Streptomyces produce a diphtheria toxin-like exotoxin that targets insects

《Nature Microbiology》：Streptomyces produce a diphtheria toxin-like exotoxin that targets insects

　　

链霉菌属（Streptomyces）与昆虫之间存在着由数百万年进化塑造的复杂相互作用。尽管许多互利关系已被广泛认知，但目前尚不清楚链霉菌属是否会专门产生针对昆虫的毒力因子。在此，研究人员通过生物信息学分析，鉴定出一种白喉毒素（Diphtheria toxin, DT）同源物，并将其命名为链霉菌古昆虫杀虫蛋白（Streptomyces antiquus insecticidal proteins, SAIP）。该蛋白存在于一个起源于1亿多年前的单系链霉菌谱系中。SAIP对昆虫细胞具有细胞毒性，并能致死黑腹果蝇（Drosophila melanogaster），在体内抑制神经活动和免疫反应。结构与功能研究证实，SAIP与DT同源，并通过真核延伸因子2（eukaryotic elongation factor 2, eEF2）的ADP核糖基化发挥作用。CRISPR–Cas9筛选确定了Flower蛋白是多种昆虫中SAIP的受体。产毒株链霉菌（Toxigenic Streptomyces）能够消耗死去的昆虫并在虫尸上生长，同时产生具有生物活性的次级代谢产物。这些发现确立了链霉菌属中的一种杀虫毒素，并证明链霉菌属已进化出针对昆虫的高度特异性毒力因子。

论文深度解读：链霉菌来源的白喉毒素样昆虫杀虫蛋白的发现与机制解析

研究背景与立论依据

链霉菌属（Streptomyces）作为放线菌门的代表性类群，长期以来因其卓越的次级代谢产物合成能力而被誉为“天然产物工厂”，为人类提供了包括抗生素、抗癌药物在内的众多生物活性分子。尽管已知链霉菌与昆虫在超过4亿年的进化历程中存在密切互作，且部分互作表现为互利共生关系，但关于两者之间潜在的拮抗作用机制研究相对匮乏。虽然已有报道指出某些链霉菌产生的代谢物对昆虫具有毒性，但这些小分子化合物通常缺乏物种特异性。相比之下，白喉毒素（Diphtheria toxin, DT）作为一种经典的蛋白质外毒素，是引起人类白喉疾病的主要致病因子，其通过催化真核延伸因子2（eEF2）的ADP核糖基化来抑制蛋白质合成。然而，DT及其同源物在细菌中的分布及进化起源仍是一个谜团。在此背景下，探索链霉菌是否编码具有昆虫特异性的DT样毒素，对于理解微生物与昆虫的协同进化及挖掘新型杀虫蛋白资源具有重要的科学意义。该项突破性研究成果发表于国际顶级期刊《Nature Microbiology》。

关键技术方法概述

本研究综合运用了多学科交叉技术。首先，研究人员通过大规模生物信息学分析，在公共数据库及自有菌株资源中筛选并鉴定了DT同源基因。其次，利用分子生物学手段重组表达了代表性蛋白SAIP，并通过MTT法评估其对多种昆虫及哺乳动物细胞系的细胞毒性。在机制解析方面，研究人员利用X射线晶体学技术解析了SAIP催化结构域的三维结构；采用全基因组CRISPR–Cas9敲除筛选技术，分别在果蝇S2细胞和埃及伊蚊Sua5B细胞中鉴定了SAIP的昆虫细胞受体。此外，结合系统发育基因组学分析、Z曲线分割算法以及昆虫注射模型，全面揭示了SAIP的进化轨迹、作用靶点及在昆虫体表的定殖消化能力。

研究结果精析

链霉菌携带一种DT同源蛋白

研究人员在初步探索DT起源时，通过同源序列搜索，在链霉菌属中鉴定出一个包含18条序列的DT同源蛋白家族。进一步对公共数据库及实验室保藏的链霉菌基因组进行挖掘，共鉴定出30株含有该同源基因的菌株，并将其命名为链霉菌古昆虫杀虫蛋白（SAIP）。该蛋白家族可细分为8种亚型，广泛分布于特定的链霉菌谱系中。

DT样蛋白在单系分支中垂直遗传

核心基因组系统发育分析表明，携带SAIP的链霉菌形成了一个稳定的单系分支。与DT通过噬菌体水平转移获得不同，SAIP基因在该单系群中表现出高度的同线性，且其GC含量与宿主基因组背景高度一致。Z曲线分析及系统发育重建显示，SAIP自约1.25亿年前起源以来，主要通过垂直遗传方式在链霉菌中稳定传递，并受到强烈的纯化选择，暗示了其重要的生物学功能。

链霉菌DT样蛋白对昆虫具有毒性

功能实验显示，代表性蛋白SAIP1.1对三种昆虫细胞系（如果蝇S2R+、埃及伊蚊Aag2等）表现出极高的毒性，半数抑制浓度（IC₅₀）低于10 pM，而对小鼠和人类细胞的毒性极低。体内注射实验进一步证实，微量的SAIP即可在60小时内导致约80%的黑腹果蝇死亡。相比之下，其他已报道的DT样蛋白在本研究中未显示出明显的细胞毒性。

SAIP包含一个抑制eEF2的ADP核糖基转移酶结构域

研究人员解析了SAIP1.1催化结构域（C-domain）的晶体结构，分辨率为3.0 ?。结构分析显示，SAIP具有典型的ADP核糖基转移酶折叠特征，其活性位点残基（如Glu147）与DT高度保守。功能互补实验表明，SAIP的C结构域能够像DT一样，特异性地修饰eEF2上的白喉酰胺（diphthamide）残基，从而抑制蛋白质翻译。将关键催化残基突变后，SAIP的毒性完全丧失。

鉴定出SAIP的昆虫蛋白受体Flower

利用全基因组CRISPR–Cas9筛选技术，研究人员在两个独立的筛选体系中均发现Flower（Fwe）基因是SAIP作用的关键因子。遗传敲除实验证实，缺失fwe基因的果蝇细胞及蚊细胞对SAIP产生了显著抗性。反之，在人类HeLa细胞中异位表达果蝇Fwe蛋白，可使其获得对SAIP的高度敏感性。结合免疫荧光共定位实验，确证了Fwe是介导SAIP进入昆虫细胞的关键受体。

SAIP识别广泛的昆虫Fwe

研究人员进一步测试了SAIP对其他目昆虫Fwe同源物的识别能力。结果显示，来自膜翅目（黄蜂、蜜蜂）和鞘翅目（赤拟谷盗）的Fwe能够使HeLa细胞获得SAIP敏感性，而鳞翅目（草地贪夜蛾）和线虫的Fwe则无效。通过构建嵌合体蛋白和定点突变分析，研究人员将SAIP的识别区域精确界定在Fwe蛋白胞外区的第119至154位氨基酸区间，揭示了决定物种易感性的分子基础。

SAIP在体内抑制神经活动和免疫反应

单细胞转录组数据分析显示，fwe基因在果蝇的感觉神经元和血细胞（haemocytes）中高表达。体内实验表明，摄入或注射SAIP会导致果蝇运动神经元功能障碍，表现为瘫痪。电生理学记录证实，长期暴露于SAIP会损害果蝇唇瓣味觉感器对蔗糖的反应。此外，SAIP处理还会诱导血细胞萎缩死亡，并削弱果蝇对大肠杆菌（Escherichia coli）感染的免疫清除能力，导致宿主死亡率升高。

产SAIP链霉菌可杀死昆虫并消化尸体

研究人员发现，产SAIP菌株（如S. hiroshimensis ATCC 19807）的培养上清液及孢子悬液对果蝇具有致死活性。值得注意的是，SAIP阳性菌株能够在死去的蝗虫尸体上旺盛生长，并在一周内将其完全降解。质谱分析显示，在此过程中菌株分泌了灵菌红素（undecylprodigiosin）和链玉红菌素B（streptorubin B）等红色色素次级代谢产物，这些化合物具有已知的抗菌活性，暗示了链霉菌利用昆虫尸体作为营养源并建立防御生态位的生存策略。

结论与展望

本研究首次在链霉菌中发现了一种结构上与白喉毒素同源、但功能上专门针对昆虫的外毒素SAIP。该研究不仅在分子水平上阐明了SAIP通过受体Flower识别昆虫并利用ADP核糖基化机制抑制宿主蛋白质合成的作用机理，还通过进化基因组学证据证明了该毒素基因在链霉菌中的古老起源与垂直遗传特性。这一发现填补了链霉菌—昆虫拮抗互作研究的空白，揭示了链霉菌作为潜在昆虫病原体的生态学角色。鉴于SAIP与现有的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫蛋白（如Cry蛋白）作用机制截然不同，且具有极高的杀虫活性和特异性，该研究成果为开发应对害虫抗药性的新一代生物防治制剂提供了极具价值的候选分子资源。