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糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是导致肾功能衰竭的首要病因，具有临床和分子异质性，使得治疗研发极其困难1。在此，研究人员利用Xenium和CosMx单细胞空间转录组学，并整合单核RNA测序（single-nucleus R
糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是导致肾功能衰竭的首要病因，具有临床和分子异质性，使得治疗研发极其困难1。在此，研究人员利用Xenium和CosMx单细胞空间转录组学，并整合单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），构建了一个跨平台肾脏图谱，使组织结构可用于预后、无创检测和患者分型。利用此图谱，研究人员定义了可复现的组织生态位（niche）和损伤相关微环境，并揭示了一个促纤维化背景，其随疾病发展而扩展并与肾功能恶化相关。在此结构中，研究人员发现了一个B细胞主导的、类似三级淋巴结构（tertiary lymphoid structure, TLS）的免疫微环境，这定义了一个独特的DKD亚型，其进展至肾脏终点事件的速度更快。研究人员开发了捕获此生物学特征的组织生物标志物和匹配的血浆蛋白组，能够在一个人群生物样本库中区分患者，并改善超出临床模型的风险预测——支持其在未来B细胞靶向DKD试验中用于生物标志物引导选择的潜力。
糖尿病肾病（Diabetic kidney disease, DKD）是导致慢性肾病（chronic kidney disease, CKD）和终末期肾病（end-stage renal disease, ESRD）的首要病因，约有40%的糖尿病患者会发展为此病。尽管近年来在治疗上有所进展，例如钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂（Sodium-glucose cotransporter 2 inhibitors, SGLT2i）、非甾体盐皮质激素受体拮抗剂和选择性内皮素受体拮抗剂等，但终末期肾病仍然常见，反映了DKD的异质性。其疾病进展从快速衰退到长期稳定不等，反映了潜在生物学的多样性。目前，年龄、性别、估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate, eGFR）和蛋白尿等临床因素可预测结果，但很少揭示潜在生物学机制，而遗传风险评分对风险或治疗指导的价值有限。循环肿瘤坏死因子受体（tumour necrosis factor receptors, TNF receptors）1和2与肾功能下降和ESRD强相关，但DKD中肾脏炎症的细胞和空间背景仍不清楚，限制了其向靶向治疗的转化。下一代单细胞空间转录组学能够在完整组织中以真实的细胞分辨率进行近全基因组范围的基因分析，保留空间背景，并直接从临床活检中揭示疾病相关的组织结构和不同的病理亚型。为了应对DKD临床和分子异质性带来的挑战，并寻求精准的、基于机制的DKD分层和治疗方法，本研究旨在构建一个高分辨率的空间图谱，以揭示疾病相关的组织结构和免疫微环境。
研究人员开展了一项整合单细胞空间转录组学和单核RNA测序的研究，旨在构建一个跨平台的肾脏空间图谱，以解析DKD的细胞和分子结构。相关研究成果发表在国际顶级学术期刊《自然》（Nature）上。
本研究运用的几个主要关键技术方法包括：首先，研究人员从58名患者（26%为女性，平均年龄57.3岁）的64个福尔马林固定石蜡包埋（Formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）肾脏样本中生成单细胞空间图谱，样本涵盖了广泛的GFR范围和不同人口统计学特征。这些样本使用CosMx（1,000个基因，n=48）和Xenium（5,100个基因，n=16）平台进行分析。其次，研究人员将每个空间数据集与一个来自150名患者的参考单核RNA测序图谱进行整合，使用了scVI和scANVI深度学习模型。整合后保留了超过500万个细胞，形成了一个统一的空间图谱。再次，通过无偏的Leiden聚类和基于标志物的注释，识别了20种细胞类型。此外，研究还结合了过碘酸-希夫（Periodic acid-Schiff, PAS）染色的CosMx数据和苏木精-伊红（haematoxylin and eosin, H&E）染色的Xenium数据进行配对的组织学和空间分析。最后，研究利用了成像质谱流式（imaging mass cytometry, IMC）、批量RNA测序（bulk RNA-sequencing, RNA-seq）数据分析和机器学习模型（如弹性网络逻辑回归）来验证发现并开发生物标志物。
研究结果
A spatial atlas at cellular resolution（细胞分辨率下的空间图谱）
研究人员构建了一个包含超过500万个细胞的单细胞空间图谱，整合了CosMx、Xenium和snRNA-seq数据。通过无偏聚类和注释，确定了20种细胞类型，包括不同的内皮亚型、基质细胞和受伤的肾小管上皮细胞（如受伤的近端小管细胞（injured proximal tubule, iPT）和受伤的厚壁升支细胞（injured thick ascending limb, iTAL））。空间图谱揭示了DKD组织中近端小管显著破坏，伴有大量受伤的上皮细胞。高分辨率视图显示了健康的小叶间动脉区域、发炎的肾小管间质区域和集合管等关键特征。
Niches decode tissue architecture（生态位解码组织结构）
通过分析细胞-细胞关系，研究人员定义了11个可复现的细胞邻域，称为“生态位”（niches），包括肾小球生态位、血管生态位、近端小管（proximal tubule, PT）生态位、受伤的近端小管（iPT）生态位等。这些生态位与已知的肾脏结构一致，并显示出疾病相关的组成变化。例如，DCT和PT生态位与eGFR呈正相关，而免疫和iPT生态位与eGFR呈负相关。生态位框架揭示了DKD相关的转录变化，例如血管生态位中与细胞外基质重塑、炎症和新血管生成相关的通路富集。研究人员还发现，在DKD中，肾小球生态位内的系膜细胞和免疫细胞适度增加，并且系膜细胞-免疫细胞相互作用增强。
The profibrotic microenvironment in DKD（DKD中的促纤维化微环境）
研究人员引入了“微环境”（microenvironment）概念，即由局部细胞邻域定义的特定细胞类型的集群。针对受伤的肾小管上皮细胞（iPT和iTAL），他们识别了五种不同的微环境：近端、远端、肾小球周围、血管周围和促纤维化微环境。其中，促纤维化微环境富含免疫细胞和成纤维细胞，在DKD中显著扩展，且与eGFR负相关。该微环境中的iPT和iTAL中心细胞表达MMP7、HAVCR1、ITGB6等基因，而成纤维细胞高表达COL1A1。配体-受体相互作用分析揭示了iPT细胞与成纤维细胞之间通过HBEGF-EGFR、TNFSF10-TNFRSF10B、JAG2-NOTCH和PDGFβ-PDGFRβ等通路进行通讯，表明上皮-基质细胞相互作用促进了纤维化和疾病进展。
Spatial mapping of the immune landscape（免疫景观的空间映射）
研究人员生成了一个全面的人类肾脏免疫细胞空间图谱，识别了11个免疫群体，包括T细胞、自然杀伤（natural killer, NK）细胞、树突状细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞等。在DKD中，免疫细胞总体增加，其中浆细胞和B细胞分别增加了3.1倍和2.4倍。B细胞表现出高度的空间聚集性。通过根据局部细胞背景对免疫细胞进行聚类，研究人员发现了富含成纤维细胞、受伤肾小管、血管或肾小球邻居的免疫微环境，以及两个免疫密集的微环境：T细胞主导型和B细胞主导型。此外，还定义了一个主要由巨噬细胞和少量CD8+T细胞组成的“常驻”（residential）免疫微环境，其在健康肾脏中稳定存在，可能代表组织常驻的、具有抗炎特征的巨噬细胞群体。在DKD中，肾小球免疫微环境内的巨噬细胞和CD8+T细胞数量显著增加。配体-受体分析揭示了系膜细胞FN1与巨噬细胞ITGA4/ITGB7的相互作用与eGFR负相关，而足细胞BMP4与CD8+T细胞BMPR2的相互作用与eGFR正相关。在受伤肾小管免疫微环境中，浆细胞数量增加，并且CXCL12-CXCR4和TNFSF13-TNFRSF13B相互作用增强，与浆细胞的募集和存活一致。
B cell microenvironment marks DKD subset（B细胞微环境标记DKD亚型）
B细胞在DKD中数量显著增加，并形成了一个独特的、B细胞主导的免疫微环境，该微环境嵌入在促纤维化肾小管生态位中。这个区域显示出强烈的CXCL13-CXCR5空间共表达，以及CD4+T细胞表达CXCR5和PDCD1，具有滤泡辅助性T细胞（T follicular helper, TFH）样表型，暗示存在类似三级淋巴结构的结构。成像质谱流式验证了CD20+B细胞和CD4+T细胞的富集，并显示Ki-67+的增殖B细胞，且表达AICDA和IRF4，表明局部B细胞活化和分化。整合单细胞B细胞图谱显示，该微环境中富含IgD+初始B细胞和记忆B细胞。研究人员从该B细胞主导微环境衍生出一个空间基因特征，并将其应用于TRIDENT队列的批量RNA测序数据，将患者分为B+ DKD和B- DKD两组。生存分析显示，B+ DKD患者肾脏终点事件进展显著更快。比较B+和B- DKD的批量RNA测序谱，发现B+ DKD中B细胞标志物、TLS相关趋化因子、浆细胞基因以及BAFF/APRIL受体基因和TFH标志物表达上调。通过弹性网络逻辑回归模型，研究人员从配对的血浆蛋白质组数据中筛选出14个蛋白质（B+ DKD蛋白组），该组蛋白改善了肾脏结局预测，并在UK Biobank队列中得到外部验证。
讨论
在本研究中，研究人员利用Xenium和CosMx构建了健康和DKD人类肾脏的单细胞空间图谱，实现了细胞类型的空间映射，并定义了计算推导、生物学验证的肾脏生态位。在DKD中，研究人员发现了富含受伤肾小管细胞和免疫细胞的疾病相关生态位。高分辨率分析揭示了一个具有独特细胞状态和信号网络的促纤维化受伤肾小管微环境，其中在一个患者亚群中出现了一个B细胞主导的微环境。该B细胞主导微环境的空间基因特征与快速疾病进展相关，并与候选的组织和血浆生物标志物相关联。
研究结论（翻译自“Discussion”部分）
总之，单细胞空间转录组学将肾脏解剖结构转化为可计算的疾病图谱，揭示了DKD如何将组织重塑为促纤维化微环境和一个标志着进展性亚型的B细胞主导的、类似三级淋巴结构的生态位。通过将这些模式压缩为组织特征和血浆蛋白组，研究人员改进了临床模型之外的检测和风险分层。这些结果为将空间生物学转化为实践提供了蓝图，定义了可操作的微环境和生物标志物，以指导靶向治疗。
