产前接触金属会减轻胎盘中的CRH相关DNA甲基化对婴儿2个月大时沟通能力的影响

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Prenatal metal exposure moderates the effect of CRH-related DNA methylation in the placenta on infant communication outcomes at 2 months of age

　　杜思思|严洁文|陈丽华|傅玛丽|叶冉冉|王璐|吴晓霞|文萍|涂新志|田富英
中国广东省广州市南方医科大学公共卫生学院，邮编510515

**摘要**
**背景/目的**
产前压力和环境中的金属混合物会影响神经行为发育，但它们之间的相互作用及其通过胎盘表观遗传学的潜在机制仍不清楚。我们研究了产前金属混合物是否调节了从分娩时母体压力（促肾上腺皮质激素，CRH）到婴儿神经行为发育的表观遗传途径。

**方法**
在一个由120对母婴组成的前瞻性队列中，我们测量了分娩时母体的血浆CRH水平、胎盘DNA甲基化（Infinium EPIC v2.0）以及18种金属在胎盘中的浓度（ICP-MS）。在婴儿2个月大时，使用《年龄与阶段问卷》第三版（Ages & Stages Questionnaires, Third Edition）评估其神经行为发育情况。我们进行了因果中介分析，以识别差异甲基化区域（DMRs）。然后，我们使用加权分位数和（WQS）指数来测试金属混合物的效应调节作用，以评估18种金属混合物对神经行为发育的联合影响，并进行了性别分层分析。

**结果**
注释为GNAS、ZMYND10和CLIP4的胎盘DMRs显著调节了母体CRH与婴儿神经行为发育之间的关联，涉及五条表观遗传途径（ACME p值<0.05）。CRH通过CLIP4影响沟通能力的途径受到金属混合物的显著调节（交互作用p值=0.048），其中钠（18.3%）、钾（15.2%）、汞（11.9%）和铜（11.5%）的贡献最大。较高CLIP4甲基化与较低沟通能力得分之间的不良关联在低暴露水平时显著，但随着暴露量的增加而减弱。性别分层分析显示，这种调节作用在男婴中显著（交互作用p值=0.030），而在女婴中不显著（交互作用p值=0.734）。

**结论**
我们的研究表明，产前金属混合物以性别依赖的方式调节了将母体压力与神经行为发育联系起来的胎盘表观遗传途径。这强调了使用多暴露框架来理解健康和疾病发展起源的必要性。

**1. 引言**
分娩时的母体压力表现为促肾上腺皮质激素（CRH）的显著升高（Kassotaki等人，2021；Valsamakis等人，2020；Zoubovsky等人，2020），这与生理变化相关，包括氧化应激增加和内分泌失调（Krontira等人，2020；Zoubovsky等人，2020）。大量证据表明，这些与压力相关的生理变化可以影响胎儿的编程，从而增加后代神经行为发育异常的易感性（Collins等人，2024；Krontira等人，2020；Musillo等人，2023；Van den Bergh等人，2020）。DNA甲基化可以受到环境暴露的影响（Cao-Lei等人，2020；Ghazi等人，2021；Jirtle和Skinner，2007）。这些稳定的表观遗传修饰调节基因表达，导致持久的生物学和功能后果（Jones，2012；Schübeler，2015）。作为子宫内环境的关键调节器（Burton和Fowden，2015），胎盘容易受到此类表观遗传变化的影响（Bozack等人，2021；Ghazi等人，2021），这可能破坏重要的胎盘功能，如母胎转运和内分泌信号传导（Burton和Fowden，2015；Grundeken等人，2024；Schneider等人，2023；St-Pierre等人，2016），从而对胎儿的神经行为发育产生深远影响（Kassotaki等人，2021；Krontira等人，2020；Sandman等人，2018；Tian等人，2020）。这一途径为压力的“生物学嵌入”提供了合理的机制，即压力引起的胎盘表观遗传变化影响婴儿的神经行为发育（Kassotaki等人，2021），建立了长期的发展轨迹（Van den Bergh等人，2020）。然而，分娩时母体压力对胎盘DNA甲基化的编程并非孤立发生。母胎单元暴露于多种环境因素中，这些因素也会影响这一编程途径（Braun等人，2016；Rokoff等人，2023）。事实上，累积的母体心理社会压力和环境暴露越来越被认为共同影响全基因组的胎盘DNA甲基化格局（Brunst等人，2018；Nye等人，2014）。因此，压力编程的表观遗传变化的生物学影响可能受到这些环境共同暴露的调节（Vieira等人，2021）。在这些共同暴露中，环境金属混合物是一种普遍且值得关注的暴露类型（Claus Henn等人，2017；Liu等人，2022；Sanders等人，2015；Schildroth等人，2022）。重金属已知通过多种机制损害胎儿发育，包括诱导严重的氧化应激（Valko等人，2016）、基因毒性介导的细胞凋亡（Bhardwaj等人，2024；Panchal和Bhardwaj，2024）、内分泌信号传导失调（Bj?rklund等人，2020；Halabicky等人，2024；Rivera-Nú?ez等人，2021）以及母胎转运受损（Dong等人，2023；Grundeken等人，2024）。这些不良过程越来越多地涉及DNA甲基化修饰（Appleton等人，2017；India-Aldana等人，2026）。值得注意的是，这些表观遗传反应通常表现出性别依赖性模式（Huff等人，2025）。鉴于这种深刻的机制重叠，本研究旨在探讨金属混合物暴露和产前压力与婴儿神经行为发育之间的表观遗传途径。我们假设较高的累积金属暴露会增强或减弱这种表观遗传中介途径的强度。首先，我们确定了特定的胎盘差异甲基化区域（DMRs），这些区域调节了分娩时母体CRH与2个月大婴儿神经行为发育之间的关联。然后，我们使用加权分位数和（WQS）回归检验了产前金属混合物调节母体CRH与神经行为发育之间途径强度的假设。此外，我们进行了性别分层分析，以探讨这些调节表观遗传过程中的潜在性别依赖性脆弱性。

**2. 方法和材料**
**2.1. 研究人群**
我们在2022年6月至2023年2月期间招募了589名在深圳妇产医院分娩的孕妇，建立了前瞻性队列。纳入标准为：（1）在深圳接受产前护理和分娩；（2）母亲年龄在18-45岁之间，单胎妊娠。排除标准包括：（1）诊断出严重的妊娠相关并发症，如妊娠高血压或先兆子痫；（2）母亲有精神疾病史或药物滥用史；（3）婴儿患有先天性遗传代谢疾病、神经系统畸形或其他重大器质性病变。从该队列中，选择了120对母婴，其胎盘DNA甲基化和金属浓度数据完整，纳入了当前分析。采样策略对妊娠糖尿病（GDM）患者进行了过度抽样。尽管GDM不是本研究的重点，但通过全面的敏感性分析评估了其潜在的混杂效应（见2.8节）。研究方案获得了深圳妇产医院伦理委员会的批准（批准编号：SFYLS [2023]011）。所有参与者在入组前均提供了书面知情同意书。

**2.2. 母体CRH测量**
分娩时采集了5毫升母体外周静脉血，置于EDTA管中。样本在4°C下保存，并在24小时内运输到实验室。通过离心分离血浆，并立即将等分样本冷冻在-80°C。排除了溶血或脂血样本。使用竞争性Human CRH ELISA试剂盒（武汉Fine Biotech有限公司，武汉）测量血浆CRH浓度。该试剂盒的检测范围为2.19–140 pg/mL，灵敏度为1.4 pg/mL。 intra-assay和inter-assay变异系数（CVs）分别≤6.2%和≤6.43%。由于分布偏斜，母体CRH浓度经过log2转换以接近正态分布，便于统计分析。三个缺失值（<3%的样本）使用非缺失值的平均值进行插补（Sterne等人，2009）。此后，“母体CRH”指这些log2转换后的浓度。

**2.3. 胎盘样本采集和DNA甲基化评估**
分娩后，经过培训的助产士从胎儿侧采集了胎盘组织样本（每个样本体积为1立方厘米）。采样位置距离脐带插入点3厘米，同时避免钙化区域，遵循国际标准的胎盘组织采集指南（Burton等人，2014）。组织用生理盐水冲洗三次以去除血液污染，然后在采集后4小时内冷冻在-80°C。使用DNeasy Blood & Tissue Kit（QiAGEN，德国Hilden）分离基因组DNA（gDNA）。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）评估gDNA的纯度和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳确认。合格的gDNA样本经过亚硫酸盐转化（Bibikova等人，2011），并在大约935,000个CpG位点使用Infinium Methylation EPIC v2.0 BeadChip（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行全基因组DNA甲基化评估（Kaur等人，2023；Peters等人，2024）。原始EPIC v2.0阵列数据使用minfi R包（Aryee等人，2014）进行处理。使用preprocessNoob函数进行背景校正和染料偏差标准化（Fortin等人，2014）。探针级质量控制（QC）（补充图S1）包括：（1）针对已知单核苷酸多态性（SNPs）的探针（Zhou等人，2017）；（2）在超过1%的样本中检测值（P>0.01）较低的探针；（3）先前鉴定出的交叉反应探针（Peters等人，2024；Chen等人，2013；Pidsley等人，2016）；（4）性染色体上的探针。我们通过随机化样本放置和使用sva R包中的ComBat函数进行计算调整，消除了BeadChips对DNA甲基化的批次效应（Johnson等人，2007）（补充图S2-S7）。DNA甲基化水平表示为β值（0-1），并通过对数转换（log2）为M值，用于回归分析（Du等人，2010）。

**2.4. 胎盘RNA提取和转录组测序**
从部分胎盘样本（n=46）中提取总RNA。RNA完整性数（RIN）≥7的样本在NovaSeq 6000平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上进行转录组测序，使用PE150读长。使用FastQC（v0.10.1）对原始FASTQ读长进行质量检查。应用严格的预处理流程生成高质量清洁读长，包括：（1）使用trimadap进行接头修剪；（2）去除低质量3′末端碱基（Phred分数<20）；（3）修剪后去除长度小于25 bp的读长；（4）使用bowtie2（v2.2.6）将污染的核糖体RNA（rRNA）读长去除。将清洁后的读长与人类参考基因组（GRCh38/hg38）对齐，使用HISAT2（v2.0.4）（Kim等人，2015）。使用Stringtie（v1.3.3b）（Trapnell等人，2010）将基因表达量化为每百万映射读长的片段数（FPKM）。为了后续分析，过滤FPKM矩阵，移除在少于30%的样本中表达的基因，使用基因特异性平均值插补缺失值，并最终进行log2转换（log2(FPKM+1)以稳定方差。

**2.5. 胎盘金属浓度评估**
使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，Model 7800；Agilent Technologies，美国加利福尼亚州圣克拉拉）（Fang等人，2024；Grundeken等人，2024）测量了20种金属（Na、Mg、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Cd、Hg、Pb和Al）在胎盘组织中的浓度。在仪器分析之前，胎盘组织经过微波辅助酸消化处理，使用浓硝酸（HNO3）和过氧化氢（H2O2）完全矿化有机基质，遵循人类组织的标准制备协议（Appleton等人，2017；Rivera-Nú?ez等人，2021）。由于检测率低于70%，铅（Pb）和铝（Al）被排除在分析之外（补充表S1）。对于其余18种金属，低于检测限（LOD）的浓度被插补为LOD/√2（Rivera-Nú?ez等人，2021）。所有金属浓度都进行了自然对数转换，以减少偏斜，以便进行统计分析。为了评估18种金属混合物对神经行为发育的综合影响，我们使用WQS回归为每位参与者构建了一个综合暴露指数（Carrico等人，2015；Chen等人，2022；Vuong等人，2020）。这种方法允许在考虑单一金属间多重共线性的同时估计混合物的效应。首先，我们进行了初步分析，以确定金属混合物指数与神经行为发育结果之间的独立关联（详见补充材料S1.1和S2.1节，补充表S2）。

**2.6. 神经行为发育评估**
在婴儿2个月大时，使用《年龄与阶段问卷》第三版（ASQ-3）（Velikonja等人，2017；Squires等人，2009）评估其神经行为发育。ASQ-3是一种标准化的、由家长完成的问卷，用于监测发育进展。与其在流行病学研究中的应用一致，ASQ-3用于生成反映五个领域发育表现的连续分数：沟通、粗大运动、精细运动、问题解决和个人社交技能，而不是作为发育迟缓的临床筛查工具（日本环境儿童研究组，2022；日本环境儿童研究组，2022；Dai等人，2022）。一名经过培训的研究助理向主要照顾者（主要是母亲）提供了标准化指导。对于照顾者表示不确定的条目，根据ASQ-3用户指南提供了澄清。所有问卷均由研究团队审核，对于模糊的回答，我们进行了后续的电话确认。每个领域的得分是一个原始分数（范围：0–60），并将其视为连续变量。由于这些分数是离散的且通常分布不均匀，因此进行了基于等级的逆正态转换（INT），以满足线性回归模型的假设（Guo等人，2025年；Beasley等人，2009年）。2.7. 协变量我们从医疗记录中获取了分娩时母亲年龄（岁）、分娩时妊娠期（天）、胎次（初产/多产）、孕前体重指数（BMI，kg/m2）和婴儿性别（男/女）的信息。我们使用sva R包进行了替代变量分析，以估计解释胎盘甲基化数据中的细胞异质性和其他未测量混杂因素的替代变量（SVs）（Arockiaraj等人，2020年；Leek等人，2012年）。2.8. 统计分析连续变量对于正态分布的数据用平均值（标准差，SD）描述，对于非正态分布的数据用中位数（四分位数范围，IQR）描述。分类变量用频率和百分比（%）描述。我们通过使用Student's t检验和卡方检验将研究样本的代表性（N = 120）与整个队列（N = 589）进行比较来评估。首先，进行了全基因组关联研究（EWAS），以识别与母亲CRH相关的差异甲基化位点（DMPs），并在单独的模型中识别与每个ASQ-3领域得分相关的DMPs。所有模型都调整了协变量。基因组膨胀因子（λ）表明膨胀最小（补充图S8–S13）（Rakyan等人，2011年）。统计显著性定义为假发现率（FDR）调整后的p值< 0.05（Storey和Tibshirani，2003年）。为了探索潜在的单个CpG位点的中介作用，我们检查了任何单个CpG位点是否同时与母亲CRH和ASQ-3领域有显著关联，因为这种重叠在名义上支持中介作用。随后，使用DMRcate R包（Peters等人，2021年）识别了与母亲CRH（DMRs-CRH）和每个神经行为发展得分（DMRs-Neuro）相关的DMRs。该算法使用高斯核平滑CpG级测试统计量（带宽λ = 1000 bp，缩放因子C = 2）（Peters等人，2015年）。DMR的显著性由Stouffer调整后的p值< 0.05确定（Peters等人，2021年）。采用了两阶段策略来定义将母亲CRH与神经行为发展联系起来的“途径DMRs”。首先，识别了DMRs-CRH和DMRs-Neuro相同或部分重叠的候选基因组区域。对于标注为同一基因的部分重叠DMRs，我们通过取它们的基因组坐标的并集来定义一个整合区域。其次，我们通过要求这些整合区域内的平均DNA甲基化水平与母亲CRH和相应的神经行为发展结果在完全调整后的模型中显著相关（p值< 0.05）来验证这些整合区域。使用mediation R包进行了因果中介分析，以测试途径DMRs是否介导了母亲CRH与相应神经行为发展结果之间的关联（Yimer等人，2023年）。我们进一步研究了这些中介途径是否受到胎盘金属混合物的调节，这些混合物通过WQS指数量化。我们选择WQS回归进行这项分析，因为它能够有效地模拟混合物的综合单向效应，从而增强检测关联的统计能力。此外，该方法产生的组分权重可以识别出对混合物效应有主要贡献的因素，这对于生物学解释至关重要。通过在回归模型中包含WQS指数和自变量之间的交互项来测试调节作用。如果交互项在母亲CRH与DMR甲基化之间的关联或DMR甲基化与神经行为发展结果之间的关联的模型中具有统计显著性（p值< 0.05），则宣布存在显著的调节作用。此外，考虑到神经行为发展易感性可能存在性别差异，我们进行了性别分层的调节分析。我们评估了产前金属混合物（WQS指数）对连接CRH与神经行为发展的途径的调节作用在男性（n = 66）和女性（n = 54）婴儿之间的差异。为了探索生物学功能，我们进行了：（1）在转录组子样本（n = 46）中进行了表达定量甲基化（eQTM）分析，将途径DMR甲基化与100 kb顺式窗口内的基因表达相关联（Volkov等人，2017年；Bell等人，2011年；Stranger等人，2007年）；以及（2）使用missMethyl R包（FDR p值< 0.05）对标注为途径DMRs的基因和与eQTM显著相关的基因进行了基因本体（GO）和京都基因组与基因组百科全书（KEGG）途径富集分析（Geeleher等人，2013年）。为了评估我们的发现不受GDM富集队列潜在偏倚的影响，我们进行了全面的敏感性分析。我们通过将GDM病例的比例减少到非GDM仅有的组（n = 63）来创建五个分析亚组。在每个亚组中，我们重复了DMP和DMR的识别，并通过相关效应大小和检查排名最高的DMRs的一致性来评估结果的稳定性。所有统计分析均在R（版本4.4.1）中进行。除非另有说明，否则双侧p值< 0.05被视为具有统计显著性。3. 结果3.1. 研究人群特征120对母亲-婴儿的人口统计和临床特征总结在表1中。母亲的平均年龄（SD）为31.1（4.0）岁，孕前BMI的平均值为25.9（3.0）kg/m2，平均而言，该人群属于超重。所有婴儿均为足月出生（平均妊娠期275.8±6.6天）。该人群主要为初产妇（72.5%），婴儿性别分布平衡（55.0%为男性）。与我们的设计一致，47.5%（n = 57）的母亲被诊断为GDM。表1. 研究人群的特征（N = 120）。特征N = 120母亲年龄，岁：平均值（SD）31.09（3.95）孕前BMI，kg/m2：平均值（SD）25.93（3.03）妊娠期，天：平均值（SD）275.75（6.58）母亲CRH浓度，pg/mL：中位数（IQR）242.77（202.66）Log2转换后的CRH：平均值（SD）7.79（0.87）胎次：N (%) 初产87（72.50） 多产33（27.50）婴儿性别：N (%) 男性66（55.00） 女性54（45.00）GDM参与者：N (%) 是57（47.50） 否63（52.50）婴儿神经行为发展 交流得分：中位数（IQR）55.00（15.00） 大肌肉技能得分：中位数（IQR）55.00（6.25） 精细肌肉技能得分：中位数（IQR）50.00（15.00） 解决问题得分：中位数（IQR）50.00（10.00） 个人-社交技能得分：中位数（IQR）50.00（10.00）18种测量金属的胎盘浓度与背景环境暴露一致（补充表S3；补充图S14-S15）。必需元素，包括钠（中位数：2875.00 mg/kg）、镁（50.55 mg/kg）、钾（674.50 mg/kg）、钙（290.00 mg/kg）、铁（71.95 mg/kg）和锌（7.45 mg/kg），其浓度较高。相比之下，已知的有毒金属如砷、镉和汞的检测水平较低（均低于1.00 mg/kg）。与完整的招募队列（N = 589）相比，我们的研究人群在母亲年龄、孕前BMI、妊娠期或婴儿性别方面没有显著差异；然而，GDM和初产的比例较高（补充表S4）。这些差异在所有回归模型中得到了考虑。基线特征在完整分析集（N = 120）和转录组子集（n = 46）之间没有显著差异。3.2. 单个CpG水平上胎盘DNA甲基化与母亲CRH和神经行为发展的关联为了探索分娩时母亲压力的表观遗传特征，我们的初步EWAS在胎盘组织中识别出了252个与母亲CRH水平相关的DMPs（FDR p值< 0.05；补充表S5和补充图S16），绝对调整后的系数范围从每增加一倍的母亲CRH的0.05%到5.31%。针对每个神经行为发展领域的单独EWAS模型识别了交流（n = 340）、大肌肉（n = 200）、精细肌肉（n = 734）、解决问题（n = 1061）和个人-社交技能（n = 152）的DMPs（补充表S6–S10和补充图S17-S21），效应大小相当（绝对β系数范围从0.03%到6.37%）。值得注意的是，我们观察到五个不同神经行为发展领域的DMP集合之间没有重叠。此外，252个与CRH相关的DMPs中没有与任何与神经行为发展相关的DMPs重叠。全面的敏感性分析表明，我们的核心EWAS发现是稳健的，并且不受本研究中GDM过度采样的影响。在GDM比例降低的亚组之间，DMPs的效应大小仍然高度相关（Pearson’s r > 0.96）（补充图S22-S27）。3.3. 区域DNA甲基化将母亲CRH与婴儿神经行为发展联系起来由于缺乏单个CpG的重叠，并考虑到我们的假设，即表观遗传调控通常通过基因组区域的协调变化发生，接下来我们进行了区域分析。这种方法识别了78个与母亲CRH相关的DMRs（补充表S11）以及每个神经行为发展领域的DMR集合：交流（n = 114）、大肌肉（n = 55）、精细肌肉（n = 88）、解决问题（n = 111）和个人-社交技能（n = 69）（补充表S12-S16）。通过应用我们的两阶段整合策略，我们识别并验证了五个将母亲CRH与特定婴儿神经行为发展联系起来的“途径DMRs”。验证确认每个整合区域的平均甲基化水平仍然与CRH和相应的神经行为发展结果显著相关（补充图S28）。这些途径DMRs涉及三个基因——GNAS、ZMYND10和CLIP4——它们都位于具有强烈活跃调控功能特征的基因组区域内（图1）。下载：下载高分辨率图像（854KB）下载：下载全尺寸图像图1. 识别和基因组特征化将母亲CRH与婴儿神经行为发展联系起来的途径DMRs。该图展示了五个独特的基因组位点，其中差异甲基化区域（DMRs）与母亲CRH和特定的婴儿神经行为发展结果同时相关。每个面板对应一个不同的途径：（A）GNAS位点中的甲基化与母亲CRH和婴儿解决问题得分相关。（B）GNAS位点中的甲基化与母亲CRH和婴儿精细肌肉技能相关。（C）ZMYND10位点中的甲基化与母亲CRH和婴儿精细肌肉技能相关。（D）CLIP4位点中的甲基化与母亲CRH和两个结果相关：婴儿交流得分和个人-社交技能。具体来说，GNAS位点中的一个CRH相关DMR与解决问题（图1A）和精细肌肉技能（图1B）相关的DMRs重叠。ZMYND10中的一个整合DMR将CRH与精细肌肉技能联系起来（图1C）。一个跨越13个CpGs的相同DMR，并标注在CLIP4基因的一个大CpG岛上，与母亲CRH和两个不同的结果相关：婴儿交流和个人-社交技能（图1D）。敏感性分析进一步表明，这些关键的途径DMRs在大多数GDM减少的亚组中得到了稳健的识别（补充表S17–S22）。为了探索甲基化的潜在功能后果，我们在转录组子样本中进行了eQTM分析。该分析未发现途径DMRs（标注为CLIP4、GNAS和ZMYND10）处的甲基化与附近基因的表达之间存在显著关联（补充表S23）。随后对这些三个基因的功能富集分析没有产生任何FDR显著的GO或KEGG术语（补充表S24-S25）。然而，名义上显著的术语指出了合理的生物学作用，包括微管动态（CLIP4）、受体信号传导（GNAS）和纤毛组装（ZMYND10）。在每个面板中，从上到下的轨道分别是：染色体图谱：显示DMR在其相应染色体上的细胞遗传带位置。关联信号轨道：显示个别CpG位点与母亲CRH（蓝点）和相应的神经行为发展结果（红点）的统计显著性（-log??(P值)）的位点图。在D面板中，橙色点代表第二个相关结果（个人-社交技能）。x轴代表基因组位置。整合途径DMR轨道：可视化CRH相关DMR（DMR-CRH，蓝色）、结果相关DMR（DMR-neuro，红色）以及用于下游分析的最终整合或相同的“途径DMR”（黄色）的基因组坐标。基因组注释轨道：为该区域提供功能背景，包括ENSEMBL基因模型、CpG岛、DNase I超敏簇（指示开放染色质）和由ENSEMBL Regulatory Build定义的调控元件。注意：通过相同的CLIP4中的DMR（chr2:29114731–29115770）将CRH与个人-社交技能联系起来的第五个途径在图1D中显示，因为其基因组位置和特征与交流途径相同。3.4. 胎盘DMRs介导CRH与神经行为发展之间的关联为了正式测试所识别的DMRs是否作为分子中介，我们对每个途径进行了因果中介分析。这些分析显示，胎盘DNA甲基化作为五个途径的中介（表2）。我们观察到所有途径的显著平均因果中介效应（ACME），证实母亲CRH对神经行为发展的总效应的一部分是通过这些表观遗传修饰间接传递的。在其中四个途径中，这种中介作用发生在没有显著平均直接效应（ADE）的情况下，表明这些关联主要通过表观遗传机制发挥作用。唯一的例外是通过ZMYND10到精细肌肉技能的途径，它既表现出显著的ACME也表现出显著的ADE，后者为负值，这可能表明存在竞争性中介或抑制。这种在没有显著总效应的情况下出现显著间接效应的模式表明，胎盘DNA甲基化作为一个关键中介，将母体CRH的信号传递出来，影响婴儿的神经行为发展结果。鉴于所有五条途径都显示出显著的中介作用，我们接下来调查了这些途径是否受到产前金属混合物的影响。表2显示了胎盘DNA甲基化作为母体CRH与婴儿神经行为发展之间关联的中介作用。

基于已建立的中介模型，我们测试了金属混合物（WQS指数）是否改变了这五条途径。我们的分析显示，金属混合物显著调节了CLIP4甲基化与沟通得分之间的关系（交互作用p值为0.048；表3）。对WQS模型中沟通部分的权重分析表明，这种特定的混合物主要由微量元素和痕量金属驱动，其中钠（18.3%）、钾（15.2%）、汞（11.9%）和铜（11.5%）的贡献最大。

为了可视化这种调节作用，我们绘制了WQS指数处于低（第10百分位）、中位数（第50百分位）和高（第90百分位）时CLIP4 DMR甲基化与沟通得分之间的关联（图2B）。图表显示了一个模式：在产前金属暴露最低的婴儿中，较高的CLIP4甲基化与较低的沟通得分之间的不良关联强烈且具有统计学意义。值得注意的是，这种关联随着金属暴露水平的增加而逐渐减弱——这一趋势主要由Na、K、Hg和Cu驱动。相比之下，母体CRH与CLIP4甲基化之间的关联并未受到金属混合物的显著调节（图2A）。

这些发现表明，CLIP4甲基化的中介作用具有情境依赖性，且随着金属混合物的共同暴露增加，这一生物途径的强度会减弱。鉴于已知的性别在神经行为发展脆弱性和胎盘功能方面的差异，我们进行了分层分析，以检查金属混合物对已识别途径的调节作用在男性（n=66）和女性（n=54）婴儿之间是否存在差异。有趣的是，性别分层分析揭示了调节作用存在显著的性别依赖性模式。产前金属混合物（WQS指数）显著调节了男性婴儿中CLIP4 DMR与沟通之间的关联（β = 6.897，交互作用p值为0.030）。然而，在女性婴儿中并未观察到这种调节作用（交互作用p值为0.734）。性别分层调节模型的详细结果见补充表S26.4。

在本研究中，我们探讨了将母体CRH与婴儿神经行为发展联系起来的表观遗传机制，并进一步研究了产前金属混合物如何调节这些途径。我们的分析发现了两个主要发现：首先，我们确定了由GNAS、ZMYND10和CLIP4驱动的特定胎盘表观遗传途径，这些途径介导了母体压力对婴儿神经行为发展的生物学嵌入；其次，我们的发现表明CLIP4 DMR的中介作用受到产前金属混合物的调节。在金属混合物水平较低时，CLIP4甲基化与沟通之间的关联强烈且显著，但随着金属暴露的增加，这种调节作用减弱，并且在男性婴儿中显著，而在女性婴儿中则不显著。这些发现强调了胎盘作为一个关键接口的重要性，多种环境暴露在此交汇，并突出了理解胎儿神经发育编程需要考虑共同暴露因素的必要性。

我们初步分析的一个关键发现是识别并验证了五条通过胎盘DMRs将母体CRH与婴儿神经行为发展联系起来的表观遗传途径。类似的基于胎盘的表观遗传中介作用也已在产前压力和神经发育结果的研究中得到报道（Collins等人，2024年；Diez-Ahijado等人，2024年；Kassotaki等人，2021年；Sandman等人，2018年）。这些DMRs位于具有调控潜力的基因组区域，涉及对胎盘和神经元功能至关重要的基因（Diez-Ahijado等人，2024年；Tian等人，2020年）。

GNAS（鸟苷核苷酸结合蛋白α刺激因子）复合体中的DMR将CRH与解决问题能力和精细运动技能联系起来，位于20号染色体上的一个主要CpG岛内。该区域以开放染色质和活跃的增强子元素为特征，编码G蛋白α亚单位（Gsα）。作为G蛋白偶联受体（GPCR）信号传导的关键组成部分，Gsα调节内分泌稳态和神经元发育（Calebiro等人，2021年；Plagge等人，2004年）。这一印记位点的表观遗传完整性对正常发育至关重要，先前的研究已将异常的GNAS甲基化与发育障碍和宫内生长受限联系起来（Kawashima等人，2018年；Urakawa等人，2023年）。我们的发现与这些文献一致，表明母体压力可能破坏这一信号枢纽的精确表观遗传调控，从而影响下游的认知和运动发育（Monk等人，2019年；Cao-Lei等人，2020年；Argyraki等人，2019年）。

同样，ZMYND10（含有锌指结构的MYND10）中的DMR与精细运动技能相关，位于一个CpG岛（CpG 42）内，该岛具有启动子和增强子标记，表明其具有高度的调控潜力。ZMYND10对于驱动纤毛功能的动力蛋白组装至关重要，该基因的突变是原发性纤毛运动障碍的主要原因（Reiter和Leroux，2017年；Zariwala等人，2013年）。在胎盘中，原发性纤毛作为关键的细胞天线，感知并传递母体环境信号，从而调节关键的发育途径（Romberg等人，2022年；Anvarian等人，2019年）。ZMYND10的表观遗传失调可能会损害这种感知能力，干扰胎儿发育的微调。尽管直接证据将ZMYND10甲基化与神经行为发展联系起来的证据有限，但我们的发现提出了一种可能的机制，即分娩时的压力可能通过影响纤毛功能来破坏胎盘信号传导（Serpieri等人，2025年；Valente等人，2014年）。

此外，我们还发现了一条涉及CLIP4（含有CAP-Gly结构域的连接蛋白4）基因的途径，该基因将母体CRH与婴儿的沟通和个人社交技能联系起来。所识别的DMR跨越一个功能活跃的大型CpG岛，其特征是开放染色质和启动子及增强子的聚集。CLIP4编码一种微管相关蛋白，调节微管动态并稳定细胞骨架（Akhmanova和Steinmetz，2008年；Akhmanova和Steinmetz，2015年），这一过程对胎盘发育和运输功能至关重要（Redman等人，2022年；Burton和Fowden，2015年；Kn?fler等人，2019年）。大规模的荟萃分析证实了CLIP4甲基化（特别是在cg05819240和cg15747402位点）与循环C反应蛋白（CRP）之间的强关联，后者是一种与产前压力相关的系统性炎症标志物（Wielscher等人，2022年；WHI-EMPC冠状动脉心脏病表观遗传学研究组，2016年）。关于母亲吸烟（Sikdar等人，2019年）、多种环境毒素（Curtis等人，2021年）和其他与神经发育相关的暴露（Zhao等人，2019年）的额外EWAS研究也报告了CLIP4附近的DNA甲基化信号差异。尽管直接证据将胎盘CLIP4甲基化与母体CRH和早期神经行为联系起来的证据有限，但这些研究支持CLIP4甲基化作为对暴露反应的标志物，这与我们的中介发现一致。

为了功能上探索这些表观遗传标记，我们进行了eQTM分析（n=46）。我们没有发现途径DMRs甲基化与顺式基因表达之间存在显著的线性关联，这可能是由于统计功效有限（Bonder等人，2017年；Taylor等人，2019年），以及甲基化对转录稳定性、剪接和染色质结构的非线性影响（Schübeler，2015年；Lev Maor等人，2015年；Jones，2012年）。短暂的压力诱导的mRNA变化也可能被忽略，而甲基化标记则持续到分娩（Lappalainen和Greally，2017年；Teh等人，2014年）。尽管如此，暴露相关和结果相关的DMRs以及与细胞骨架和信号通路相关的GO/KEGG富集支持了这些位点的功能相关性。

值得注意的是，虽然我们观察到这些途径的平均因果中介效应（ACME）显著，但CRH对神经行为发展的总效应（TE）大体上不显著。这种模式通常被描述为不一致的中介作用或竞争性抑制，表明母体压力的影响是通过多个竞争性途径传递的（Igartua和Hayes，2021年；VanderWeele，2016年）。DNA甲基化代表了一种特定的生物学途径，能够捕捉压力的生物学嵌入。然而，在复杂的暴露环境中，直接的总效应可能被其他未测量的变量或相互抵消的生物学机制所掩盖（Lund等人，2025年；Rokoff等人，2023年）。这一发现强调了中介分析在环境流行病学中的价值，因为它能够分离出在总体关联模型中可能被掩盖的特定生物学机制。

我们已经确定了五条通过胎盘DMRs介导母体CRH与神经行为发展之间关联的途径，接下来测试了产前金属混合物是否改变了这些途径。我们的研究表明，CLIP4 DMR甲基化在母体CRH与婴儿沟通技能之间的中介作用受到金属混合物的调节。新兴证据表明，这种共同暴露可以共同影响早期胎儿发育（Brennan Kearns等人，2024年；Julvez等人，2021年）。先前的研究已经报告了母体压力和铅对DNA甲基化的联合效应（Sobolewski等人，2020年），以及心理社会压力与邻苯二甲酸盐或空气污染对神经发育的交互效应（Cowell和Wright，2017年；Rokoff等人，2023年）。最近的流行病学研究强烈支持化学混合物可以严重扰乱宫内内分泌环境（Govarts等人，2025年），并直接改变胎盘表观基因组，例如导致表观遗传妊娠年龄延迟（Huff等人，2025年）。这表明金属不仅仅是独立的风险因素，还可以作为改变压力信号生物学效力的关键环境修饰因子。

我们观察到，在较高的金属混合物暴露水平下，较高的CLIP4甲基化与较低的沟通得分之间的不良关联减弱。几种机制可以解释这一现象。首先，可能存在毒性掩盖效应。在高浓度下，金属混合物的直接神经毒性作用可能是导致发育缺陷的主要因素，超过了CLIP4甲基化的更微妙的调节作用（Dutta和Ruden，2024年；Sanders等人，2015年）。这一观点得到了广泛毒理学文献的支持，这些文献表明重金属（如镉）作为严重的毒素，会引起广泛的氧化应激、超微结构损伤和基因毒性介导的细胞凋亡（Jitender K. Bhardwaj等人，2021年；Jitender Kumar Bhardwaj等人，2021年；Panchal等人，2022年）。尽管体外模型表明某些金属诱导的细胞凋亡可以通过抗氧化剂缓解（Bikal和Bhardwaj，2025年；Siwach和Bhardwaj，2026年），但在现实世界的体内暴露中，金属混合物的累积负担可能会压倒内在的抗氧化防御机制。因此，金属的强烈毒性决定了神经行为发展，使得在高暴露背景下表观遗传影响变得微不足道。

其次，可能会发生信号干扰。许多参与染色质重塑和表观遗传读取的蛋白质（包括MBDs或转录因子中的锌指结构）依赖于锌离子来发挥作用（Cassandri等人，2017年）。有毒金属可以取代这些必需的离子，导致蛋白质功能失调，无法与DNA结合（Chen等人，2019年）。有证据表明，如镉和汞这样的金属可以直接干扰表观遗传读取蛋白的功能，可能使甲基化标记失去生物学活性（Bikal和Bhardwaj，2025年）。金属混合物的具体组成，主要由必需元素（Na、K）和神经毒素（Hg、Cu）主导，为CLIP4途径的特异性靶向提供了生物学解释（Braun等人，2016年）。钠和钾水平的升高会破坏对营养运输至关重要的电化学梯度，从而损害CLIP4所支持的依赖于细胞骨架的运输系统（Grundeken等人，2024年；Burton和Fowden，2015年）。此外，像汞和铜这样的神经毒素可以直接损害细胞骨架的完整性，在高暴露下与CLIP4稳定微管的作用产生功能对抗（Yu等人，2024年；Dórea，2019年；Valko等人，2016年；Jomova等人，2022年）。因此，由于金属严重破坏了CLIP4作用的物理结构，其表观遗传调控变得无关紧要。这一机制解释了我们的发现具有特异性，因为金属直接攻击CLIP4途径的细胞底物，而GNAS（Calebiro等人，2021年；Plagge等人，2004年）或ZMYND10途径（Reiter和Leroux，2017年；Zariwala等人，2013年）则没有这种情况。

我们的探索性性别分层分析显示，产前金属混合物对CLIP4-通信途径的调节作用在男婴中显著（交互作用p值=0.030），但在女婴中不显著（交互作用p值=0.734）。这一模式与文献中报告的男性对产前环境暴露更敏感的结果一致（Claus Henn等人，2017年；Sanders等人，2015年）。可能的机制包括胎盘异生物质代谢、表观遗传编程以及下丘脑-垂体-肾上腺轴发育的性别差异（Cowell和Wright，2017年；Rosenfeld，2015年）。鉴于分层分析的统计功效有限，这些发现仍处于探索阶段，需要在更大样本中进行验证。

除了这些机制上的见解外，我们研究的独特贡献在于推动了从单一暴露模型向全面暴露组学框架的转变，为基于精准度的母婴保健提供了坚实的科学基础。我们证明了相同程度的心理社会压力并不会产生统一的影响；相反，它可能会根据个体同时面临的环境化学负担导致不同的神经行为后果。我们的数据表明，为了有效的母婴筛查和干预，临床医生必须考虑“共同暴露情况”。例如，同时面临高压力和高金属暴露的母亲可能需要不同于仅面临压力的母亲的干预强度和重点。通过为这些交互效应提供生物学解释，我们的研究为以个体为中心的个性化产前护理提供了科学依据。将环境生物监测整合到常规母婴健康服务中，可以促进更精确的风险分层和个性化健康咨询，最终优化后代的神经发育保护。

4.3 强项和局限性
本研究有几个关键优势。首先，其前瞻性队列设计使我们能够在结果评估之前收集暴露和协变量数据，从而最小化了回忆偏差，并建立了产前暴露与婴儿神经行为发展之间的明确时间顺序。其次，我们超越了简单的单一暴露模型，研究了分娩时母亲的压力与产前金属混合物之间的复杂相互作用。这种多暴露框架能够模拟它们的交互作用，反映了更现实的环境健康范式，是一个重要的进步。

然而，也必须承认一些局限性。首先，我们的研究设计中对妊娠糖尿病（GDM）的母亲进行了过度抽样；然而，调整了GDM比例的敏感性分析显示了结果的稳健性，表明观察到的关联并非由这一选择特征驱动。其次，CRH浓度可能受到昼夜节律的影响，尽管我们通过将样本收集时间限制在特定时间段（8:00–15:00）来减轻了这一影响。第三，虽然CRH是综合生理压力的一个可靠指标（Kassotaki等人，2021年；Sandman等人，2018年），但它仅代表复杂母亲压力反应的一个方面；未来的研究应纳入更广泛的生物标志物组合（例如，儿茶酚胺、炎症细胞因子）以全面反映急性压力环境（Hajat等人，2019年；Thomson等人，2019年）。第四，我们的总体样本量，特别是性别分层的子样本，提供了有限的统计功效，需要在更大、独立的队列中进行进一步验证。最后，虽然我们提出了氧化应激和基因毒性介导的细胞凋亡作为金属毒性的潜在机制，但我们的研究缺乏这些细胞事件的直接生物标志物，这仍是未来研究的方向。

5. 结论
总之，我们的研究确定了特定的胎盘表观遗传途径，这些途径由GNAS、ZMYND10和CLIP4基因上的DNA修饰（DMRs）驱动，介导了母亲压力与婴儿神经行为发展之间的关联。CLIP4介导的压力与通信途径受到产前金属混合物的调节，且这种调节在性别上存在差异，男婴表现出更大的敏感性。这些发现表明，母亲的环境金属负担可以根本改变心理社会压力的生物学轨迹。

未来的研究应在更大样本中验证这些发现，采用暴露组学方法来表征多暴露相互作用，并确定针对性预防的关键干预窗口。采用多暴露框架对于推进健康和疾病的发育起源（DOHaD）以及将表观遗传发现转化为临床实践至关重要。

**作者贡献声明**
Fu-Ying Tian：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念化。
Xinzhi Tu：撰写——初稿、项目管理、方法学、研究。
Sisi Du：撰写——初稿、可视化、方法学、正式分析、数据管理、概念化。
Lihua Chen：资源管理、项目管理、研究、数据管理。
Jiewen Yan：撰写——审稿与编辑、项目管理、研究、数据管理。
Mali Fu：资源管理、项目管理、研究、数据管理。
Lu Wang：监督、资源管理、研究、数据管理。
Ranran Ye：资源管理、研究、数据管理。
Ping Wen：可视化、验证、资源管理、研究。
Xiaoxia Wu：验证、监督、资源管理、研究。

**资助**
本研究得到了广东省自然科学基金（编号2022A1515010617）、深圳市科技创新委员会（编号JCYJ20230807120215031）、广东省基础与应用基础研究基金（编号2024A1515220026）、国家自然科学基金（编号82103851）、深圳市妇产科与生殖系统疾病临床研究中心（编号LCYSSQ20220823091401002）以及深圳市母婴健康与疾病重点实验室（编号ZDSYS20230626091559006）的支持。