，这种策略超越了单纯启动bNAb前体，成功教育B细胞通过异源三聚体加强免疫来驱动后续步骤，从而产生针对野生型Env的广泛中和活性。疫苗诱导的mAbs与感染驱动的bNAbs（如PG9和CH03）在结构上具有高度相似性，验证了该方法的有效性。这项工作确立了HIV疫苗开发的一个重要模板，即通过脂质体阵列化Env三聚体和序贯异源加强策略，在非人灵长类模型中实现了对HIV Env顶端这一隐蔽表位的广泛中和抗体应答，为过渡到人类临床试验提供了关键的临床前概念验证。
