综述：非蛋白氨基酸的最新进展：从功能到生物合成的研究洞察

《Journal of Animal Science and Biotechnology》：Recent advances in nonprotein amino acids: insights from function to biosynthesis

　　

系统探索具有优异功能特性的新型生物活性化合物对于推动农业、医疗保健及相关领域的创新至关重要，因此成为推进可持续生物技术解决方案的核心。非蛋白氨基酸（NPAAs）作为不参与蛋白质组成的功能性氨基酸，展现出独特的生理活性，并在营养强化、功能性产品配方及食品/饲料加工中具有显著优势。这些特性挑战了蛋白质仅作为营养载体的传统认知，将NPAAs定位为农业、食品及医药领域生物合成与功能应用的有前景的生物产品。本综述首次基于合成底物对非蛋白氨基酸进行分类，概述其多样化的功能角色，综合分析生物合成途径、工程策略及产量水平的最新进展，展示其在实验室阶段的主要研究进展。非蛋白氨基酸的可持续生物制造仍面临诸多挑战，包括生物合成机制解析不足、微生物菌株稳健性与生产力有限，以及工业规模化生产的困难。解决这些瓶颈需要创新策略与技术以促进非蛋白氨基酸生产从实验室到工业的转化。本综述为非蛋白氨基酸在营养、免疫调节、抗氧化防御及肠道稳态维持等新一代生物产品开发中的潜力提供了宝贵见解，为农业合成生物制造中高性能生物活性分子的微生物生产指明了方向。

非蛋白氨基酸的分类与功能

非蛋白氨基酸依据生物合成途径被划分为谷氨酸衍生型、天冬氨酸衍生型及其他衍生型非蛋白氨基酸。如图1所示，标准氨基酸转化为非蛋白氨基酸涉及一步或多步反应，包括酰胺化、乙酰化、二羧酸反应、羟基化或消旋化等。例如，谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）和L-茶氨酸仅需一步反应，分别通过R基团的-COOH丢失或与乙胺缩合形成；而天冬氨酸转化为β-丙氨酸的二羧酸反应则发生在α-羧基而非R基团。色氨酸转化为L-5-羟色氨酸和酪氨酸转化为L-多巴均涉及单步羟基化反应，D-丙氨酸和D-丝氨酸则通过消旋酶催化L型前体生成。多步反应中，谷氨酸转化为5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）和L-鸟氨酸的R基团修饰更为多样，如L-鸟氨酸的合成需经历R基团从- CH₂-CH₂-COOH还原为醛基、转氨基为醇羟基最终形成氨基的三步转化。

功能层面，非蛋白氨基酸在动物生产中展现出多维度价值。在提升繁殖性能方面，L-鸟氨酸、L-瓜氨酸和N-乙酰谷氨酸作为精氨酸前体，可通过改善胎盘血管生成（如妊娠母猪补充L-鸟氨酸促进仔猪肠道发育）、提高精液质量（如N-乙酰谷氨酸改善公鸡精液品质）及缓解子痫前期（如L-瓜氨酸通过一氧化氮介导的血管功能改善母鼠妊娠结局）发挥作用。增强非生物胁迫抗性方面，GABA作为抑制性神经递质，通过增加神经元膜通透性促进氯离子内流引发超极化，减轻热应激对肉牛的氧化损伤并改善血液稳态；L-茶氨酸和牛磺酸也可通过调节热休克蛋白表达降低高温或高密度饲养引发的应激反应。免疫调节功能中，GABA可上调尼罗罗非鱼促炎因子（TNF-α、IL-1β）分泌以维持免疫稳态；牛磺酸通过TLR4/NF-κB信号通路维持结肠炎小鼠肠道屏障完整性并抑制炎症；5-ALA、L-瓜氨酸和β-丙氨酸则分别通过激活血红素氧合酶-1、降低促炎因子水平及改善肠道形态发挥免疫增强效应。生长促进方面，GABA通过提高尼罗罗非鱼消化酶活性促进营养吸收；羟脯氨酸通过TOR通路调控鱼类生长；L-鸟氨酸和N-乙酰谷氨酸作为精氨酸前体改善肉鸡早期肠道发育；5-羟色氨酸通过调节瘤胃微生物组成提高绵羊平均日增重；β-丙氨酸和牛磺酸则分别通过优化瘤胃微生物蛋白供应及促进碳水化合物合成加速肉牛和鱼类生长。其他功能包括L-茶氨酸和5-羟色氨酸改善睡眠质量，L-鸟氨酸和L-瓜氨酸通过促进脂质代谢和氨排泄延缓疲劳，D-丝氨酸逆转衰老相关认知衰退，以及5-ALA、肌酸等提升运动耐力。

谷氨酸衍生型非蛋白氨基酸的生物合成

谷氨酸衍生型非蛋白氨基酸（如GABA、5-ALA、L-茶氨酸、L-鸟氨酸、羟脯氨酸）的生物合成依赖碳代谢流重构与辅因子调控。增强谷氨酸供给的核心策略包括：（1）敲除乳酸脱氢酶（ldh）、丙酮酸甲酸裂解酶（pflB）等基因阻断乳酸和乙酸积累，推动碳流进入三羧酸循环（TCA cycle）；（2）过表达异柠檬酸脱氢酶（icd）和乙酰辅酶A合成酶（acs）增强草酰乙酸至2-酮戊二酸的转化；（3）过表达谷氨酸脱氢酶（gdh）基因促进2-酮戊二酸氨基化生成谷氨酸。例如，谷氨酸棒状杆菌中敲除eutD、aldB等5个基因使GABA产量提升20.4%至22.47 g/L；大肠杆菌中弱化sucA基因表达可将碳流导向2-酮戊二酸，助力5-ALA合成。

代谢流调控方面，阻断谷氨酸外排（如删除Ncgl1221/MscCG2基因）可减少前体流失，使L-茶氨酸和L-鸟氨酸产量提高；5-ALA的C₅合成途径中，过表达hemA（谷氨酸-tRNA还原酶）和hemL（谷氨酰胺-1-半醛氨基变位酶）基因可将5-ALA产量提升至4.55 g/L（无质粒系统）；L-茶氨酸合成酶（GMAS）的定向进化（如副球菌来源GMAS突变体）使催化效率提高36.61%；GABA转氨酶（GAD）的pH稳定性改造（如植物乳杆菌GAD突变体在pH 6.5下相对活性从38%升至84%）显著提升GABA合成效率。

产物降解防控通过敲除降解关键基因实现：如谷氨酸棒状杆菌中敲除gabTDP基因使GABA产量翻倍；下调hemB和hemF基因减弱5-ALA向血红素转化；删除argF和speF基因阻断L-鸟氨酸分解代谢。辅因子与能量供应优化方面，过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（pckA）促进ATP生成（5-ALA产量提升12.7%）；引入PLP自主合成途径（如过表达pdxH基因）解决GAD辅酶依赖问题；通过异源表达水形成型NADH氧化酶（noxE）维持NADH/NAD⁺稳态，或通过PntAB转氢酶平衡NADPH/NADP⁺比例，保障羟脯氨酸等产物的还原力需求。

天冬氨酸衍生型非蛋白氨基酸的生物合成

天冬氨酸衍生型非蛋白氨基酸（如β-丙氨酸、L-2-氨基丁酸）的合成依赖于磷酸转移酶系统（PTS）改造与前体供给强化。葡萄糖摄取系统优化通过删除ptsG基因并过表达galP（D-半乳糖通透酶）和glk（葡萄糖激酶）构建ATP依赖性转运系统，使β-丙氨酸产量提升120.78%；L-2-氨基丁酸合成中类似策略可平衡EMP途径碳流。

天冬氨酸供给增强策略包括：（1）过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（ppc）、丙酮酸羧化酶（pyc）等基因促进草酰乙酸生成；（2）敲除乳酸脱氢酶（ldhA）和乙酸激酶（ackA）阻断丙酮酸溢流，使β-丙氨酸产量提升。代谢流调控方面，异源表达枯草芽孢杆菌panD基因（编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶）可直接催化天冬氨酸生成β-丙氨酸；L-2-氨基丁酸合成中通过删除ilvA（苏氨酸脱水酶）和ilvIH（乙酰羟基酸合酶III）基因阻断支链氨基酸竞争路径，并结合反馈不敏感型thrA突变体解除苏氨酸抑制，最终实现9.33 g/L的产量。

辅因子调控通过优化嘌呤代谢（如删除amn和ushA基因）减少ATP消耗，同时过表达atpA（ATP合酶）提升能量供应；引入枯草芽孢杆菌rocG基因（编码NADH依赖型谷氨酸脱氢酶）替代大肠杆菌gdhA，可维持NADH/NAD⁺平衡，促进天冬氨酸转氨反应。

其他衍生型非蛋白氨基酸的生物合成

其他衍生型非蛋白氨基酸涵盖丝氨酸衍生、芳香族氨基酸衍生及丙酮酸衍生类别，以L-高苯丙氨酸、L-多巴、L-5-羟色氨酸及D-丝氨酸为代表。葡萄糖摄取系统改造通过删除ptsG和crr基因并过表达galP/glk，使磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）积累，促进L-多巴等芳香族非蛋白氨基酸合成。

前体与辅因子供给方面，芳香族氨基酸合成需3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸（DAHP）作为前体，过表达aroG/H/F（DAHP合酶）可增强通量；L-多巴合成依赖四氢生物蝶呤（BH4）作为酪氨酸羟化酶（TPH）辅酶，通过共表达GTP环化水解酶I（GCHI）和6-丙酮酰四氢蝶呤合酶（PTPS）实现BH4自给。D-丝氨酸通过丝氨酸消旋酶（alr）催化L-丝氨酸生成，过表达Escherichia coli来源alr基因可使产量达15.2 g/L。

竞争路径阻断策略包括：敲除tnaA（色氨酸酶）阻断色氨酸分解为吲哚；删除pheA（预苯酸脱水酶）减少苯丙氨酸分流；通过代谢工程手段弱化莽草酸途径分支，使碳流优先流向目标产物。例如，L-5-羟色氨酸合成中，通过删除trpR（色氨酸阻遏蛋白）解除反馈抑制，并结合5-羟色氨酸合酶（5-HTP synthase）的定向进化，最终实现12.8 g/L的发酵产量。