血清miR-15b-3p作为颈动脉狭窄的潜在诊断生物标志物

《Artery Research》：Serum miR-15b-3p as a Potential Diagnostic Biomarker for Carotid Artery Stenosis

　　**摘要**

**背景与目的**
颈动脉狭窄（CAS）是导致脑梗死的重要因素。miR-15b-3p在多种疾病中表现出异常表达。本研究旨在评估CAS患者血清中miR-15b-3p的表达水平、其诊断价值以及相关机制。

**方法**
本研究招募了111名CAS患者和157名健康对照组。通过接收者操作特征（ROC）曲线评估miR-15b-3p的诊断潜力。利用细胞转染、增殖实验和凋亡分析研究miR-15b-3p对人类血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）的作用。通过生物信息学分析确定miR-15b-3p的靶标，并通过双荧光素酶实验进行验证。

**结果**
与对照组相比，CAS患者的血清miR-15b-3p水平显著升高。miR-15b-3p在CAS检测中的敏感性为75.68%，特异性为81.82%（AUC = 0.853），并且能够区分重度CAS（AUC = 0.788，敏感性 = 74.51%，特异性 = 76.67%）。miR-15b-3p通过靶向PTEN促进HA-VSMCs的增殖并抑制其凋亡。在CAS患者中，PTEN与miR-15b-3p水平呈负相关（r = -0.601，P < 0.001）。

**结论**
CAS患者的血清miR-15b-3p水平升高，它通过靶向PTEN促进HA-VSMCs的增殖。尽管miR-15b-3p在CAS诊断中具有潜力，但目前尚不足以用于临床诊断。

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**引言**
颈动脉狭窄（CAS）是脑梗死和脑死亡的重要原因[1,2,3]。由于人口老龄化和生活方式的改变，CAS的发病率在全球范围内逐渐增加[4, 5]。CAS的发病机制复杂，涉及多种因素，如动脉粥样硬化、颈动脉夹层以及炎症和免疫相关的血管疾病[6,7,8]。动脉粥样硬化是CAS的主要原因，会导致颈动脉内膜增厚和斑块形成，从而引起血管狭窄和血流受阻[9]。此外，高血压、高脂血症、糖尿病和吸烟都是CAS的重要风险因素[10]。CAS的早期症状不典型，包括短暂性脑缺血发作（TIAs）、头晕、头痛和认知障碍[11]。目前CAS的诊断方法主要依赖于影像学检查[12]。虽然这些方法有效，但通常需要专门的设备和专业知识。因此，有必要探索更多无创且敏感的生物标志物，以促进CAS的早期发现和分层。

**背景与目的**
颈动脉狭窄（CAS）是导致脑梗死的重要因素。miR-15b-3p在多种疾病中表现出异常表达。本研究旨在评估CAS患者血清中miR-15b-3p的表达水平、其诊断价值以及相关机制。

**方法**
本研究招募了111名CAS患者和157名健康对照组。通过接收者操作特征（ROC）曲线评估miR-15b-3p的诊断潜力。利用细胞转染、增殖实验和凋亡分析研究miR-15b-3p对人类血管平滑肌细胞（HA-VSMCs）的作用。通过生物信息学分析确定miR-15b-3p的靶标，并通过双荧光素酶实验进行验证。

**结果**
与对照组相比，CAS患者的血清miR-15b-3p水平显著升高。miR-15b-3p在CAS检测中的敏感性为75.68%，特异性为81.82%（AUC = 0.853），并且能够区分重度CAS（AUC = 0.788，敏感性 = 74.51%，特异性 = 76.67%）。miR-15b-3p通过靶向PTEN促进HA-VSMCs的增殖并抑制其凋亡。在CAS患者中，PTEN与miR-15b-3p水平呈负相关（r = -0.601，P < 0.001）。

**结论**
CAS患者的血清miR-15b-3p水平升高，它通过靶向PTEN促进HA-VSMCs的增殖。尽管miR-15b-3p在CAS诊断中具有潜力，但目前尚不足以用于临床诊断。

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**2 材料与方法**
2.1 研究对象
样本量通过GPower 3.1计算得出。当效应量为0.5、α为0.05、功效为0.95时，每组样本量为105例。所有受试者均来自陆军医科大学第一附属医院，收集时间为2023年1月至2024年12月。根据2003年共识标准，通过多普勒双工超声诊断CAS患者[24]。所有入组的CAS患者在招募时均无症状。无症状且内颈动脉狭窄程度超过50%的患者被纳入CAS组。根据峰值收缩期速度（PSV）125–230 cm/s和舒张期末速度（EDV）40–100 cm/s，将狭窄程度分为中度（内颈动脉：50–69%）；根据PSV > 230 cm/s和EDV > 100 cm/s，分为重度（内颈动脉 ≥ 70%，包括部分阻塞）。查阅电子病历以确认CAS患者和对照组的高血压诊断和用药史（抗高血压药物和阿司匹林使用史）。排除以下情况的患者：有其他严重的心脑血管疾病史；患有恶性肿瘤；有严重的肝或肾功能障碍；或在过去3个月内有颅内出血、急性缺血性中风或心肌梗死史。对照组根据年龄和性别与CAS患者进行频率匹配，以减少这些变量的潜在混淆效应。本研究获得了陆军医科大学第一附属医院的伦理委员会批准（批准编号：2022E02）。在详细说明研究目的后，所有患者均签署了同意书。本研究符合《赫尔辛基宣言》的规定。

2.2 样本与数据收集
受试者禁食12小时后提供10 mL外周静脉血。离心1500 rpm 15分钟后，收集血清并储存在-80°C直至分析。从所有参与者处获取基线临床特征，包括高血压史和当前用药情况。通过实验室检测收集空腹血糖（FBG）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）水平。

2.3 表达检测
使用Trizol试剂（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）从总血清样本中提取RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）评估提取RNA的完整性和浓度。所有样本的A260/A280比值在1.8至2.1之间，表明RNA纯度较高。进一步使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美国）确认代表性RNA样本（从CAS组和对照组中随机选取20%的样本）的完整性，结果显示RNA完整性数 > 7。

2.4 细胞培养与转染
人类血管平滑肌细胞（T/G HA-VSMCs，ATCC；CRL-1999）在含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养，温度为37°C，二氧化碳浓度为5%，湿度为95%。细胞分为四组：空白对照组、合成miR-15b-3p阴性对照（miR-NC）、合成miR-15b-3p模拟物（miR mimic）和合成miR-15b-3p抑制剂（miR inhibitor）。按照制造商指南使用Lipofectamine 3000（Invitrogen，美国纽约格兰德岛）进行转染。miR-NC、miR mimic和miR inhibitor是设计用来促进或抑制miR-15b-3p表达的合成寡核苷酸。miR-15b-3p抑制剂是一种修饰的反义寡核苷酸，可结合并隔离内源性miR-15b-3p以抑制其表达。

2.5 细胞增殖
转染后，将细胞接种到96孔板中（每孔5×103个细胞）。转染后0小时、24小时、48小时和72小时，向每个孔加入10 μL CCK-8溶液。2.5小时后，使用微孔板读数仪测量450 nm处的吸光度。

2.6 细胞凋亡
收集每组的样本，并使用缓冲液制备细胞悬浮液，浓度为1×10^6个细胞/mL。根据Elabscience（中国武汉）提供的 Annexin V-FITC/PI试剂盒的指南，将Annexin V-FITC和PI加入悬浮液中。在25°C下暗处孵育15分钟后，使用FACS流式细胞仪评估凋亡率。

2.7 miR-15b-3p的靶标选择
通过miRDB、TargetScan和miRWalk数据库确定miR-15b-3p的潜在靶标。使用STRING平台构建靶基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。

2.8 双荧光素酶实验
将含有miR-15b-3b结合位点的PTEN 3’-非翻译区（UTR）片段插入pGL3载体中，形成野生型质粒；还制备了突变质粒。这些质粒与miR-NC、miR-15b-3p模拟物或抑制剂一起转染到HA-VSMCs中。48小时后，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega，美国）检测荧光素酶活性。

2.9 统计分析
数据使用SPSS 27.0进行分析。图表使用GraphPad Prism 9.0制作。定量数据以均值±标准差（SD）表示，通过Student’s t检验或非参数方法进行比较。分类变量的比较使用卡方检验进行。通过接收者操作特征（ROC）曲线检测miR-15b-3b在CAS诊断中的价值。此外，进行逻辑回归分析以计算比值比（OR）及95%置信区间（95% CIs），探讨每个风险因素对CAS的影响。统计显著性水平设为0.05。

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**3 结果**
3.1 研究对象
本研究共招募了111名CAS患者和157名健康对照组。两组在年龄和性别上无显著差异（表1，P > 0.05）。关于吸烟状况，对照组中有31.85%的受试者和CAS患者中有36.94%的受试者吸烟，两者之间无显著差异。血压参数存在显著差异。CAS患者的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）显著升高（P < 0.001）。CAS患者的TC、TG和LDL水平略有升高，但无统计学意义（P > 0.05）。然而，CAS患者的HDL水平显著低于对照组（P = 0.013）。CAS患者的抗高血压和抗血小板治疗使用率显著高于对照组（P < 0.001）。在111名CAS患者中，60例为中度狭窄（50–69%），51例为重度狭窄（≥70%）。

**表1 颈动脉狭窄患者的临床特征**

3.2 miR-15b-3b在CAS和重度狭窄中的诊断价值
与对照组相比，CAS患者的血清miR-15b-3p水平升高（图1A，P < 0.001）。高浓度的miR-15b-3p可以有效区分CAS患者和对照组，敏感性为75.68%，特异性为81.82%，ROC曲线下面积（AUC）为0.853（0.806–0.900），临界值为1.265（图1B）。

**图1**
A. 颈动脉狭窄中miR-15b-3b的异常表达。B. miR-15b-3b在CAS中的诊断价值。C. 内颈动脉狭窄≥70%的CAS患者中miR-15b-3b水平较高。D. miR-15b-3p与狭窄程度之间的相关性分析。**miR-15b-3p在颈动脉狭窄（CAS）程度诊断中的价值。** ***，P < 0.001 **在重度CAS（狭窄度≥70%）患者中发现的miR-15b-3p过表达程度高于中度CAS（狭窄度=50–69%）患者（图1C）。研究发现miR-15b-3p水平与狭窄程度之间存在正相关（Spearman’s r = 0.526，P < 0.001，图1D）。ROC曲线表明，当miR-15b-3p水平≥1.765时，可以区分重度CAS患者（AUC = 0.788，95% CI = 0.699–0.877，敏感性 = 74.51%，特异性 = 76.67%，图1E）。**

**3.3 miR-15b-3p与CAS风险的相关性分析** 单变量分析显示，高血压（OR = 5.244，95% CI = 3.069–8.959，P < 0.001）、低血压（OR = 2.264，95% CI = 1.374–3.730，P = 0.001）、抗高血压治疗（OR = 2.116，95% CI = 1.221–3.668，P = 0.008）、阿司匹林使用史（OR = 2.038，95% CI = 1.185–3.506，P = 0.010）以及miR-15b-3p表达（OR = 4.138，95% CI = 2.409–7.110，P < 0.001）与CAS风险增加相关。高HDL与CAS风险降低相关（OR = 0.576，95% CI = 0.352–0.941，P = 0.028）（表2）。为了更准确地估计miR-15b-3p与CAS之间的独立关联，进行了多变量逻辑回归分析以调整潜在的混杂因素，这些因素在单变量分析中具有显著性。多变量分析表明，高血压（调整后OR = 4.767，95% CI = 2.638–8.616，P < 0.001）、低血压（调整后OR = 2.551，95% CI = 1.407–4.626，P = 0.002）、抗高血压治疗（调整后OR = 1.912，95% CI = 1.002–3.649，P = 0.049）、阿司匹林使用史（调整后OR = 1.965，95% CI = 1.044–3.698，P = 0.036）和miR-15b-3p表达（调整后OR = 4.222，95% CI = 2.253–7.914，P < 0.001）仍然是CAS的显著风险因素。高HDL仍与CAS风险呈显著负相关（调整后OR = 0.440，95% CI = 0.244–0.795，P = 0.006）。

**表2 颈动脉狭窄（CAS）风险因素的多变量逻辑回归分析（CAS患者 vs. 健康对照组）** **完整表格**

**3.4 miR-15b-3p与CAS程度的相关性分析** 进行了单变量分析以探讨与狭窄程度相关的风险因素（表3）。结果显示，高血压（OR = 2.687，95% CI = 1.065–6.785，P = 0.036）、低血压（OR = 2.558，95% CI = 1.139–5.741，P = 0.023）、高HDL（OR = 0.428，95% CI = 0.196–0.932，P = 0.032）、抗高血压治疗（OR = 2.259，95% CI = 1.020–5.001，P = 0.044）、阿司匹林使用史（OR = 2.444，95% CI = 1.105–5.405，P = 0.027）和miR-15b-3p水平（OR = 2.949，95% CI = 1.359–6.402，P = 0.006）与CAS程度显著相关。然后将这些显著因素纳入多变量分析。结果显示，高血压（调整后OR = 4.300，95% CI = 1.564–11.820，P = 0.005）、抗高血压治疗（调整后OR = 3.062，95% CI = 1.183–7.922，P = 0.021）、阿司匹林使用史（调整后OR = 2.547，95% CI = 1.002–6.476，P = 0.049）和miR-15b-3p水平（调整后OR = 4.945，95% CI = 1.875–13.037，P = 0.001）是重度CAS的风险因素。而高HDL仍与重度CAS呈显著负相关（调整后OR = 0.302，95% CI = 0.119–0.767，P = 0.012）。** **完整表格**

**3.5 miR-15b-3p促进HA-VSMC细胞的增殖并抑制其凋亡** 为了分析miR-15b-3p在CAS发展中的作用，将合成的miR-15b-3p模拟物（用于过表达miR-15b-3p）和miR-15b-3p抑制剂（用于敲低miR-15b-3p）转染到HA-VSMCs中。在转染了miR-15b-3p模拟物的细胞中，miR-15b-3p水平升高，而在转染了miR-15b-3p抑制剂的细胞中，miR-15b-3p水平降低（图2A，P < 0.01）。miR-15b-3p模拟物显著促进了HA-VSMCs的增殖，而miR-15b-3p抑制剂则抑制了其增殖（图2B，P < 0.01）。miR-15b-3p抑制剂增强了HA-VSMC细胞的凋亡，而miR-15b-3p模拟物则抑制了凋亡（图2C，P < 0.01）。

**图2** 该图像的替代文本可能是使用AI生成的。** **完整图像**

**miR-15b-30的功能分析。** A. 确认转染细胞中miR-15b-30的表达。B. miR-15b-30可以促进血管平滑肌细胞的增殖。C. miR-15b-30可以抑制血管平滑肌细胞的凋亡。** **P < 0.01；***P < 0.001**

**3.6 PTEN是miR-15b-30的直接靶基因** 从miRDB、TargetScan和miRWalk数据库中提取的靶基因（结合概率>0.9）使用Venn图进行了汇总。然后获得了110个总结靶基因（图3A）。通过PPI网络分析这些基因，发现PTEN具有最高的节点度数（n = 8）（图3B）。双荧光素酶报告基因检测表明，miR模拟物显著降低了相对荧光素酶活性，而miR抑制剂则提高了活性（图3C），这表明miR-15b-30结合到PTEN的3’-UTR上以调节其表达。在转染了miR-15b-30模拟物的细胞中，PTEN表达降低，而在转染了miR-15b-30抑制剂的细胞中，PTEN表达升高（图3D）。此外，CAS患者的PTEN水平低于对照组（图3E），并且与miR-15b-30呈负相关（r = -0.601，P < 0.001，图3F）。

**图3** 该图像的替代文本可能是使用AI生成的。** **完整图像**

**miR-15b-30的靶基因。** A. 靶基因的选择。B. miR-15b-30与PTEN的PPI网络。C. 确认转染细胞中PTEN的表达。D. 血清中PTEN的表达水平。F. miR-15b-30与PTEN之间的相关性。** **P < 0.01；***P < 0.001**

**4. 讨论** 最近的心脏miRNA研究逐渐关注miR-15b-30在各种疾病中的失调[14, 19]。本研究测量了全血清中的总miR-15b-30水平，而没有分离外泌体（EVs）。本研究首次系统地评估了CAS患者中的血清miR-15b-30水平，并探讨了其在CAS发病机制中的潜在作用。结果表明，CAS患者的血清miR-15b-30水平显著高于健康个体，并与CAS程度相关。高水平的miR-15b-30显示出对CAS风险和程度的显著诊断潜力。miR-15b-30通过靶向PTEN促进VSMC的增殖。

目前的结果表明，CAS患者的血清miR-15b-30水平升高，与CAS的严重程度呈正相关，并能区分重度CAS和中度CAS。多变量分析显示，血清miR-15b-30可能作为CAS风险和严重程度的独立风险因素，其作用强度超过4倍。目前的结果与心血管疾病领域之前的研究一致。例如，Blaser等人发现miR-15b-30在动脉粥样硬化[13]和心房颤动[19]中显著上调，这些都是CAS的风险因素。这种一致性突显了其作为可靠的、无创CAS生物标志物的潜力。

为了研究miR-15b-30在CAS发展中的潜在作用，对HA-VSMCs进行了miR-15b-30的过表达和下调实验。体外研究发现，miR-15b-30模拟物显著增强了HA-VSMCs的增殖，而miR-15b-30抑制剂则减少了细胞增殖并增加了凋亡。作为miR-15b-30的直接靶基因，PTEN在miR-15b-30模拟物处理的细胞中降低。在CAS患者中，PTEN表达显著降低，并与miR-15b-30水平呈负相关。类似地，miR-15b-30的上调与胃癌[20]和前列腺癌[25]中的细胞增殖增加和凋亡减少相关。Lin及其同事发现，PTEN在狭窄动脉组织中显著降低[26]。此外，Zhang等人发现PTEN/AKT/mTOR通路可以调节兔VSMCs的增殖和凋亡[23]。这些研究表明，miR-15b-30可能通过靶向PTEN来调节HA-VSMCs的增殖和凋亡。异常的VSMCs增殖和凋亡是动脉粥样硬化进展的关键因素[27, 28]。

CAS的发病机制由不同类型细胞中的miRNA网络调节。本研究确定miR-15b-30通过靶向PTEN促进HA-VSMCs的增殖。这一机制与其他与CAS相关的miRNA的功能形成对比，但也补充了它们的作用。例如，miR-155主要在斑块内的巨噬细胞中触发促炎反应，通过抑制Bcl6来促进动脉粥样硬化[29]。miR-155与颈动脉粥样硬化的斑块表型相关，这一点通过超声检查得到证实[30]。为了维持表型，miR-145通过靶向KLF4保持VSMC的收缩性表型，其丢失会促进新生内膜的形成[31]。此外，CAS患者中miR-106b-5p和miR-27b的上调表明了另一个调节节点[32, 33]。未来的研究应探讨miR-15b-30与其他miRNA的结合，以创建一个在平行通路中起作用的协同网络。

尽管本研究揭示了CAS中miR-15b-30的失调及其可能的机制，但仍存在一些局限性。首先，样本量小和单一中心可能导致选择偏差。未来的研究应在更大的多中心队列中验证miR-15b-30的诊断效果，以评估其在不同种族和人群中的适用性。其次，虽然控制了常见的混杂因素（如年龄、性别、吸烟状况、血压、血脂和药物），但其他潜在的混杂因素可能会影响miR-15b-30的表达。例如，饮食习惯、炎症细胞因子（IL-6、IL-1β、CRP和TNF-α）和遗传背景可能会影响miR-15b-30的水平。进一步的研究需要评估这些混杂因素对miR-15b-30表达的影响，分析其与CAS炎症的关联，并相应地调整分析方法。第三，缺乏载脂蛋白B和脂蛋白(a)的数据是一个限制。这些动脉粥样硬化风险因素可能会混淆或影响miR-15b-30的关联。未来的研究应结合这些参数进行脂质风险和miRNA生物标志物的分析。此外，PTEN、ABL1、MECOM、NUFIP2、RC3H1、RUNX1T1、AFF1、CLINT1、FAT1和LARP1是节点度数最高的十个靶基因。虽然本研究重点关注miR-15b-30/PTEN的相互作用，但其他靶基因和信号通路仍待探索。未来的研究需要探讨miR-15b-30在CAS中的功能，以阐明其全面机制。miR-15b-30在VSMCs中特异性上调并得到验证，突显了其在CAS中的关键作用。虽然不能排除miR-155的作用[34]，但未来的研究应进一步探讨miR-15b-30模拟物/抑制剂在CAS中的治疗潜力，评估其可行性和安全性。除了其在发病机制中的作用外，我们的研究还支持将血清miR-15b-30作为液体活检生物标志物。这种无创生物标志物可以通过两个关键作用改变临床管理：作为经济实惠的一线筛查工具来选择高风险患者进行影像学检查，以及作为纵向工具通过连续采样来跟踪疾病和治疗反应。多标志物策略有助于提高诊断准确性。未来的工作应验证miR-15b-30与其他循环miRNA或临床风险因素的组合特征。这种组合特征可以增强CAS的风险分层和个性化管理。

总之，CAS患者中观察到miR-15b-30表达水平升高。miR-15b-30通过靶向PTEN促进HA-VSMC细胞的增殖。尽管本研究将miR-15b-30确定为潜在的CAS诊断标志物，但其价值需要在更大的多中心队列中得到验证。目前的发现为进一步研究miR-15b-30作为CAS诊断生物标志物和治疗靶点提供了重要的理论基础。未来的研究应阐明miR-15b-30在CAS中的功能和临床应用。