通过使用Paecilomyces maximus PQ584815进行大蒜皮生物转化，增强了细胞毒性次级代谢产物的产量

《Food Production, Processing and Nutrition》：Enhanced production of cytotoxic secondary metabolites through garlic peel biotransformation using Paecilomyces maximusPQ584815

　　**摘要**
对大蒜皮的研究发现了多种生物活性化合物。本研究强调了大蒜皮以及海洋真菌菌株Paecilomyces maximus PQ584815在产生具有有效抗癌特性的次级代谢物方面的作用，以及其在治疗药物开发中的潜在应用。此外，这些发现还突显了利用这种副产品的经济价值和减少废物带来的益处，从而降低了该行业对环境的影响。通过18S rDNA测序分离并鉴定了海洋真菌菌株Paecilomyces maximus PQ584815，并评估了其以大蒜皮为底物生产次级代谢物的能力。通过使用Plackett-Burman设计（PBD）确定关键培养基成分，随后通过中央复合设计（CCD）进一步优化了代谢物的生产。在特定条件下，最大代谢物活性达到了416.15%。统计分析表明，与PBD相比，CCD使次级代谢物的产量提高了2.47倍；与初始培养基相比，提高了3.5倍。从该真菌滤液的乙酸乙酯提取物中首次分离出了五种化合物：植醇、原儿茶酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧基苯醌和3′,4′,5,7-四-O-甲基槲皮素，这些化合物通过色谱技术和与文献中报道的数据进行光谱比较得以鉴定。提取物和分离出的化合物均在体外针对人类肝细胞、结直肠癌细胞和乳腺癌细胞以及正常皮肤成纤维细胞进行了测试，使用乳酸脱氢酶测定法。所有化合物均以剂量依赖的方式抑制了癌细胞的生长，其中对结肠癌细胞的抑制作用尤为显著，其细胞毒性相对于多柔比星而言更高。

**引言**
微生物是天然生物活性物质的重要生产者，具有发现可用于工业、农业和药物开发的新化合物的巨大潜力（Demain, 1999; Keller, 2004; Kodzius & Gojobori, 2015; Porras-Alfaro & Bayman, 2011; Strobel, 2006）。目前临床使用的60%的抗癌药物和70%的抗菌药物都来源于天然来源（McAlpine et al., 2005）。真菌、植物和细菌是三个具有高度发达次级代谢作用的生命界。迄今为止，已经描述了大约500,000种天然化学物质，也称为次级代谢物，其中350,000种来自植物，100,000种来自动物，70,000种来自微生物。在微生物产生的33,500种代谢物中，约有47%（15,600种）来自真菌（Bérdy, 2012）。丝状真菌最显著的生化特性之一就是它们能够产生次级代谢物，这一特性自20世纪50年代以来激发了对这些微生物的广泛研究（Bayer et al., 2022; Boruta, 2017; Keller, 2019）。这导致了众多化合物的发现，其中一些可能对人体健康有害，而另一些则显示出有希望的治疗潜力。属于Pezizomycotina、Ascomycetes纲和Basidiomycetes纲（包括Agaricomycetes和Exobasidiomycetes）的丝状真菌，以及像Kluyveromyces lactis这样的意外分类群，都能产生生物活性次级代谢物（Aly et al., 2011; Avalos & Limón, 2022; Brown et al., 2021; Conrado et al., 2022）。根据一项经常被引用的文献调查，在1993年至2001年间从真菌中鉴定出的1,500种化合物中，超过一半具有抗菌、抗真菌或抗肿瘤作用。目前，所有已知的来自微生物的生物活性次级代谢物中有50%是由真菌产生的，其中一些代谢物被用于化妆品、农用化学品和药品中（Bills & Gloer, 2016）。环境因素如光照、紫外线辐射和温度变化都可能影响真菌次级代谢物的产生（Kosani? & Rankovi?, 2019）。为了提高次级代谢物的产量，人们正在优化培养基的营养和物理性质（Wang et al., 2011）。然而，即使是对培养因素的微小改变也可能对代谢物的产生产生显著影响。为了提高产量和发现新的次级代谢物，培养基成分的优化会影响影响次级代谢物效力和产量的微生物种类和菌株。最近受到广泛关注的一种优化技术是基于响应面方法（RSM）的多变量方法。通过使用RSM优化发酵条件，可以从测试微生物中获得最高产量的生物活性代谢物。此外，许多近期研究强调了RSM技术的优势，包括能够用较少的实验次数有效发现和优化多个关键参数（Sahu et al., 2018）。本研究旨在利用色谱技术从使用大蒜皮作为底物在优化发酵条件下分离和鉴定的Paecilomyces maximus PQ584815海洋真菌菌株的培养滤液中提取生物活性化合物，并评估提取物和纯化化合物的抗癌活性，突显它们作为药物开发天然来源的潜力。

**材料与方法**
**微生物**
海洋真菌菌株Paecilomyces maximus PQ584815是从埃及沙姆沙伊赫省的红海水中分离得到的。该真菌在含有1.0 g/L葡萄糖、0.5 g/L蛋白胨、0.1 g/L酵母提取物、15 g/L琼脂、800 mL海水和200 mL蒸馏水的葡萄糖蛋白胨培养基（GPM）中培养7天后，储存在4°C。

**真菌分离物的分子鉴定**
根据制造商的说明，使用Gene Jet基因组DNA纯化试剂盒（Thermo# K0791）进行DNA提取。通过PCR扩增18S rDNA区域来生产Maxima Hot Start PCR Master Mix（Mix (Thermo) #K0221）。使用旨在扩增18S rDNA区域1500 bp片段的引物，通过聚合酶链反应（PCR）扩增18S rDNA。使用正向引物ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和反向引物ITS4（5-TCCCCGCTTATTGATATGC-3）扩增ITS1–5.8S–ITS2基因组区域（Hamed et al., 2015; White et al., 1990）。PCR实验使用2 μL 10×Taq PCR缓冲液、1.6 μL 2.5 mM dNTP混合物、1 μL正向和反向引物（10 pmol/μL）、2 μL模板基因组DNA（20 ng/μL）、0.2 μL KOMATaq（2.5 U/μL）和蒸馏水（HPLC级）进行，总反应体积为20 μL。反应程序如下：95°C下初始变性1分钟，95°C下变性30个循环，55°C下退火2分钟，68°C下延伸1.5分钟，最后在68°C下延伸10分钟。为了确保扩增出正确大小的片段，将PCR产物在含有溴化乙锭（10 mg/ml）的1%琼脂糖凝胶上进行电泳。使用Montage PCR清理试剂盒（Millipore）纯化扩增产物。之前用于PCR反应的两种引物被用来对纯化的PCR结果进行测序。使用Applied Biosystems Model 3730XL自动DNA测序系统（Applied Biosystems, USA）在韩国首尔的Macrogen, INC.进行测序。

**系统发育分析和树构建**
使用CLUSTAL W程序版本1.8和标准参数，结合BLAST算法（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）对各种18S rRNA的核苷酸进行比对，以获得系统发育数据。使用Mega 6程序进行系统发育和分子进化分析（Tamura et al., 2013）。所有分析都使用了该程序生成的包含100个重复次的自助数据集。GC mol %是由NEB cutter版本1.0生成的，这是一个通过网页服务器（http://tools.neb.com/NEBcutter）提供的程序。

**底物**
使用来自埃及市场的大蒜皮作为生产次级代谢物的底物。材料在70°C下干燥后，使用搅拌机研磨成细粉。

**次级代谢物的生产和发酵培养基**
用于生产代谢物的培养基是Czapek’s Dox Broth培养基，其成分包括（g/L）NaNO3 2.0；KH2PO4 1.0；MgSO4·7H2O 0.5；KCl 0.5；FeSO4 0.001；蔗糖20.0，pH值为6.5。培养基中的蔗糖被替换为大蒜皮废弃物作为代谢物生产的底物。将直径为6毫米的P. maximus PQ584815菌株的两个菌落接种到含有100 mL发酵培养基的250 mL Erlenmeyer烧瓶中，在30°C下旋转摇床中培养14天。培养结束后，以4,000 rpm离心15分钟。

**次级代谢物生产的培养条件优化**
使用Design-Expert统计程序（版本13.0.5.0）进行实验设计和实验数据的回归分析，以确定显著影响P. maximus PQ584815次级代谢物产生的因素。统计参数通过方差分析（ANOVA）进行估计。

**Plackett–Burman设计（PBD）**
使用PBD筛选对代谢物合成有重大影响的因素。根据Plackett–Burman理论，总共有k + 1次试验，其中k是变量数量。PBD基于一阶模型：Y = β0 + ΨβiXi，其中Xi是自变量的水平，β0是模型截距，βi是线性系数，Y是响应（次级代谢物）。表1显示了在两个水平（?1和+1）下检验的十一个独立因素（大蒜皮浓度、NaNO3、(NH4)2SO4、酵母提取物、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、接种量、培养时间和pH）。进行了十二次实验来筛选这十一个独立变量。每次实验都重复进行两次，记录平均次级代谢物活性作为响应。根据F值、P值和方差比例R2，模型在P ≤ 0.05的水平上具有显著性。

**中央复合设计（CCD）**
使用响应面方法（RSM）的CCD进一步优化了通过PBD选出的重要因素，以提高P. maximus的代谢物产量。使用CCD研究了影响PBD代谢物生产的独立变量（大蒜皮浓度、NaNO3、接种量、pH），在五个编码水平[?2, ?1, 0, +1, +2]下进行测试，结果显示在表2中。进行了二十四次实验来筛选四个独立变量。每次实验都重复进行两次，记录平均代谢物活性作为响应。线性回归技术、二次项和交互效应基于以下方程：
$$Y=\beta 0+\Sigma \beta i Xi+ \Sigma \beta ii X2i+\Sigma \beta ij Xi Xj$$
其中：Y是预测响应，β0是截距项，βi是线性系数，βii是二次系数，βij是交互系数，xi和xj是编码的独立变量。表2 中心复合设计中使用的自变量的编码值
完整表格

统计分析
该模型使用方差分析（ANOVA）方法进行了统计分析。

仪器
使用JeolEx-500光谱仪记录NMR光谱；使用Finnigan MAT-SSQ 7000光谱仪获取质谱数据。柱层析在硅胶F254（Merck）上进行；Sephadex LH-20柱层析用于纯化，TLC使用硅胶60 GF254板（Merck，德国达姆施塔特）进行，然后通过H2SO4中的香草醇在紫外光下观察板层析结果。

提取物的制备
将Paecilomyces maximus的滤液（1000 mL）用乙酸乙酯（3 L）分三次提取，直至提取完全。提取物在减压条件下蒸发，得到50克粗提物。一部分提取物用于化合物分离，另一部分则储存以供生物研究使用。

化合物的分离
提取物进行硅胶柱层析，使用n-己烷：乙酸乙酯梯度洗脱，起始洗脱剂为100% n-己烷，随后逐渐增加乙酸乙酯浓度至100%。洗脱液通过TLC、紫外光以及喷洒1%香草醇/5% H2SO4/EtOH试剂进行检测。根据TLC谱图将相似的组分合并为五个部分（F1-F5），这些组分分别用不同浓度的乙酸乙烷在己烷中洗脱（见表3）。F1（3克）在硅胶“G”板上使用己烷/乙酸乙酯（9:1）作为展开剂进行纯化，得到化合物C1（35毫克）；F2（6克）和F3（7克）使用（8:2）作为展开剂得到化合物C2（35毫克）和C3（40毫克）；F4（5克）使用己烷/乙酸乙烷（7:3）得到化合物C4（34毫克）。F5（8克）在Sephadex LH-20柱上使用己烷/乙酸乙烷（1:9）洗脱，得到化合物5（40毫克）。通过物理和光谱数据鉴定化合物，并与文献中的数据进行了比较。

表3 不同乙酸乙酯浓度

体外抗癌活性
使用的化学物质
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基购自Sigma Chemical Company（美国密苏里州圣路易斯）。胎牛血清（FBS）来自Gibco（英国）。二甲基亚砜（DMSO）和甲醇为HPLC级，其他所有试剂和化学品均为分析级。

细胞培养
HepG-2（人类肝癌细胞）、HCT116（人类结直肠癌细胞）、MCF-7（人类乳腺癌细胞）和正常人皮肤成纤维细胞（BJ-1）系购自American Type Culture Collection（美国马里兰州罗克维尔）。所有细胞系均在添加了10%热灭活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养。细胞在含有5% CO?的湿润环境中保持在37°C。每个实验重复三次（n=3）。数据以平均值±标准差（SD）表示。

乳酸脱氢酶（LDH）测定
为了评估每种代谢物对膜通透性的影响，使用HepG2、MCF-7和HCT-116癌细胞系以及BJ-1正常细胞系进行了乳酸脱氢酶（LDH）释放测定（Ahmed等人，2020；Elnaggar等人，2019；Haiba等人，2019；Mohamed等人，2017；Radwan等人，2020）。细胞以每孔1×10^4个细胞的密度接种在24孔培养板上，培养液体积为500 μL，处理前培养18小时。随后用不同浓度的每种代谢物或多柔比星?（作为阳性对照）处理细胞48小时。取40 μL上清液转移到新的96孔板上测定LDH释放量，同时在原培养板上加入6% Triton X-100（40 μL）以测定总LDH含量。然后加入0.1 M磷酸钾缓冲液（100 μL，pH 7.5）含4.6 mM丙酮酸，与上清液混合。接着向每个孔中加入0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.5）含0.4 mg/mL还原型β-NADH。使用ELISA微孔板读取器在340 nm波长下记录1分钟的动态变化。该实验重复三次，每次使用40 μL总细胞裂解液来量化总LDH活性。LDH释放百分比通过将释放到培养基中的LDH量除以细胞裂解后测得的总LDH量计算得出。

统计分析
所有实验重复三次（n=3），数值以平均值±标准差（SD）表示。使用SPSS软件包（SPSS Inc.，伊利诺伊州芝加哥）中的probit分析评估参数平均值和IC50值之间的差异的统计显著性。

结果与讨论
**真菌菌株的分离与选择**
研究了海洋真菌P. maximus利用大蒜皮废弃物作为唯一碳源产生次级代谢物的能力。结果表明，当发酵培养基中使用2%的大蒜皮废弃物时，P. maximus表现出最高的次级代谢物活性（118.75%）。
国家生物技术信息中心（NCBI）数据库（持久性网页链接）包含了本研究生成和分析的数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/pq584815）。访问编号：PQ584815。数据包含在手稿中。

**菌株的分子鉴定**
使用通用引物通过PCR扩增MRSS菌株的DNA，以扩增18S rDNA以及小核rDNA和大核rDNA之间的ITS1和ITS4区域。将Paecilomyces maximus MRSS菌株的核苷酸序列（439 bp）与Gen Bank资源进行比对，使用NCBI-BLAST搜索（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）将其与Paecilomyces属菌株关联。结果显示P. maximus与该属物种具有高序列相似性（99%）。

**GC%和系统发育分析**
根据系统发育树（图1），MRSS菌株与P. maximus最为接近。因此提出其名称为P. maximus MRSS。用于鉴定生物体基因组的通用特征之一是鸟嘌呤+胞嘧啶（GC%）的比例。系统发育分析显示，P. maximus MRSS菌株的基因组DNA GC含量为58%。这一发现与Nakase & Komagata（1971；Storck，1966）的研究结果一致，他们报告称真菌的GC含量因分类不同而异，范围从31.5%到63%。从分类和亚类到属和种，组成成分的多样性逐渐减少。

**PBD优化次级代谢物生产条件**
为了确定使用大蒜皮作为底物时提高P. maximus代谢物合成的关键培养条件，研究了十一个独立变量（大蒜皮浓度、NaNO3、(NH4)2SO4、酵母提取物、蛋白胨、KH2PO4·7H2O、MgSO4·7H2O、KCl、接种量、培养时间和pH值）。表4显示，在十二次实验中，代谢物活性范围从88%到168%不等。结果显示，在最佳条件下（2%大蒜皮、2.0克NaNO3、2.0克酵母提取物、0.5克KH2PO4·7H2O、0.5克MgSO4·7H2O、pH 5.0，使用直径8毫米的培养皿），14天培养后次级代谢物的产率达到168%。帕累托图显示了所研究变量对次级代谢物活性的主要影响。帕累托图是分析所有因素并集中关注最重要因素的有用工具。

**Plackett–Burman实验设计用于确定P. maximus次级代谢物合成的关键变量**
图2中的帕累托图结果表明，大蒜皮、NaNO3、接种量和pH值对次级代谢物的形成有显著影响。一阶模型回归方程预测了培养基成分与实验结果之间的关系：
$$\text{次级代谢物}(\%)\;=\;66.3\;+\;32.67A\;+\;16B\;+\;0.66C\;+\;10D\;+\;1.667E\;+\;5.33F\;-\;8G\;+\;5.55J\;+\;12J$$

**多变量回归分析**
对代谢物活性结果进行多元线性回归分析，发现A、B、D、J和L变量对代谢物活性有正面影响，而C、E、F和G变量有负面影响（表5）。A、B、D、J和L变量被确定为显著因素，置信水平大于95%。

**CCD优化次级代谢物生产条件**
表6显示了PBD的方差分析（ANOVA）结果。R2值大于0.90的回归模型通常表示非常不寻常的关系（Haaland，1989）。变量A（大蒜皮）、B（NaNO3）、D（酵母提取物）、J（接种量）和L（pH）的p值分别为0.003、0.011、0.028和0.019，被认为对代谢物生产有显著影响。F值为79.81，表明模型具有显著性。因此选择大蒜皮、NaNO3、接种量和pH这三个变量进行进一步研究。

**CCD优化次级代谢物生产条件**
表7显示了四个独立变量的CCD设计结果。根据数据，第4次实验产生的次级代谢物活性最高（416.15%），比未优化培养基高出3.5倍。最佳培养基组分为3%大蒜皮、3.0克NaNO3和8毫米接种量，pH 5.5。表8显示了线性变量的系数和P值。在P<0.05的显著性水平下，线性系数A、B和C对次级代谢物的生产有显著影响。多重回归分析确定了次级代谢物生产的二阶多项式方程：
$$\text{次级代谢物}(\%)\;=\;210.28\;+\;70.18\;A\;+\;42.20\;B\;+\;22.52\;C\;-\;12.68\;D$$

**CCD优化次级代谢物生产的全面分析**
表9显示了CCD的方差分析（ANOVA）结果。F检验分析用于确定二阶模型的统计显著性。根据Uyar等人（2011）的研究，高P值（>0.05）表明回归模型与实际结果吻合良好。F值为17.7，表明模型具有统计显著性。模型项的P值<0.001，表明模型具有显著性。R平方值（R2）为0.6625，调整后的R2为0.7439，R2为0.7884，表明预测值与实际结果之间有强相关性。设计的有效性通过低变异系数（CV）23.77%得到验证。此外，图3b中的残差正态概率图显示了所描绘点与直线的接近程度，这证明了该模型适用于实验。图3的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了次级代谢物活性实际值与预测值之间的关系：(a) CCD中的学生化残差图及其正态概率分布；(b) 该研究通过检查三维响应面图来探讨独立变量如何相互作用以影响代谢物的活性，这些图是针对任意两个独立因素生成的（图4A-C），展示了次级代谢物活性响应与独立变量（大蒜皮浓度、NaNO3和接种量）之间的关系。每个图形都说明了在保持其他因素不变的情况下，两个变量之间关系的影响。包括大蒜皮浓度、NaNO3和接种量在内的独立变量之间的相关性对P. maximus的代谢物活性有显著影响（图4A-C）。图4A和B展示了改变大蒜皮浓度与其他一个变量的影响。研究发现，在pH 5.5的条件下，使用直径为8毫米的培养盘，当大蒜皮浓度为3%、NaNO3为3.0克、酵母提取物为2.0克、KH2PO4为0.5克、MgSO4·7H2O为0.25克以及KCl为0.5克时，次级代谢物的活性最高达到了416.15%。碳源对于构建细胞物质至关重要，同时也可作为能量来源（Abhini等人，2022年）。氮是蛋白质和核酸的重要组成部分，而蛋白质和核酸是微生物用来制造生物代谢物的基础（Jose和Jebakumar，2013年）。在特定浓度下，限制生长的营养物质对微生物发酵过程中细胞发育与次级代谢物产生的关系有显著影响（Shakeel等人，2016年）。因此，选择和优化营养成分是在合理成本下大规模生产生物质的关键步骤。图4的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像展示了P. maximus次级代谢物产生的三维（3D）响应面图，即：(A) 大蒜皮浓度与NaNO3；(B) 大蒜皮浓度与接种量；(C) 接种量与NaNO3。从P. maximus的乙酸乙酯滤液中分离并鉴定了五种化合物：植醇、3,4-二羟基苯甲酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、2,6-二甲氧基苯醌和3′,4′,5,7-四-O-甲基槲皮素（图5）。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像从P. maximus培养滤液的乙酸乙酯中分离出的化合物包括：植醇（C1），黄色油，[M]+m/z 296，分子式C20H40O；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ 4.11 [d, H:1]，δ 5.36(t, H:2)，δ 1.94 (t, H:4)，δ 1.40 (m, H: 5)，δ 1.66 (s, OH)，δ 1.23 – δ 1.31(m, H:6–13)，δ 1.11，δ 1.5 (m, H:14, H:15)，δ 1.35 (m, H: 7, H:11)，δ 1.64 (s, H:20)，0.84 (s, CH3 ?16,17,18,19)；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ59.39，123.09，140.23，39.85，25.12（C (1, 2, 3, 4, 5)），36.21，32.22，36.53，23.54，36.50 [C (6, 7, 8, 9, 10)]，32.72，36.72，24.78，38.53，26.95 [C (11, 12, 13, 14, 15)]，21.60，21.69，18.69，18.62，15.14 [C (16, 17, 18, 19, 20)]。根据上述数据并将其与文献（Eskander等人，2019年）进行比较，确认了该化合物的身份。3,4-二羟基苯甲酸（原儿茶酸）（C2），棕色固体；[M]+m/z 153.12，分子式C7H6O4；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ 7.44 (d, J = 2 Hz, H-2)，δ 7.42 (dd, J = 2 Hz, 6 Hz, H-6)；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ 171.2(C = O)，δ146.2，151.5 [C(3,4)]，121.7，122.5[C(1,6)]，117.9，115.8[C(2,5)]。数据与先前报道的文献（Ou等人，2012年；Syafni和Putra，2012年）进行了比较。3,4,5-三甲氧基肉桂酸（C3），无色晶体；[M]+m/z 238，分子式C12H14O5；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ 12.10 (s, 1H, COOH)，7.61，6.35 δ (d, J = 15.9 Hz, 2H, C = C, H-7, 8)，6.77 (s, 2H, H-2,6)，3.88 (s, 6H, CH3)；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ 171.5(C = O)，153.6(7)，148.7(8)，139.7，130.9，116.5，105.8，[60.3, 56.1 (CH3)]。数据与先前报道的文献（Shan等人，2012年）进行了比较。2,6-二甲氧基苯醌（C4），无色晶体；[M]+ 168 m/z，分子式C8H8O4；1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ 5.85 (s, 1H, H-3,5)，3.82 (6H, s, OCH3 × 2)；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ176.8(C-1)，187.0(C-4)，157.59[C (2, 6)]，107.7 [C (3,5)]，56.6 [C (O-CH3 ×2)]。通过将其光谱数据与文献（Ahmed，2006年）进行比较，确认了该化合物的身份。3′,4′,5,7-四-O-甲基槲皮素（3-羟基-3′,4′,5,7-四甲氧基黄酮）（C5），黄色固体，[M]+359.3 m/z，分子式C19H18O7；1H-NMR（500 MHz，DMSO-d6）：δ 6.32，6.54 (d, J = 2.02, H-6, H-8)，7.51 (d, J = 8.5 Hz, H-5')，7.62 (dd, J = 8.5 Hz, J = 2.5 Hz, H-6')，7.82 (d, J = 2.5 Hz, H-2')，9.45 (s, 3-OH)，3.87–3.97 (s, 12H-OCH3)。13C-NMR（125 MHz，DMSO-d6）：δ 171.1 (C-4)，150.3，160.5[C(5,7)]，141.1，145.1 [C(3',4')]，94.8，164.1，106.3[C(8,9,10)]，156.5，137.7，95.8 [C(2,3,6)]，124.0，111.3，[C(1',2')]，110.9，120.6 [C(5',6')]，56.5，55.8，55.6(4-OCH3)。该化合物的数据与先前报道的文献（Wang等人，2014年）进行了比较。在体外，评估了五种化合物和一种提取物对HCT-116、HepG2和MCF-7人类癌细胞系以及BJ-1人类健康细胞系的细胞毒性作用，使用了LDH测定法。确定了非存活细胞的比例，并与对照组进行了比较。这些化合物对三种癌细胞系的有效性也相对于多柔比星进行了评估。所有测试的化合物都显示出对HCT-116、HepG2和MCF-7癌细胞的剂量依赖性抑制作用（图6、7和8）。对于HepG2人类肝癌细胞，化合物C1、C2和C4的细胞毒性略低于多柔比星，而其余化合物表现出中等程度的细胞毒性（图6，表10）。关于MCF-7人类乳腺癌细胞，化合物C2和C5显示出更强的细胞毒性；C3的活性与参考药物相当，其余化合物（提取物、C4和C1）表现出较低的细胞毒性（图7，表10）。对于HCT 116人类结直肠癌细胞，图8和表10均表明所有六种化合物（C2、C3、C5、提取物、C1和C4）的细胞毒性均高于多柔比星。对于非肿瘤成纤维细胞系（BJ），图9和表10均显示所有六种化合物（C5、C2、提取物、C4、C3和C1）对健康细胞的毒性都高于多柔比星。比较所有癌症类型与正常细胞系的细胞毒性表明，两种化合物（C2和C5）对人类乳腺癌细胞具有选择性活性，可能是乳腺癌治疗的潜在候选药物。此外，所有六种化合物（C1–C5和提取物）对人类结肠癌细胞也表现出选择性活性，表明它们作为结肠癌治疗候选药物的潜力。这种选择性体现在它们对癌细胞的细胞毒性高于正常细胞，这与药物参考值形成对比。图6的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了化合物和提取物在暴露48小时后通过LDH测定法对HepG2癌细胞的剂量依赖性抗增殖效应。图7的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了化合物和提取物在暴露48小时后通过LDH测定法对MCF-7癌细胞的剂量依赖性抗增殖效应。图8的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了化合物和提取物在暴露48小时后通过LDH测定法对HCT-116癌细胞的剂量依赖性抗增殖效应。表10显示了通过LDH测定法确定的人类细胞系中化合物的剂量依赖性抗增殖IC50值。图9的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了化合物和提取物在暴露48小时后通过LDH测定法对BJ-1正常细胞的剂量依赖性抗增殖效应。结论本研究首次报道了在最佳条件下，使用大蒜皮作为底物从P. maximus海洋真菌菌株的乙酸乙酯提取物中获得的次级代谢物。所有分离出的化合物都对三种癌细胞系表现出剂量依赖性的抑制作用。因此，这些结果表明P. maximus可能是次级代谢物的良好来源，并且是一个具有进一步探索和工业应用潜力的菌株。此外，大蒜皮废弃物是一种经济可行的生物产品，可用于从真菌中生产有益的生物活性次级代谢物。结果还强调了埃及Sharm El-Sheikh地区的海洋样本是发现新型生物活性化合物的有希望的区域。