长链非编码RNA lnc13抑制炎症反应以维持对麸质的口服耐受

《Nature Immunology》：The long noncoding RNA lnc13 restrains inflammatory responses to maintain oral tolerance to gluten

　　

摘要：乳糜泻(Celiac disease, CeD)是一种由膳食麸质引发的自身免疫性疾病。虽然HLA-DQ2/8介导的麦醇溶蛋白肽呈递是疾病所必需的，但对麸质口服耐受丧失的机制仍未完全阐明。长链非编码RNA(long-noncoding RNAs, lncRNAs)已被越来越多地认为是免疫功能的调节因子，但其在口服耐受中的作用此前尚未被探讨。在此，研究人员利用一项旨在鉴定对T细胞活化有反应且富含CeD相关全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study, GWAS)变体的lncRNAs筛选，将lnc13确定为首要候选分子。在缺乏lnc13的HLA-DQ8转基因小鼠中，未处理的麸质摄入导致了类似于人CeD的分子特征以及麸质口服耐受丧失的标志性特征：小肠中IFN-γ+淋巴细胞、IL-12+髓系细胞、细胞毒性上皮内免疫细胞增加以及隐窝增生。在机制上，lnc13结合特定的DNA调控区域，限制免疫细胞对促炎信号的反应性。特别是，lnc13抑制了IL-15驱动的CD8+自然杀伤样淋巴因子激活杀伤细胞的分化(这是一种在CeD中被强烈涉及的IL-15依赖性通路)。这些发现确立了lnc13是口服麸质耐受的一个关键的非编码调节因子。

研究背景与目的

乳糜泻(CeD)是一种由摄入麸质(小麦面筋)引发的自身免疫性疾病，其发病机制涉及HLA-DQ2或HLA-DQ8分子对麦醇溶蛋白肽的呈递，从而激活特异性T细胞，引发慢性炎症和小肠黏膜损伤。然而，携带易感HLA等位基因的个体并非都会发病，表明非HLA遗传因素在疾病易感性中起重要作用。全基因组关联研究(GWAS)已鉴定出大量与CeD风险相关的非HLA单核苷酸多态性(SNPs)，其中约94%位于基因组的非编码区，提示非编码RNA可能在其中扮演关键角色。长链非编码RNA(lncRNAs)不编码蛋白质，但参与多种调控过程。此前研究发现lnc13是一种与CeD相关的lncRNA，可调节巨噬细胞中的炎症基因表达，但其在口服耐受中的生理功能(特别是在体内)因缺乏基因敲除模型而未知。本研究旨在探究lnc13在维持口服麸质耐受中的具体作用及分子机制。

研究方法概要

研究人员通过整合分析人麸质特异性CD4⁺T细胞的RNA表达数据与CeD相关的GWAS位点，筛选出候选lncRNA，并重点研究了lnc13。为探究其功能，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了lnc13全身性敲除(KO)小鼠，并将其与缺乏内源性MHC II类分子、表达人HLA-DQ8的转基因小鼠杂交，得到lnc13^-/--DQ8小鼠模型。小鼠在无麸质饮食下断奶，于10周龄时转换为标准含麸质饲料，并每隔一天灌胃给予20 mg未处理麦醇溶蛋白，持续45天，以模拟麸质暴露。研究使用了多种技术方法，包括：对小鼠小肠组织进行RNA测序(RNA-seq)和实时定量PCR(RT–qPCR)，以分析基因表达变化；流式细胞术分析小肠固有层和上皮内淋巴细胞等多种免疫细胞群的表型和功能；对小鼠小肠进行组织病理学分析(苏木精-伊红染色)，评估绒毛-隐窝比、隐窝深度和上皮内淋巴细胞数量；体外用IL-15等细胞因子刺激分选的CD8⁺上皮内淋巴细胞，评估其分化和功能；通过染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)和RNA反义纯化-DNA测序(RAP-DNA-seq)等技术，探究lnc13的转录调控及其与染色质的相互作用。此外，研究还利用了公开可获得的人源数据集(GEO数据库)进行跨物种比较分析。

研究结果

lnc13是口服麸质耐受的候选调节因子

研究人员筛选了在麸质特异性T细胞中响应T细胞受体(TCR)激活且与CeD GWAS SNPs重叠的lncRNAs，鉴定出lnc13是保守性高、可被NF-κB诱导上调的候选分子。在T细胞激活后，lnc13表达上调而其降解酶DCP2表达下降，提示其可能参与免疫反应的负向调控。

lnc13缺失破坏HLA-DQ8小鼠的麸质耐受

在缺乏lnc13的HLA-DQ8(lnc13^-/--DQ8)小鼠中，麸质暴露诱导了类似人CeD的免疫反应。与野生型(WT)-DQ8小鼠相比，敲除小鼠小肠中促炎细胞因子Ifng和Il12b的mRNA表达增加，固有层中产生IFN-γ的CD4⁺和CD8⁺T细胞、产生IL-12的CD11b⁺髓系细胞增多，而FOXP3⁺调节性T细胞减少。RNA-seq分析显示，lnc13缺失小鼠的差异表达基因与CeD患者活检组织的基因表达谱在免疫反应、细胞因子介导的信号传导等通路上有显著重叠。此外，敲除小鼠血清中抗麦醇溶蛋白、抗脱酰胺麦醇溶蛋白和抗组织谷氨酰胺转移酶抗体水平升高，表明体液自身免疫反应增强。

lnc13抑制细胞毒性上皮内淋巴细胞

上皮内淋巴细胞(IELs)是CeD组织损伤的关键驱动因素。在lnc13^-/--DQ8小鼠中，麸质挑战导致小肠上皮内CD8⁺T细胞比例增加。这些细胞表现出更强的细胞毒性表型，包括颗粒酶B(GZMB)和溶酶体相关膜蛋白(CD107a/b)表达上调。同时，表达NKG2D(一种与CeD中淋巴因子激活杀伤细胞表型相关的受体)的CD8αβ⁺IELs也增多。对分选的CD8αβ⁺IELs进行RNA-seq分析发现，lnc13缺失导致与T细胞激活、增殖、淋巴瘤发生以及NK样特征相关的基因表达上调。这些转录组特征与人CeD患者中“自然效应”CD8⁺T细胞的基因特征高度相似。

lnc13缺失导致小鼠出现CeD样病理

组织学分析显示，经麸质处理的lnc13^-/--DQ8小鼠小肠末端回肠出现隐窝增生和绒毛-隐窝比降低，这是CeD的早期病理特征。IELs数量增加，且与绒毛-隐窝比呈负相关。利用小肠“瑞士卷”切片进行全肠段分析，发现隐窝增生延伸至近端小肠。重要的是，这种病理变化依赖于麸质暴露，因为在转换为无麸质饮食后，组织学异常得到逆转。在无麸质条件下，lnc13^-/--DQ8与WT-DQ8小鼠之间未观察到免疫表型差异，表明表型是麸质依赖性的。

lnc13抑制CD8⁺IEL对IL-15信号的反应性

机制探究发现，lnc13在CD8⁺T细胞中表达最高。IL-15(一种在CeD病理中起核心作用的细胞因子)刺激可下调CD8⁺IELs中lnc13的表达，同时上调其降解酶Dcp2。IL-15信号通过STAT5激活Dcp2转录，进而促进lnc13降解。体外实验表明，用IL-15超激动剂刺激WT CD8⁺IELs可诱导其分化为表达NKG2D和GZMB的NK样淋巴因子激活杀伤细胞。而lnc13缺失的CD8⁺IELs对IL-15刺激表现更为敏感，产生更高比例的细胞毒性效应细胞。在CD4⁺T细胞中，IL-15不诱导Dcp2，也不下调lnc13，表明此调节具有细胞类型特异性。

lnc13在CD8⁺T细胞中与DNA调控元件结合

RNA-seq分析显示，IL-15刺激的lnc13缺失CD8⁺IELs中，与IL-15信号、T细胞激活、增殖等相关的基因表达上调。转录因子基序分析发现，lnc13调控的基因富集了与核小体重塑和去乙酰化酶复合物相关的基序。通过RAP-DNA-seq技术，研究人员绘制了lnc13在CD8⁺T细胞中的染色质结合图谱，发现lnc13结合在Maf、Cxxc5、Gab2等IL-15应答基因的调控区域附近。大量lnc13缺失导致的差异表达基因在其基因组位点附近存在lnc13结合峰，表明lnc13通过顺式调控靶向这些基因。研究人员提出模型：在静息CD8⁺T细胞中，lnc13通过招募染色质重塑复合物抑制IL-15通路基因；IL-15刺激后，lnc13被降解，解除抑制，允许NK样淋巴因子激活杀伤细胞分化。

讨论与结论

本研究证明lnc13是维持口服麸质耐受的关键调节因子。在携带HLA-DQ8的基因工程小鼠中，lnc13的缺失降低了免疫系统对麸质驱动炎症的激活阈值，导致促炎和细胞毒性免疫反应增强、黏膜病理改变以及类似于人CeD的分子特征。这为解决CeD中的一个长期悖论提供了线索：为何仅有一部分携带HLA-DQ2/8的个体会发病。研究结果表明，lnc13并非决定性疾病触发因素，而是通过提高免疫激活阈值来发挥作用。其缺失使免疫系统对膳食麸质的炎症更易感。

在机制上，lnc13通过限制CD8⁺T细胞(特别是上皮内淋巴细胞)对IL-15等炎性信号的反应性来维持耐受。lnc13结合特定DNA调控元件，可能通过招募核小体重塑和去乙酰化酶复合物来抑制包括IL-15通路基因在内的效应基因表达。缺乏lnc13时，CD8αβ⁺IELs对炎性信号(尤其是IL-15)变得过度敏感，分化为细胞毒性NK样细胞，重现了活动性CeD中的效应状态。

lnc13^-/--DQ8小鼠模型在无佐剂或细胞因子过表达的情况下，发展出麸质依赖且可逆的肠道病理，具有较高的生理保真度。该模型表明，单个非编码RNA位点的缺失，与HLA-DQ8和膳食麸质共同作用，足以降低耐受阈值，诱发CeD样免疫激活和早期病理。这为理解非编码GWAS风险位点如何调节免疫阈值而非直接决定疾病结局提供了范例。

总之，这些发现确立了lnc13是口服麸质耐受的一个关键的非编码调节因子，并揭示了lnc13缺失通过使CD8⁺T细胞对IL-15敏感而破坏耐受的机制。该研究为解码非编码变异如何贡献于复杂炎症性疾病提供了框架。