贝莱斯芽孢杆菌LUB-8生物强化：一种降低中国浓香型白酒窖泥中乳酸含量的策略

《Microbiology Spectrum》：Bacillus velezensis LUB-8 bioaugmentation: a strategy for lactic acid reduction in pit mud of Chinese nong-xiang baijiu

　　

：窖泥中乳酸的过度积累是导致窖泥老化、影响中国浓香型白酒品质的关键问题。本研究提出了一种通过接种贝莱斯芽孢杆菌LUB-8以调控窖泥微生物群落并降解乳酸的生物强化策略。纯培养实验表明，LUB-8菌株能高效利用乳酸，将其转化为丙酮酸和乙酸。乳酸降解量达到1.65 ± 0.04 g，降解率为82.65%。在为期60天的窖泥发酵实验中，经LUB-8强化的窖泥乳酸含量较对照组显著降低了9.63%。高通量测序分析显示，生物强化显著改变了窖泥的微生物群落结构，增加了毛螺菌科相关细菌属和罗姆布芽孢杆菌属的相对丰度，并重塑了微生物互作网络。此外，PICRUSt2功能预测进一步揭示，在生物强化组中，参与乳酸利用和乙酸/丁酸合成途径的关键酶编码基因丰度显著上调。总之，本研究证实了贝莱斯芽孢杆菌LUB-8在缓解窖泥乳酸积累方面的潜力，为改善浓香型白酒发酵的微生物生态系统提供了一种有效的调控策略。

一、 研究背景、问题与目的

浓香型白酒是中国传统发酵食品的代表，其独特的风味（如窖香、醇甜、协调、悠长）与窖泥（Pit Mud, PM）中的微生物群落活动密切相关。窖泥是一种特殊的黄粘土，覆盖在发酵窖池的四壁和底部，是多种酿造微生物的家园，在驱动发酵和产生风味化合物（如有机酸及其酯类）方面发挥核心作用。然而，在长期（数十年甚至上百年）的连续使用中，窖泥可能出现退化现象。窖泥退化的本质是乳酸的过度积累。乳酸积累会导致乳酸钙和乳酸亚铁的形成，使窖泥变得灰白、干燥、硬化，此即窖泥老化。更严重的是，乳酸积累还会导致白酒中乳酸乙酯含量过高，破坏风味协调性。因此，有效降低窖泥中的乳酸含量，防止窖泥退化并保障浓香型白酒的发酵品质，是白酒行业面临的一个关键挑战。

传统的乳酸调控方法（如优化窖池构建、改善窖泥和酒曲质量）多关注于工艺参数与乳酸含量的相关性，而对实现“乳酸降低”过程中功能性微生物群演替的本质信息了解仍不完整。近年来，接种乳酸降解菌的生物强化方法被认为是有效降低乳酸含量的潜在策略，但其强化机制尚未完全阐明。本研究旨在评估从窖泥中分离的乳酸降解菌——贝莱斯芽孢杆菌LUB-8用于窖泥生物强化、降低乳酸含量的可行性，并深入探究其对乳酸代谢、微生物群落和互作的影响机制，以期为改善窖泥微生态系统提供有效的调控策略和微生物资源。本研究发表于《Microbiology Spectrum》。

二、 主要关键技术方法

研究人员从四川绵阳某酒厂的浓香型白酒窖泥中分离得到贝莱斯芽孢杆菌LUB-8菌株。在实验室规模下，核心研究包括：

1. 1.
   菌株代谢特性分析：在纯培养条件下，利用高效液相色谱法监测LUB-8对乳酸的降解及其代谢产物（丙酮酸、乙酸）的生成，并预测其代谢途径。
2. 2.
   窖泥模拟发酵实验：将PM样品分为对照组和接种LUB-8的处理组，在厌氧条件下进行60天发酵。通过五点采样法取样，使用高效液相色谱法检测发酵后窖泥及蒸馏所得基酒中的有机酸和风味物质含量。
3. 3.
   微生物群落分析：提取窖泥样品DNA，对细菌16S rRNA基因V3-V4区进行PCR扩增，在Illumina NovaSeq平台进行测序。利用QIIME2软件进行生物信息学分析，包括生成扩增子序列变体、计算α多样性指数、进行主成分分析和绘制群落组成柱状图/热图。
4. 4.
   功能与关联分析：通过计算Spearman秩相关系数构建微生物互作网络；利用中性群落模型分析群落构建过程；通过冗余分析探究优势微生物与有机酸的相关性；并使用PICRUSt2工具基于KEGG数据库预测与有机酸代谢相关的功能基因丰度变化。

三、 研究结果

1. 贝莱斯芽孢杆菌LUB-8的代谢特性

纯培养实验表明，LUB-8菌株在乳酸为唯一碳源的培养基上生长良好，发酵8天后可降解1.65 g乳酸，降解率达82.65%。在降解乳酸的同时，培养液中丙酮酸和乙酸含量逐渐增加，表明LUB-8能将乳酸转化为丙酮酸和乙酸。

2. 生物强化对窖泥和基酒中有机酸的影响

经LUB-8生物强化60天后，处理组窖泥中的乳酸含量从42.07 g/kg显著降至38.20 g/kg，乳酸与己酸、乳酸与乙酸的比值也显著下降。在蒸馏所得基酒中，处理组的乳酸和乳酸乙酯含量也显著降低，分别下降了8.60%和10.31%。

3. 生物强化对细菌群落多样性的影响

α多样性分析显示，LUB-8的添加显著增加了窖泥中微生物的物种多样性和均匀度（香农指数和辛普森指数升高），但降低了物种丰富度（Chao1指数和ACE指数降低）。

4. 生物强化对细菌群落结构的影响

主成分分析表明，发酵后处理组与对照组的微生物群落结构明显分离。在门水平上，处理组中厚壁菌门的丰度显著增加。在属水平上，处理组中乳杆菌属的丰度显著降低，而毛螺菌科相关细菌属、惰性乳杆菌属和罗姆布芽孢杆菌属的丰度显著增加。

5. 生物强化对微生物种间互作的影响

微生物互作网络分析显示，生物强化改变了窖泥中的微生物关联模式。处理组中，毛螺菌科相关细菌属与其他微生物的关联更为复杂，芽孢杆菌属与例如嗜蛋白菌属、梭菌属等的关联也得到增强。0.6). Different colored circles correspond to different clusters of elements.">

6. 强化窖泥中的微生物群落构建

中性群落模型分析表明，处理组中随机过程对群落构建的贡献略高于对照组（分别为59.1%和57.1%），迁移率略低。这表明LUB-8的引入可能打破了窖泥原有的微生态平衡，改变了种间关联网络，并通过降低乳酸浓度改变了微环境的选择压力，从而增强了群落构建中随机过程的贡献。

7. 微生物与有机酸的相关性

冗余分析显示，芽孢杆菌属、梭菌属、惰性乳杆菌属、罗姆布芽孢杆菌属与乳酸呈负相关，与丁酸呈正相关。同时，芽孢杆菌属与乳杆菌属之间也呈负相关。

8. 窖泥微生物群落功能组成分析

PICRUSt2功能预测分析表明，生物强化后，参与乳酸利用和乙酸合成的关键酶（如乳酸脱氢酶、醛脱氢酶）编码基因丰度显著上调。同时，与丙酮酸代谢相关的酶（丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酰胺乙酰转移酶）的丰度也增加。 这支持了LUB-8通过乳酸脱氢酶催化乳酸转化为丙酮酸，继而生成乙酸的代谢途径预测，表明生物强化确实加速了发酵系统中乳酸的利用。

四、 总结与讨论

研究结论翻译：

本研究证实，贝莱斯芽孢杆菌LUB-8可通过生物强化显著降低窖泥中的乳酸含量，促进其代谢转化，并优化与有机酸代谢相关的细菌群落结构和基因表达，从而实现对浓香型白酒窖泥微生物生态系统的有效调控。然而，本研究仅采用扩增子测序分析群落结构，且为实验室规模。此外，该菌株乳酸降解的分子机制及其在工业应用中的有效性仍需进一步研究和验证。尽管如此，这些发现为调控窖泥乳酸积累提供了新的功能性微生物资源，对酿造微生物学的应用研究具有重要的参考价值。