无机纳米颗粒与蜂毒结合免疫疗法的抗肿瘤潜力

《Health Nanotechnology》：Antitumor potential of inorganic nanoparticles vs. bee venom combined with immunotherapy

　　摘要：无机纳米颗粒和蜂毒是新兴的抗癌剂，具有潜在的肿瘤选择性细胞毒性和免疫调节作用。本研究旨在比较三种无机纳米颗粒制剂（Cu-2.5纳米、Ag-柠檬酸盐-5纳米和Fe-ZnO）以及天然蜂毒在代表乳腺癌（E0771、MDA-MB、4T1）、胰腺癌（Panc-1、KPC）、结直肠癌（CT26）、肾癌（Renca）、黑色素瘤（B16-F10）和宫颈癌（HeLa）的癌细胞系中的抗癌活性，并评估蜂毒在体内的治疗效果。使用标准化的生存能力检测方法来评估细胞毒性，并采用KPC胰腺癌小鼠模型进行体内验证。Cu-2.5纳米颗粒表现出最强的细胞毒性，而Ag-柠檬酸盐-5纳米和Fe-ZnO的活性则因制剂不同而有所差异。天然蜂毒在大多数癌细胞系中表现出广泛的选择性细胞毒性，在多个模型中优于蜂毒肽（melittin），并且对健康细胞具有保护作用。Panc-1和B16-F10细胞对蜂毒的敏感性较低，但在较高浓度下仍能产生反应。在体内实验中，天然蜂毒显著抑制了肿瘤生长，与抗PD-L1和epacadostat的联合治疗进一步增强了肿瘤抑制作用，并增加了CD4?/CD8? T细胞的招募和激活，表明具有协同的免疫调节效应。这些发现突显了天然蜂毒作为一种兼具直接细胞毒性和免疫增强作用的双重作用抗癌候选物的潜力，支持其在联合治疗策略中的进一步临床前开发。

引言：癌症免疫疗法通过使免疫系统识别和消除恶性细胞，改变了现代肿瘤学，从而在部分患者中实现了持久的疗效。然而，其整体临床效果仍受到高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）的限制，这种环境限制了抗原呈递，促进了T细胞的耗竭，并支持了PD-L1上调、髓系来源的抑制细胞扩增和调节性巨噬细胞极化等免疫逃逸机制[1,2,3]。其中最有前景的候选物包括纳米颗粒（NPs）和天然蜂毒（BV）——这两种不同的但效力强大的方法具有独特的机制。纳米颗粒为靶向药物递送、免疫调节和TME重编程提供了多功能平台，能够下调PD-L1表达、激活炎性小体并重新极化肿瘤相关巨噬细胞[4,5,6,7,8]。同时，BV作为一种含有生物活性肽和酶的天然混合物，主要因其主要成分蜂毒肽而展现出强大的抗癌活性。蜂毒肽通过其强两亲性和阳离子特性破坏肿瘤细胞膜，导致快速裂解和膜完整性丧失，这一机制已在多种癌症模型中得到广泛研究（Rady等人，2017年）。除了膜破坏外，蜂毒肽还通过内质网应激和CCAAT-box/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）介导的信号通路诱导细胞凋亡，如在肺癌细胞中所证明的；它还可以通过铁依赖的脂质过氧化和ROS积累触发铁死亡（ferroptosis），这一机制在最近的乳腺癌和宫颈癌研究中得到证实[9,10,11]。重要的是，这些细胞毒性作用通常对恶性细胞具有选择性，而对健康细胞具有保护作用，部分原因是由于膜组成和生长因子受体的差异[12]。这些发现共同表明，BV——特别是蜂毒肽——是一种多功能的抗癌剂，能够诱导膜破坏、细胞凋亡和铁死亡，并显示出将其整合到联合免疫治疗策略中的巨大潜力。

尽管纳米颗粒和天然蜂毒的来源不同——合成与天然——但它们都致力于实现一个共同的治疗目标：恢复TME内的免疫能力并提高免疫疗法的效果。这项比较研究旨在阐明这两种不同治疗平台的免疫调节和抗肿瘤潜力，特别是在癌症免疫疗法的背景下。具体来说，我们研究了纳米颗粒制剂的变化如何影响细胞毒性，并评估了BV及其主要成分蜂毒肽在多种癌症模型中的细胞毒性和免疫刺激作用。最终，我们旨在确定这两种方法是否可以与免疫检查点阻断（ICB）联合使用，以增强治疗效果。

材料与方法：
细胞培养：
用于这些实验的细胞包括小鼠肾腺癌（Renca）、小鼠结直肠癌（CT26）、小鼠胰腺导管腺癌（KPC）、人类胰腺癌细胞系（Panc-1）、小鼠乳腺癌细胞系（E0771）、人类乳腺癌细胞系（MDA-MB）、小鼠乳腺腺癌（4T1）、小鼠黑色素瘤细胞系（B16-F10）、人类宫颈癌细胞系（HeLa）、人类内皮杂交细胞系（EaHy926）、小鼠脑内皮细胞系（Bend3）、人类胚胎肾细胞系（293t）和人类包皮成纤维细胞系（HFF-1）。所有细胞系均购自商业来源（Atcc，比利时）。4T1、KPC、B16-F10、Panc1、MDA-MB、Bend3、293t、HeLa、HFF-1细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，ThermoFisher Scientific，比利时）中培养，添加10%胎牛血清（FBS；Gibco，ThermoFisher Scientific，比利时）和1%青霉素/链霉素（Corning，比利时）。Renca细胞在Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI 1640 – GlutaMaxTM；Gibco，ThermoFisher Scientific，比利时）中培养，添加10% FBS、1mM丙酮酸钠（Gibco，ThermoFisher Scientific，比利时）、1%非必需氨基酸（HyClone，Fisher Scientific，比利时）和1%青霉素/链霉素（Croning，比利时）。CT26细胞在RPMI 1640中培养，添加10% FBS和1% P/S。E0771细胞在RPMI 1640中培养，添加10% FBS、1% P/S和1%两性霉素B（AK scientific，美国）。所有细胞类型均在37°C、5% CO2的湿润环境中培养。

体外细胞毒性评估：
为了评估体外细胞毒性，使用了小鼠癌细胞系（B16-F10、Renca、KPC、CT26、Panc1、4T1和E0071）和人类癌细胞系（MDA-MB和HeLa）来研究本研究提出的治疗方法的效果。为了确认这些治疗方法对非癌健康细胞的安全性，使用了小鼠健康HFF-1和293t细胞以及人类EaHy926细胞。细胞在指数生长阶段接种。B16-F10和HFF-1细胞以每孔2500个细胞的密度接种，Renca、KPC、CT26、MDA-MB、Bend3、Panc1和HeLa细胞以每孔2000个细胞的密度接种，4T1、E0771和EaHy926细胞以每孔1500个细胞的密度接种，接种在无菌的96孔板（Costar，比利时）中，并在37°C和5% CO2条件下培养24小时。第二天，KPC细胞用不同浓度的Ag-Citrate-5纳米（nanoComposix，美国）（0、5、10、15、20、25、30、35、50、75、100、150和200 μg/mL）处理，1%Fe-ZnO（合作提供）也用相同浓度处理。对于天然蜂毒（BV，ArpiVita，比利时）和A-Cu2.5纳米，使用的浓度为0、0;5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、50、75、100、150和200 μg/mL。Renca、CT26、E0771、MDA-MB、4T1、EaHy926和Bend3细胞用不同浓度的原始BV处理（0、1、4、5、6 μg/mL）。对于Panc-1、B16-F10和HFF-1细胞，使用的浓度为0、1、4、5、6、8、10、15、25、50 μg/mL。根据细胞类型，在总细胞培养基中制备蜂毒的系列稀释液，并重复三次实验。培养24小时后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS；Gibco，ThermoFisher Scientific，比利时）清洗细胞两次。根据制造商的说明，使用AlamarBlue HS（ThermoFisher Scientific，比利时）在37°C和5% CO2条件下培养1小时30分钟来评估细胞活力，并在24孔板中读取荧光值（ex/em：560/590）。

天然蜂毒的储存与评估：
天然蜂毒储存在室温下的密封小瓶中，以尽量减少环境因素的影响。储存一年后，评估了长期储存的蜂毒的生物活性，并与新鲜制备的蜂毒（储存20天）进行了比较。评估方法是将RENCA细胞用不同浓度的天然蜂毒处理（0、4、6、8和10 μg/mL），并评估其细胞毒性效果。

BV与蜂毒肽的比较：
在KPC、MDA-MB和E0771细胞上评估了BV和蜂毒肽的细胞毒性效果。细胞接种方式与前面的体外实验相同，并用不同浓度的BV和蜂毒肽处理（0、1、4、5、6、8 μg/mL）。根据制造商的说明，使用AlamarBlue HS在37°C和5% CO2条件下培养1小时30分钟来评估细胞活力，并在24孔板中读取荧光值（ex/em：560/590）。

动物实验：
C57BL/6小鼠被饲养在温度控制（21±2°C）、湿度（50±10%）和12小时光照/12小时黑暗周期的过滤顶笼中。小鼠自由摄取标准颗粒饲料和水。所有动物实验均获得了鲁汶大学动物实验伦理委员会的批准（批准编号：P218/2018和P219/2018），并符合国家和欧洲法规的原则和程序。

体内治疗：
本研究使用了源自小鼠胰腺癌的KPC细胞。总共1,0×10^6个KPC细胞被悬浮在无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中（Vf=100μL），并皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧腹部。6-8周大的雌性C57BL/6小鼠从鲁汶大学动物设施获取，并在标准条件下饲养，可自由获取食物和水。皮下注射后7天，携带肿瘤的小鼠被随机分为三个治疗组（每组n=5）。蜂毒组：每天肿瘤周围注射75 μg的蜂毒，连续14天。Epacadostat组：每次间隔14天口服给予0.1 mg/g的Epacadostat。对照组（n=5）接受等量的载体治疗（PBS）。在治疗期间定期使用卡尺测量肿瘤大小，并每天监测动物的健康状况和痛苦迹象。

联合治疗方案：
免疫疗法基于针对免疫检查点配体PD-1的单克隆抗体（CD274，InVivoMAb anti-mouse PD-L1，Biocell）。本研究使用了来自小鼠胰腺癌模型的KPC细胞。总共1,0×10^6个细胞被悬浮在无菌PBS中，并皮下注射到6-8周大的雌性C57BL/6小鼠的右侧腹部。肿瘤细胞注射后7天，动物被随机分配到三个治疗组（每组n=10）。在第一组治疗中，小鼠每周三次肿瘤周围注射75 μg的蜂毒，总共三次（每两天一次），然后在第一次蜂毒治疗后的24小时和最后一次蜂毒治疗后的24小时腹腔注射抗PD-L1（CD274，InVivoMAb anti-mouse PD-L1，Biocell CD274，InVivoMAb anti-mouse PD-L1，Biocell）200 μg。在第二组治疗中，小鼠接受了蜂毒和抗PD-L1的联合治疗（如第一组所述），同时口服Epacadostat（0.1 mg/g），在第一次蜂毒治疗后的24小时和最后一次蜂毒治疗后的24小时给予。对照组小鼠按照相同的计划接受溶剂处理（PBS）。定期使用卡尺测量肿瘤大小，并每天监测动物是否有痛苦的迹象。

**脾细胞特征分析**
新鲜脾脏在3mL完全培养基（CM；DMEM + 10% FBS + 1%青霉素/链霉素）中收集，放入均质管（gentleMACSTM C Tubes，Miltenyi Biotec）中。使用组织分离剂gentleMACS Octo（gentleMACSTM，Miltenyi Biotec）分离脾脏。将细胞悬液转移到70 μm尼龙过滤器（greiner bio-one，比利时）上。收集悬液到50mL管中，然后转移到15mL管中，并以400xg离心5分钟。离心后，弃去上清液，将沉淀物重新悬浮在3mL红细胞裂解缓冲液（NH4Cl）中。通过加入10mL CM停止血液裂解，然后以400xg离心5分钟。细胞用1x PBS洗涤两次，将沉淀物重新悬浮在PBS中并转移到测试管中：每个对照组样本取1/3，混合后分成8个测试管（单抗体染色用于基质补偿）——每个对照组样本的剩余细胞（2/3）用于抗体染色。来自处理过的脾脏的细胞样本用于抗体染色。将试管以400xg离心5分钟，弃去上清液。细胞在冰上与Fc受体阻断抗体（CD16/CD32 Rat anti-Mouse，未标记，克隆：2.4G2，BD，fisher scientific）和洗涤液（WS；1x PBS + 1% FBS）一起孵育30分钟。然后加入2mL WS并以400xg离心5分钟。弃去上清液，细胞与针对CD4+ T细胞（anti-CD4 APC（CD4单克隆抗体（GK1.5），APC，eBioscience?，ThermoFisher））、细胞毒性T细胞（anti-CD8α PE-Texas Red（CD8 alpha单克隆抗体（5H10），PE-Texas Red，ThermoFisher）和anti-CD69 PE（CD69单克隆抗体（H1.2F3），PE，eBioscience?，ThermoFisher）的一抗一起孵育1小时（避光）。为了基质补偿，对照组细胞分别用单抗体染色。孵育后，加入2mL WS并以400xg离心5分钟。细胞用1x PBS洗涤两次，重新悬浮在PBS中并转移到1.5mL微量测试管中（总体积不超过200μL）。使用基于图像的流式细胞术（Amnis? ImageStream?X Mk II，Luminex，美国）检测抗体标记的细胞。分析使用IDEAS应用程序v6.0（Luminex，美国）进行。

**肿瘤特征分析**
从Tumor Dissociation Kit（Miltenyi Biotec）中取出的每种酶的冻干粉末在溶解前先重新配制，并分装后储存在-20?C。酶D在瓶中用3 mL RPMI 1640或DMEM重新配制，而酶R在瓶中用2.7 mL RPMI 1640或DMEM重新配制。酶A使用试剂盒中提供的1 mL Buffer A重新配制。为了制备酶混合物，在gentleMACS C Tube中加入2.35 mL RPMI 1640或DMEM、100 μL酶D、50 μL酶R和12.5 μL酶A。处理肿瘤样本时去除脂肪、纤维和坏死区域。将样本切成2–4 mm的小块并转移到含有酶混合物的gentleMACS C Tube中。C Tube紧密关闭并倒置连接到gentleMACS Dissociator的套筒上。选择gentleMACS? Program 37C_m_TDK_1并运行。完成后，取下C Tube，并进行短暂离心以收集管底的样本物质。将样本重新悬浮，并将细胞悬液施加到放置在15 mL管上的70 μm细胞过滤器上。用10 mL RPMI 1640或DMEM洗涤细胞过滤器。将得到的细胞悬液以300×g离心7分钟，完全吸出上清液。将沉淀物重新悬浮在3 mL红细胞裂解缓冲液（NH4Cl）中以裂解红细胞。通过加入10 mL完全培养基（CM）停止裂解过程，然后以400×g离心5分钟。细胞用1x PBS洗涤两次，将沉淀物重新悬浮在PBS中并转移到测试管中：每个对照组样本取1/3，混合后分成8个测试管（单抗体染色用于基质补偿）——每个对照组样本的剩余细胞（2/3）用于抗体染色。来自处理过的脾脏的细胞样本用于抗体染色。将试管以400xg离心5分钟，弃去上清液。细胞在冰上与Fc受体阻断抗体（CD16/CD32 Rat anti-Mouse，未标记，克隆：2.4G2，BD，fisher scientific）和洗涤液（WS；1x PBS + 1% FBS）一起孵育30分钟。然后加入2mL WS并以400xg离心5分钟。弃去上清液，细胞与针对CD4+ T细胞（anti-CD4 APC（CD4单克隆抗体（GK1.5），APC，eBioscience?，ThermoFisher）、anti-CD8α PE-Texas Red（CD8 alpha单克隆抗体（5H10），PE-Texas Red，ThermoFisher）和anti-CD69 PE（CD69单克隆抗体（H1.2F3），PE，eBioscience?，ThermoFisher）的一抗一起孵育1小时（避光）。为了基质补偿，对照组细胞分别用单抗体染色。孵育后，加入2mL WS并以400xg离心5分钟。细胞用1x PBS洗涤两次，重新悬浮在PBS中并转移到1.5mL微量测试管中（总体积不超过200μL）。使用基于图像的流式细胞术（Amnis? ImageStream?X Mk II，Luminex，美国）检测抗体标记的细胞。分析使用IDEAS应用程序v6.0（Luminex，美国）进行。

**结果**
**体外结果**
为了评估各种纳米颗粒和蜂毒对KPC胰腺癌细胞的影响，我们进行了一系列体外生存力测定。在测试的试剂中，2%Fe-ZnO纳米颗粒在所检测的浓度范围内没有引起细胞生存力的统计学显著降低，表明在所用条件下其细胞毒性潜力有限。相比之下，1%Fe-ZnO纳米颗粒表现出浓度依赖性效应，从75 μg/mL开始观察到显著的生存力降低（p < 0.01）。Ag-Citrate-5 nm纳米颗粒显示出更大的效力，从50 μg/mL开始就表现出显著的细胞毒性（p < 0.01）（图1A）。粗蜂毒和Cu2,5 nm纳米颗粒都表现出明显的细胞毒性，在低至5 μg/mL的浓度下就检测到细胞生存力的显著降低。为了进一步确定它们的有效剂量范围，我们进行了低浓度下的后续实验。这些实验表明，Cu2,5 nm纳米颗粒在1 μg/mL时仍保持显著的细胞毒性（p < 0.0001），而BV在其活性阈值5 μg/mL时仍然有效（p < 0.0001）（图1B）。半数抑制浓度（IC50）进一步证实，与无机纳米颗粒相比，粗蜂毒是对KPC胰腺癌细胞最有效的处理方法（IC50 = 2.9 μg/mL）（图1G）。基于这些发现，我们进一步研究了BV对更广泛的癌细胞和健康细胞系的细胞毒性。结果表明，BV对癌细胞的毒性显著高于健康细胞。在5–6 μg/mL的浓度下，观察到癌细胞系E0771（p < 0.0001）、4T1（p < 0.0001）和KPC（p < 0.01）的细胞生存力显著降低。相比之下，在这些浓度下健康细胞系的生存力没有显著变化，表明BV可能对恶性细胞具有选择性毒性（图1C，D）。当浓度增加到8 μg/mL时，癌细胞系Renca（28%）、CT26（46%）、E0771（8%）、4T1（20%）、KPC（44.6%）和MDA-MB（66.9%）的细胞生存力显著降低（p < 0.0001），而Panc-1（90.8%）、B16-F10和B16-F10（90.2%）细胞系没有明显下降。相反，健康细胞系EaHy926（105%）、Bend3（95%）和HFF-1（92%）基本不受影响，只有293T细胞系（83%）的生存力略有下降（图1C，D）。在对Panc-1（63.3%）、B16-F10（77.8%）、HFF-1（84%）和HeLa（90%）细胞系的进一步研究中，我们增加了BV的浓度，发现15 μg/mL时Panc-1和B16-F10的细胞生存力显著降低（p < 0.0001和p < 0.001，分别）（图1C）。这一趋势在更高浓度下持续存在，Panc-1、B16-F10和HeLa细胞系的生存力在25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL时降至约10%。相比之下，HFF-1在25 μg/mL时的生存力为61%，在50 μg/mL和100 μg/mL时分别降至38%和25%。在25 μg/mL时，HFF-1和Panc-1（p < 0.001）以及B16-F10（p < 0.01）细胞系之间存在显著差异。在50 μg/mL时，HFF-1和Panc-1（p < 0.05）之间也存在显著差异（图1E）。IC??分析进一步支持了这些发现。KPC细胞最敏感（IC?? = 3.00 μg/mL），其次是E0771、4T1和Renca细胞（IC?? = 5.14–7.25 μg/mL）。更具抗性的癌细胞系，包括B16-F10、Panc-1和HeLa，显示出更高的IC??值（16.80–22.04 μg/mL）。在非恶性细胞中，HFF-1成纤维细胞的敏感性中等（IC?? = 39.05 μg/mL），而EaHy926、Bend3和293T细胞在测试范围内未达到明确的IC??，反映出最小的抑制作用（表1和2）。总体而言，这些结果表明粗蜂毒对癌细胞具有强效且选择性的细胞毒性，对健康细胞的影响有限。在较低浓度下Panc-1、B16-F10和HeLa细胞最初表现出抗性，而在较高剂量下则表现出明显的敏感性，这突显了BV诱导的细胞毒性的异质性和剂量依赖性。

**图1**
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**不同细胞系中蜂毒的剂量依赖性细胞毒性效应**
A）折线图显示了各种无机纳米颗粒和粗蜂毒对KPC胰腺癌细胞系的细胞毒性效应。细胞系在（0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 μg/mL）的浓度下进行处理，未处理的细胞作为对照。
B）图表显示了粗蜂毒和Cu2,5 nm对KPC胰腺癌细胞系的细胞毒性效应。细胞系在（0, 0;5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 50, 75, 100, 150, 200 μg/mL）的浓度下进行处理。
C）图表显示了BV对癌细胞系RENCA、CT26、KPC、E0771、MDA-MB、4T1、B16-F10、Panc-1和HeLa的细胞毒性效应。每个细胞系在0, 1, 4, 5, 6, 8 μg/mL的浓度下用BV处理，未处理的细胞作为对照。
D）图表显示了BV对非癌细胞系EaHy926、Bend3、293T和HFF-1的细胞毒性效应。每个细胞系在0, 1, 4, 5, 6, 8 μg/mL的浓度下用BV处理，未处理的细胞作为对照。
E）Panc-1、B16-F10、HFF-1和HeLa细胞在较高浓度（0, 1, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 25, 50, 100 μg/mL）的BV下进行处理。
F）折线图比较了长期储存（1年）和储存20天的粗蜂毒对RENCA细胞的细胞毒性效应。测试了不同浓度的BV（0, 4, 6, 8, 10 μg/mL）。适当的地方标明了显著性水平（*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001；****：p < 0.0001）。

**表1** 无机纳米颗粒和粗蜂毒在KPC胰腺癌细胞中的IC??值
**表2** 粗蜂毒在癌细胞和非癌细胞系中的IC??值

**长期储存后的蜂毒生物活性**
使用不同储存时间的蜂毒样本（在室温下干燥条件下储存1年和20天）评估了粗蜂毒对Renca细胞的影响。两种样本在4 μg/mL、6 μg/mL、8 μg/mL和10 μg/mL的浓度下对Renca细胞进行了测试。结果表明，在任何测试浓度下，一年旧和20天旧的蜂毒样本之间的细胞毒性效应没有显著差异。具体来说，两种蜂毒样本在所有浓度下都表现出相似的细胞毒性水平，表明在测试范围内，蜂毒的储存时间对其对Renca细胞的效力没有影响（图1F）。这些发现表明，蜂毒在室温下干燥储存时能够保持其生物活性，持续有效地诱导Renca细胞的细胞毒性。

**蜂毒与蜂毒肽的比较**
为了比较粗蜂毒和蜂毒肽的细胞毒性效应，我们对三种不同的癌细胞系（KPC、MDA-MB和E0771）进行了体外生存力测定。研究结果表明，与蜂毒肽（melittin）相比，粗蜂毒（BV）在所有测试的细胞系中表现出更强的细胞毒性。对于KPC细胞系，当BV浓度为6 μg/mL时，观察到细胞活力显著下降（p < 0.0001），而蜂毒肽在任何测试浓度下均未引起显著下降（图2A）。在MDA-MB细胞系中，BV在8 μg/mL浓度下导致细胞活力显著下降（p < 0.0001），而蜂毒肽在任何测试浓度下也未引起显著下降（图2B）。对于E0771细胞系，BV在6 μg/mL浓度下显著降低了细胞活力（p < 0.001），而蜂毒肽则需要8 μg/mL浓度才能达到显著效果（p < 0.05）（图2C）。这些发现进一步得到了IC50分析的支持。BV表现出强大的细胞毒性，其IC50值分别为KPC细胞3.00 μg/mL、MDA-MB细胞9.71 μg/mL和E0771细胞5.14 μg/mL。相比之下，由于在测试浓度范围内抑制作用较弱，蜂毒肽在KPC或MDA-MB细胞中未能达到明确的IC50值，并且仅在E0771细胞中显示出可测量的细胞毒性（IC50 = 9.92 μg/mL）（表3）。总体而言，这些结果表明，粗蜂毒在降低癌细胞活力方面比蜂毒肽更有效，突显了其在多种肿瘤模型中更强的、更一致的细胞毒性潜力。

图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像：粗蜂毒与蜂毒肽的比较细胞毒性。A-C）粗蜂毒和蜂毒肽对KPC（A）、MDA-MB（B）和E0771（C）细胞的细胞毒性效应。细胞在指定浓度下处理24小时后，活力以相对于未处理对照组（设定为100%）的百分比表示。数据代表三次独立实验的平均值±标准差（n = 3）。适当位置标明了显著性水平（*：p < 0.05；**：p < 0.01；***：p < 0.001；****：p < 0.0001）。

表3：粗蜂毒和蜂毒肽对各种癌细胞系的IC50值。全尺寸表格。

**体内实验**：
在本研究中，我们调查了粗蜂毒和epacadostat对体内肿瘤生长的影响。每只小鼠皮下注射了1.0 × 10^6个细胞。7天后开始治疗，每天给予BV（75 μg/小鼠），并以14天间隔给予epacadostat（0.1 mg/g小鼠）。每个治疗组包含5只小鼠（图3A）。
对小鼠KPC肿瘤的体内治疗显示，三个实验组之间的肿瘤体积存在显著差异：粗蜂毒（BV）、Epacadostat和对照组。在12天的观察期间，对照组和Epacadostat组的肿瘤体积稳步增加，达到约600 mm3。相比之下，BV处理组的肿瘤生长受到明显抑制，在整个研究期间肿瘤体积保持在300 mm3以下（图3A）。
统计分析表明，BV治疗组相对于对照组和Epacadostat组具有优越性。在治疗后的第8天、10天和12天，BV处理组的肿瘤体积显著小于对照组和Epacadostat组，p值分别为p < 0.01和p < 0.0001，这突显了蜂毒在减缓肿瘤进展方面的治疗潜力。

在随后的体内研究中，我们评估了BV（75 μg/小鼠）和抗PD-L1抗体（200 μg/小鼠）联合使用（无论是否同时使用epacadostat（0.1 mg/g小鼠）对皮下诱导的KPC细胞小鼠肿瘤生长的影响。BV每2天给药一次，共进行3次治疗。抗PD-L1抗体和epacadostat分别在第一次BV治疗后的24小时和最后一次BV治疗后的24小时给药（图3B）。
对小鼠KPC肿瘤的体内治疗显示，实验组之间的肿瘤生长存在显著差异。对照组随时间肿瘤体积持续增加。BV+抗PD-L1组显示出比对照组更明显的肿瘤生长抑制。值得注意的是，BV+抗PD-L1+Epacadostat组在所有时间点都显示出最显著的肿瘤生长抑制，肿瘤体积显著低于其他组。统计分析确认了这些组之间的显著差异，p值分别为p < 0.01和p < 0.001（图3B）。

**协同T细胞激活**：
粗蜂毒、Epacadostat和抗PD1疗法的组合显示出了明显的免疫调节作用，特别是在增强T细胞的招募和激活方面。在肿瘤部位和脾脏中，BV+Epacadostat+抗PD1组的CD8+T细胞水平显著高于其他组（分别为26.4%和13.49%）（图3C）。此外，在肿瘤部位，这种联合疗法还与CD4+T细胞的显著增加相关（34.23%）（图3F）。激活标志物分析揭示了细微的差异。在脾脏中，BV+Epacadostat+抗PD1组的CD4+T细胞激活标志物CD69显著升高（3.05%），超过了BV+抗PD1组和对照组（分别为2.58%）。然而，CD4+T细胞激活标志物CD38则显示出相反的趋势，BV+抗PD1组的CD38水平显著高于BV+Epacadostat+抗PD1组（4.97%）和对照组（5.50%）（图3D）。
在肿瘤部位，T细胞的差异性激活同样明显。BV+Epacadostat+抗PD1组的CD8+T细胞激活标志物CD69显著升高（74.28%），优于其他治疗组（图3H）。同时，BV+抗PD1组的CD4+和CD8+T细胞激活标志物CD38也显著升高（分别为69.23%和93.58%），优于BV+Epacadostat+抗PD1组（分别为4.97%和5.50%）和对照组（分别为55.17%和57.69%）（图3G，H）。
这些发现表明，BV、抗PD1和Epacadostat的组合不仅减少了肿瘤生长，还增强了肿瘤部位的免疫反应，突显了其作为治疗策略的潜力。

**讨论与结论**：
本研究提供了无机纳米颗粒和粗蜂毒抗癌特性的比较评估，揭示了不同的疗效特征和机制机制。在评估的纳米颗粒制剂中，Cu2.5 nm纳米颗粒表现出最强的细胞毒性，在低至1–5 μg/mL的浓度下就能降低胰腺癌细胞的活力。这种高效力与最近的研究结果一致，这些研究表明基于铜的纳米结构能够诱导氧化应激、线粒体去极化和调节性细胞死亡途径（包括铜死亡），这些途径越来越被认为是胰腺和其他实体瘤的有希望的治疗途径[13,14,15]。相比之下，Ag-Citrate-5 nm纳米颗粒在50 μg/mL浓度下表现出中等细胞毒性，这与报道一致，即银纳米颗粒主要通过ROS生成和膜破坏发挥抗癌作用，但通常需要更高浓度才能达到类似的效力[15,16,17]。FeZnO纳米颗粒的活性最弱，2%FeZnO的细胞毒性最小，1%FeZnO仅在较高剂量下表现出浓度依赖性效应。这些发现与最近的研究一致，表明铁掺杂可以调节ZnO的带隙、表面电荷和ROS生成能力，从而根据掺杂水平和合成方法增强或抑制抗癌活性[18,19,20]。这里观察到的有限效力表明，所使用的特定Fe掺杂配置可能无法达到所需的ROS阈值，从而影响了ZnO基系统的物理化学调节敏感性。
相比之下，蜂毒在本研究中成为最具生物活性的物质，在多种癌细胞系中表现出广泛的细胞毒性，同时对非恶性细胞的影响较小。这种选择性毒性与近期文献一致，这些文献表明蜂毒肽、磷脂酶A2和其他毒液肽能够协同破坏癌细胞膜、诱导凋亡并调节炎症途径[21,22,23]。我们的储存实验进一步证实，蜂毒在室温下干燥储存后仍保持其功能性细胞毒性，这与成分分析结果一致，表明在类似条件下毒液肽具有长期稳定性[24]。
不同癌细胞系之间的敏感性差异——特别是Panc-1、B16-F10和HeLa细胞在较低剂量下的相对抗性——反映了膜组成、脂质筏密度和细胞内应激反应途径的异质性。最近的机制研究表明，蜂毒肽的疗效取决于膜胆固醇含量、线粒体预激活和解毒酶的表达，这些因素在不同肿瘤类型中差异很大[25, 26]。然而，在较高剂量下，这些耐药细胞系表现出明显的剂量依赖性活力下降，这与累积的膜破坏和凋亡信号传导一致[27,28,29]。在高剂量下观察到的平台期可能反映了AlamarBlue HS检测的技术局限性，因为背景荧光可能会掩盖代谢活动的进一步下降。
本研究的一个核心目标是将粗蜂毒与单独的蜂毒肽进行比较。在KPC、MDA-MB和E0771细胞中，粗蜂毒始终优于蜂毒肽，支持了毒液成分之间的协同作用可以增强抗癌效力的假设。最近的研究也报告了蜂毒肽的活性受到PLA2、apamin和adolapin等共因子的调节，这些因子可以影响膜结合、细胞内信号传导和免疫激活[23, 30]。我们的发现提供了直接实验证据，证明完整的毒液混合物比单独的蜂毒肽具有优势，强调了在治疗开发中考虑毒液复杂性的重要性。
体内实验进一步证明了粗蜂毒的治疗潜力。单独使用蜂毒可以抑制KPC肿瘤的生长，而与抗PD-L1抗体联合使用——进一步与Epacadostat联合使用——可以增强肿瘤控制。这些结果与最近的研究一致，表明粗蜂毒可以调节肿瘤微环境、促进树突状细胞激活，并增强T细胞的预激活，从而改善对检查点抑制剂的反应[30,31,32]。我们研究中观察到的CD4+和CD8+ T细胞的增加浸润和激活与这些发现一致。CD69表达的升高表明早期T细胞激活，而CD38的上调可能反映了代谢参与或过渡性激活状态。最近的免疫疗法研究强调，这些标志物表明免疫参与，但它们并不能单独定义持久的效应功能[33]。因此，我们的数据支持了免疫激活的增强，同时认识到需要进一步表型分析来全面表征功能性抗肿瘤反应。
总体而言，这些发现强调了粗蜂毒的双重抗癌潜力，它既可以直接作为细胞毒性剂，也可以作为抗肿瘤免疫的调节剂。结合纳米颗粒的结果来看，这些发现突显了治疗效果是如何受到物理化学性质和生物复杂性相互作用的影响。通过提供这两种模式的比较证据，我们的研究将粗蜂毒定位为未来转化开发的特别有吸引力的候选者。

**局限性**：
本研究有几个局限性，在解释结果时需要考虑。首先，体外实验是在定义的小鼠和人类癌细胞系上进行的，观察到的敏感性模式可能无法完全代表人类肿瘤的异质性。其次，体内实验仅限于单一的皮下KPC模型，并且随访期相对较短，无法得出关于长期疗效、复发动态或系统毒性的结论。第三，虽然我们讨论了ROS生成、线粒体功能障碍和免疫激活等机制，但这些机制是从文献中推断出来的，并未通过专门的机制检测进行直接验证。第四，AlamarBlue HS检测在高BV浓度下观察到的平台期引入了一个方法学限制，可能会低估最大细胞毒性。最后，BV和纳米颗粒的剂量相关性、生物分布和药代动力学行为尚未评估；未来结合临床相关剂量和毒性分析的研究对于确定转化潜力至关重要。