通过单细胞RNA测序识别特发性肺动脉高压的关键驱动基因并对其进行实验验证

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Identification of key driver genes in Idiopathic Pulmonary Arterial Hypertension by Single-Cell RNA Sequencing and Experimental Validation

　　

李斌斌|朱恩鹏|王一杰|胡亚婷|张琪|李芳伟

兰州大学第二医院及临床医学院，中国甘肃省兰州市730030

摘要

特发性肺动脉高压（IPAH）的特征是肺血管的不可逆重塑。这种病理重塑主要由肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）的异常增殖和迁移驱动。然而，这些功能障碍背后的分子机制尚未完全阐明。在本研究中，我们结合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析与体内和体外验证，以识别与IPAH相关的关键驱动基因。GSE169471数据集来自基因表达组学数据库（Gene Expression Omnibus），经过质量控制、聚类和细胞亚型注释处理。进一步分析确定了主要的细胞亚型、细胞间通信网络以及差异表达基因（DEGs）。随后使用多种生物信息学算法筛选出枢纽基因。在单克隆鼠（MCT）诱导的PAH大鼠模型中，通过qPCR和Western blotting验证了选定的枢纽基因。此外，还进行了siRNA介导的敲低实验，以研究枢纽基因沉默对HMGB1诱导的PASMC增殖和迁移的影响。我们的结果表明，PASMCs是主要的通信细胞亚型，在IPAH中显著增加。共鉴定出63个上调的DEGs，主要富集在细胞外基质组织和信号通路等生物学过程中，包括焦点黏附通路。鉴定出4个枢纽基因（COL1A1、MYL9、COL1A2和TPM2），在PAH大鼠的肺动脉中表达显著升高。沉默这些基因显著减少了HMGB1诱导的PASMC增殖和迁移。这些发现为IPAH的分子机制提供了新的见解，并突出了这些枢纽基因作为潜在治疗靶点的可能性。

引言

肺动脉高压（PAH）是一种进行性临床综合征，其特征是静息状态下平均肺动脉压力超过20 mmHg和肺血管阻力升高。特发性肺动脉高压（IPAH）是一种病因不明的严重PAH亚型，发病隐匿且预后较差[1]。IPAH的关键病理特征是肺血管重塑，表现为小肺动脉的内膜增厚、中层肥厚和丛状病变形成。在此过程中，血管平滑肌细胞（SMCs）的异常增殖和迁移驱动了血管壁增厚和管腔狭窄[2]。新兴证据表明，高迁移性组盒1（HMGB1）这种与损伤相关的分子模式蛋白，在肺血管重塑中起着关键作用，通过促进炎症、驱动SMCs增殖和促进细胞外基质（ECM）沉积[3],[4]。HMGB1在多个实验性PAH模型中显著上调[5],[6]。然而，HMGB1介导的异常SMCs表型背后的分子机制仍不完全清楚。目前的IPAH靶向治疗主要旨在通过诱导肺血管扩张来缓解症状。尽管定期治疗，但这些疗法在阻止肺血管重塑方面效果不佳，导致5年死亡率持续较高[7]。因此，阐明IPAH相关肺血管重塑中血管平滑肌细胞功能障碍的分子机制至关重要。具体来说，识别异常增殖和迁移的关键驱动基因将加深我们对IPAH发病机制的理解，并可能有助于开发新的靶向疗法。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一项新兴技术，能够实现高分辨率的基因表达谱分析和多维细胞分析[8],[9]。与批量RNA测序不同，后者测量混合细胞群体的平均转录水平，scRNA-seq可以解析细胞异质性并识别不同的细胞亚型[10]。这种精确的方法是解码疾病相关转录组数据的强大工具，有助于识别复杂疾病中的致病细胞亚群、关键调控基因和失调的细胞状态[11],[12],[13]。此外，scRNA-seq还能定量分析疾病微环境中的细胞间通信，揭示主要的通信细胞亚型及其在疾病进展中的作用[14]。鉴于这些优势，本研究应用scRNA-seq系统地绘制了IPAH肺组织的单细胞转录图谱。通过筛选与SMCs病理激活相关的枢纽基因，在动物模型中验证它们，并评估它们在SMCs增殖和迁移中的作用，本研究旨在识别IPAH发病机制中的关键驱动基因。这些发现为IPAH的发病机制提供了新的见解，并突出了这些枢纽基因作为潜在治疗靶点的可能性。

章节片段

数据来源

IPAH相关的scRNA-seq数据集GSE169471包含3名IPAH患者和6个健康对照者的肺样本，来自基因表达组学数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），用于筛选和识别关键驱动基因。

scRNA-seq数据预处理和分析

scRNA-seq数据使用R（v4.4.1）中的Seurat包（v5.1.0）进行处理和分析[15]。首先进行了质量控制过滤，保留了检测到200-5,000个基因且线粒体基因比例低于15%的细胞

scRNA-seq数据的质量控制、预处理和细胞亚型注释

在对GSE169471数据集进行质量控制后（图1A），使用Harmony算法校正了批次效应，以减少批次间的技术变异。校正前后数据分布的比较确认了批次诱导的异质性已成功消除（图1B）。质量控制和批次校正后保留了24,711个高质量细胞用于后续分析。接下来，确定了细胞间标准化方差最高的2,000个基因作为HVGs（

讨论

IPAH的病理机制很复杂，SMCs的功能障碍是疾病发病机制的关键因素[2]。本研究结合了scRNA-seq分析与体内和体外实验验证，确定了COL1A1、MYL9、COL1A2和TPM2作为IPAH的潜在关键驱动基因。

首先，细胞通信分析显示SMCs与其他细胞亚型的相互作用最多，相互作用强度最强，使它们成为主要的细胞亚型

结论

总之，单细胞转录组分析强调了SMCs在IPAH发病机制中的关键作用，并确定了COL1A1、MYL9、COL1A2和TPM2作为关键枢纽基因。在MCT诱导的PAH大鼠模型中，这些基因的异常上调以及体外功能验证表明它们具有作为IPAH治疗靶点的潜力。

报告工作的支持

作者声明，本报告的工作未获得任何第三方的财务或非财务支持。手稿中披露的公共资金来源（中国国家自然科学基金、兰州大学第二医院及临床医学院的重点孵化项目资金以及兰州大学第二医院的崔英科技创新计划）符合期刊要求，不需要额外

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CRediT作者贡献声明

李芳伟：撰写 – 审稿与编辑、项目管理、资金获取、概念构思。张琪：方法学。王一杰：可视化、方法学、研究。胡亚婷：监督、方法学。李斌斌：撰写 – 原始草稿、验证、软件、方法学、研究。朱恩鹏：可视化、验证、软件、数据管理

伦理批准

所有动物实验均按照NIH指南进行，并获得了兰州大学第二医院动物伦理委员会的批准（批准编号D2023-054）。

利益冲突声明

作者声明他们没有利益冲突。

数据和材料的可用性

数据集GSE169471从GEO数据库下载（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。本研究期间生成或分析的其他数据也包含在本文中。

资助

本工作得到了中国国家自然科学基金（编号82360014）、兰州大学第二医院及临床医学院的重点孵化项目资金（编号2025-23-zdfy-004）以及兰州大学第二医院的崔英科技创新计划（编号CY2023-MS-B05）的支持。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢兰州大学第二医院崔英生物医学研究中心在实验过程中提供的技术支持。