CRISPR-Based Gene Dependency Screens Reveal Mechanism of BRAF Inhibitor Resistance in Anaplastic Thyroid Cancer

《Molecular Carcinogenesis》：CRISPR-Based Gene Dependency Screens Reveal Mechanism of BRAF Inhibitor Resistance in Anaplastic Thyroid Cancer

　　

间变性甲状腺癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是甲状腺癌中最具侵袭性的亚型。尽管近期针对BRAFV600E驱动的ATC治疗取得了进展，但治疗耐药性仍是一个重大挑战，常导致疾病进展和死亡。研究人员利用定制的聚焦于BRAF抑制剂反应的CRISPR敲除（CRISPR/KO）筛选和CRISPR激活（CRISPR/activation）筛选，发现TAZ（由WWTR1基因编码）缺失与ATC中BRAF抑制剂具有合成致死性。与分化良好的甲状腺肿瘤相比，TAZ在ATC中呈过表达。研究人员证实，TAZ缺陷型ATC细胞对BRAF抑制剂表现出更高的敏感性。通过对癌细胞系基因必需性评分的分析，研究人员发现BRAFV600E驱动的癌症对TAZ缺失高度敏感，这与BRAF野生型和非BRAFV600E的对应癌种不同。从机制上讲，研究人员证明达拉非尼（dabrafenib）在内质网应激下触发未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response, UPR）并抑制蛋白质合成。TAZ缺失会抑制UPR，逆转蛋白质合成的抑制，并在达拉非尼处理的ATC中通过铁死亡（ferroptosis）引发增加的细胞死亡。总之，该研究结果揭示了TAZ作为一个新的靶点，可克服未分化甲状腺癌对BRAF抑制剂的耐药性。

论文解读：CRISPR筛选揭示TAZ介导间变性甲状腺癌对BRAF抑制剂耐药的机制

研究背景与立项依据

间变性甲状腺癌（Anaplastic Thyroid Cancer, ATC）是甲状腺癌中恶性程度最高的病理类型，虽然仅占所有甲状腺癌的不到2%，但其早期转移、预后极差，1年生存率仅为39%。尽管BRAF^V600E抑制剂达拉非尼（dabrafenib）联合MEK抑制剂曲美替尼（trametinib）在BRAF^V600E突变的ATC治疗中显示出一定疗效，但严重的不良反应及获得性耐药仍是导致疾病进展的主要障碍。目前，针对ATC这种特征尚不明确的实体瘤，其BRAF抑制剂耐药的遗传决定因素及分子机制尚未完全阐明。因此，迫切需要探索新的治疗靶点和联合策略以克服耐药，改善患者预后。本研究由美国国家癌症研究所等机构的研究人员完成，并发表在《Molecular Carcinogenesis》期刊上。

关键技术方法概述

研究人员构建了包含约2000个基因的聚焦CRISPR敲除（KO）和激活（Act）文库，这些基因是基于达拉非尼处理差异表达及癌症依赖性图谱（Cancer Dependency Map, DepMap）数据筛选所得。利用该文库对8505c细胞系进行筛选，结合下一代测序和生物信息学分析（MAGeCKFlute）。研究采用了细胞活力检测、集落形成实验、蛋白质印迹（Western blot）、RT-PCR、免疫沉淀、Puromycin掺入法检测蛋白质合成、脂质活性氧（Lipid ROS）检测以及体内小鼠异种移植瘤模型。此外，还利用了患者来源的ATC类器官（spheroids）模型（ATC01和ATC02）进行药效验证。

研究结果详解

2.1 聚焦CRISPR/KO和CRISPR/Act筛选确定WWTR1 (TAZ)是达拉非尼耐药的关键驱动因子

研究人员通过整合DepMap数据库分析与转录组测序数据，构建了包含2050个基因的聚焦CRISPR文库。筛选结果显示，在达拉非尼处理的细胞中，靶向WWTR1的sgRNA显著丢失，而激活WWTR1的sgRNA则富集。进一步分析DepMap数据发现，BRAF^V600E驱动的癌细胞系对WWTR1（编码TAZ）的缺失表现出更高的依赖性（负向必需性评分），且ATC组织中WWTR1表达显著高于正常甲状腺组织或乳头状甲状腺癌（PTC）。这表明WWTR1是BRAF抑制剂处理下的关键必需基因。

2.2 WWTR1 (TAZ)抑制使ATC细胞对达拉非尼增敏

功能实验证实，无论是利用shRNA还是CRISPR/Cas9技术敲低或敲除TAZ，均能显著增强8505c细胞对达拉非尼的敏感性，表现为细胞活力和集落形成能力的显著降低。机制上，TAZ主要通过与其转录伙伴TEAD结合发挥作用。药理学抑制TAZ-TEAD相互作用的抑制剂（K-975和GNE-7933）同样能模拟TAZ缺失的效果，显著抑制细胞增殖，并在患者来源的ATC类器官中验证了这一协同效应。

2.3 TAZ缺失克服ATC小鼠肿瘤对达拉非尼的耐药性并延长生存期

体内实验显示，植入TAZ敲低（shTAZ）细胞的荷瘤小鼠在接受达拉非尼治疗后，肿瘤体积缩小了53%，且肿瘤重量显著降低。更重要的是，生存分析表明，对照组中位生存期为7天，单药达拉非尼组为14天，而TAZ敲低联合达拉非尼治疗组的中位生存期达到25.5天，且有约30%的小鼠存活超过研究终点，显示出显著的生存获益且无显著体重下降。

2.4 TAZ抑制拮抗达拉非尼诱导的内质网应激反应

转录组和蛋白质组学分析揭示，达拉非尼处理激活了未折叠蛋白反应（UPR）通路，上调了ATF4及其下游靶基因PHGDH等。然而，在TAZ缺失的细胞中，这种UPR激活被阻断。具体表现为，TAZ缺失抑制了ATF4和磷酸甘油酸脱氢酶（PHGDH）的表达，而PHGDH是丝氨酸从头合成途径（SSP）的限速酶。Puromycin掺入实验进一步证实，达拉非尼通过PERK-ATF4轴抑制全局蛋白质合成，而TAZ缺失则逆转了这一抑制，导致蛋白质合成部分恢复，从而引发细胞应激。

2.5 TAZ缺失促进达拉非尼处理的ATC细胞发生铁死亡

细胞死亡机制探究发现，TAZ缺失联合BRAF抑制并未显著增加凋亡标志物caspase 3/7的活性，但却导致了显著的脂质活性氧（Lipid ROS）积累。利用BODIPY探针检测证实，联合处理组铁死亡水平较单药组增加了两倍。这提示TAZ缺失破坏了UPR的保护作用，使得细胞在ER应激和蛋白质合成异常的情况下，转向铁死亡途径。

2.6 PHGDH或PERK抑制模拟TAZ缺失使ATC细胞对达拉非尼增敏

为了验证UPR下游效应的必要性，研究人员使用了PHGDH抑制剂CBR-5884和PERK抑制剂GSK2606414。结果表明，这两种药物均能单独模拟TAZ缺失的功能，显著增强达拉非尼对ATC细胞和患者来源类器官的杀伤效果，证实了UPR-ATF4-PHGDH轴在耐药中的关键作用。

2.7 达拉非尼与曲美替尼联合治疗在Taz缺失细胞中的效果

研究发现，虽然在BRAF抑制剂基础上加用低剂量曲美替尼（trametinib, 5 nM）能进一步增强TAZ缺失细胞对MAPK通路的抑制，但在较高剂量下未观察到额外获益。值得注意的是，对于既往接受过达拉非尼和曲美替尼治疗的残留肿瘤来源的类器官（ATC02），再次加用曲美替尼未能显著增效，表明在已产生MAPK通路耐药的肿瘤中，靶向UPR或丝氨酸合成途径比单纯加深MAPK抑制更为有效。

讨论与结论总结

本研究首次利用CRISPR筛选技术，在ATC模型中鉴定出WWTR1（TAZ）是BRAF抑制剂耐药的关键遗传决定因素。研究阐明了其分子机制：达拉非尼诱导的内质网应激激活了UPR（通过PERK-ATF4轴），进而上调PHGDH以促进丝氨酸合成和谷胱甘肽代谢，维持氧化还原稳态并抑制铁死亡，从而导致耐药。而TAZ的缺失或抑制则阻断了这一适应性保护机制，导致蛋白质合成紊乱和脂质过氧化积累，最终通过铁死亡途径清除肿瘤细胞。

综上所述，该研究确立了TAZ作为克服BRAF^V600E驱动的间变性甲状腺癌对BRAF抑制剂耐药的一个可操作的治疗靶点，并为临床联合应用TAZ抑制剂（或UPR/PHGDH抑制剂）与BRAF抑制剂提供了坚实的临床前科学依据。