空间转录组学中灵敏度、特异性和信号污染的解析

《Nature Methods》：Resolving sensitivity, specificity and signal contamination in Xenium spatial transcriptomics

　　

空间转录组学能够在完整组织中实现高分辨率基因表达图谱绘制。Xenium因其可靠性、可及性和数据质量而被广泛采用，但Xenium衍生数据的特性和局限性仍未得到充分表征。在此，研究人员展示了迄今为止最全面的Xenium数据集之一，涵盖使用多种基因Panel分析的超过40个乳腺和肺肿瘤切片。利用这一资源，研究人员系统地剖析了技术噪声——包括转录本溢出——以及检测特异性、Panel性能和分割策略。他们证明单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq）能够精确量化转录本污染。基于这些发现，研究人员引入了SPLIT（Spatial Purification of Layered Intracellular Transcripts，空间分层细胞内转录本纯化），这是一种通过解析混合转录本信号来提高信号纯度的方法。SPLIT增强了背景校正和细胞类型分辨率，并能够揭示与恶性细胞共定位相关的T细胞耗竭特征——这些信号原本会被掩盖。总之，这些发现为Xenium性能提供了关键基准，并引入了一种可扩展的信号优化策略。

论文解读：Xenium空间转录组学中的灵敏度、特异性与信号污染解析

本研究由科研人员团队完成，发表于《Nature Methods》。随着空间分辨转录组学技术的快速发展，成像为基础的平台如Xenium、MERSCOPE和CosMx能够在细胞和亚细胞水平实现高分辨率转录本定量。然而，现有研究在数据规模和系统性比较上存在局限，通常仅包含少量患者样本或依赖组织微阵列，且缺乏对靶向Panel与新型5K Panel在转录本灵敏度和特异性方面的直接比较。此外，转录本错误分配导致的信号污染（signal contamination）问题，严重影响下游分析的准确性。为解决这些关键问题，研究人员构建了迄今为止最全面的Xenium数据集之一，旨在系统评估Xenium平台的性能特征，并开发新的计算方法以校正空间转录组学数据中的信号污染。

为实现上述目标，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，构建了大规模临床样本队列，包含来自27名供体的41个组织切片（19个乳腺癌和22个非小细胞肺癌（NSCLC）切片），并使用了多种基因Panel（靶向Breast/Lung Panel、定制免疫肿瘤学Panel及5K PRIME Panel）进行分析。其次，结合匹配的单核RNA测序（snRNA-seq）数据作为参考，利用稳健细胞类型分解（Robust Cell Type Decomposition, RCTD）算法进行细胞类型注释和混合信号解析。第三，开发了SPLIT（Spatial Purification of Layered Intracellular Transcripts）计算方法，通过整合RCTD输出的权重与参考谱，对受污染的转录本信号进行解构和纯化。此外，还通过多重免疫组化（IHC）对特定细胞类型进行了正交验证。

研究结果

数据与实验概览

研究人员生成了来自乳腺癌和NSCLC样本的Xenium空间转录组数据，所有样本均进行了细胞分割以获得单细胞分辨率。结合匹配的snRNA-seq和IHC数据，研究人员展示了实验设计、每个样本的细胞数、每个细胞的转录本数和每个Panel的基因数的关键指标。

snRNA-seq数据实现Xenium数据集的稳健注释

利用部分匹配且已注释的snRNA-seq数据集，研究人员应用RCTD将细胞类型注释转移到每个Xenium样本。结果显示，RCTD在双联体（doublet）模式下不仅能识别细胞类型，还能有效处理由分割误差或转录本溢出引起的混合信号，证明了匹配参考在癌症研究中的价值。

Xenium数据在患者和技术重复间表现出高度一致性

通过对所有样本进行基于Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP)的联合分析，研究人员发现技术重复产生的数据具有近乎完美的 concordance，证实了该平台的高重现性。非恶性细胞群在不同个体间保持一致，而恶性细胞则呈患者特异性聚类，且无需批量校正即可实现跨样本的细胞类型一致性。

靶向基因Panel在灵敏度上优于5K Panel

尽管5K Panel检测到的转录本和基因总数更高，但在控制基因含量后，其灵敏度反而低于靶向Lung Panel。约60%的5K数据集细胞因低转录本计数未能通过质量控制（QC）。这表明5K Panel虽然覆盖基因更广，但存在显著的灵敏度权衡。

靶向和5K Panel在细胞类型组成上显示出高度一致性

尽管5K Panel灵敏度降低，但相邻切片间的细胞类型组成仍具有良好的一致性。靶向Panel（Custom IO和Lung）之间的一致性最高，表明Xenium对基因Panel设计的变异具有鲁棒性。

靶向基因Panel为定义主要细胞类型提供了广泛信息

即使限制在共享基因集内，Chromium数据也能实现清晰的细胞类型分离，这表明Xenium数据中观察到的分辨率降低并非完全归因于分析基因数量的减少，而是与转录本溢出导致的细胞类型边界模糊有关。

Xenium数据表现出显著的转录本溢出

研究人员利用RCTD双联体模式发现，所谓的“双联体”实际上反映了信号混合而非生物学上的真实双联体，因此将其称为“污染”。通过分析细胞局部邻域中次要细胞类型的丰度与RCTD分配的权重（w₂）之间的关系，证实了存在显著的二维平面转录本溢出。定义了溢出指数（spillover index），发现恶性细胞具有最高的溢出倾向。IHC染色进一步验证了肿瘤细胞特异性转录本扩散至邻近CD8⁺T细胞的现象。

信号分解减少溢出并增强细胞类型纯度

基于此，研究人员提出了SPLIT框架。SPLIT利用RCTD模型和细胞分解，将混合表达谱按比例分配给最可能的来源。UMAP嵌入显示，经SPLIT校正后的细胞聚类得到改善。SPLIT默认保留主要细胞类型的表达谱，并能利用空间信息选择性地进行分解，从而避免了对参考中缺失表型（如循环肿瘤细胞）的过度校正。

SPLIT与其他校正方法的比较优势

通过与ResolVI和ovrlpy等其他校正方法的比较，SPLIT在细胞类型分离、与Chromium snRNA-seq谱的余弦相似性方面表现最佳。虽然所有校正方法都能减少污染，但ovrlpy和ResolVI会大幅减少基因数量并产生大量空细胞，而SPLIT能更好地保留基因检出率。结合ProSeg分割算法时，SPLIT取得了最大的整体改进。

靠近恶性细胞的T细胞表现出增加的耗竭特征

在生物学验证方面，研究人员比较了靠近恶性细胞和远离恶性细胞的T细胞表型。在原始数据中，靠近肿瘤的T细胞表现出虚假的恶性和上皮基因特征富集。经过SPLIT校正后，这些非特异性信号被去除，同时保留或增强了T细胞特征，特别是耗竭标志物如HAVCR2 (TIM-3)、CTLA4、PDCD1、LAG3和CXCL13的表达显著增强。

讨论与结论

研究人员讨论了本研究的主要发现及其意义。首先，大规模Xenium数据集的分析证实了其高质量、高重现性，为单样本和多样本空间研究提供了坚实基础。其次，关于Panel设计的比较揭示了靶向Panel虽基因少但灵敏度高，足以解析主要细胞类型；而5K Panel虽覆盖面广但单基因灵敏度较低，这为未来Panel的优化提供了依据。

研究确认了Xenium数据易受转录本污染的影响，这种污染源于分割不准确和转录本溢出。利用互补的RCTD反卷积和IHC数据，研究揭示了这种伪影普遍存在，且不成比例地影响低RNA含量的细胞（如T细胞）。这强调了开发稳健计算策略以校正污染的必要性，尤其是在推断细胞生态位（niches）时。

研究人员展示了结合snRNA-seq作为参考能显著增强细胞类型注释。SPLIT作为一种新颖的信号纯化方法，通过分解混合信号来校正转录本溢出。与现有的校正方法相比，SPLIT不易产生过度校正伪影，保留了更多的基因检出量，且具有更好的可解释性。尽管SPLIT最初是为RCTD开发的，但它现在是去卷积无关的，支持通用的去卷积输出。

最后，研究人员指出了使用SPLIT时的注意事项，包括解释混合细胞表型时的挑战，以及在参考中缺少特定表型时可能导致的错误分解。未来的工作将集中于开发无需参考的SPLIT版本，以进一步扩展其适用性。总之，本研究为Xenium平台的性能提供了关键基准，并提出的SPLIT方法为空间转录组学数据的信号优化提供了一个可扩展的策略。