MSC-EVs通过miR-21-5p介导的方式抑制EMT和MMT过程，并抑制炎症反应，从而减轻脉络膜新生血管化引起的视网膜下纤维化

《Journal of Neuroinflammation》：MSC-EVs attenuate subretinal fibrosis in choroidal neovascularization through miR-21-5p-mediated inhibition of EMT and MMT and suppression of inflammation

　　

摘要

背景

视网膜下纤维化是新血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）导致不可逆视力丧失的原因。持续的黄斑炎症通过激活促纤维化细胞并持续损伤组织来推动纤维化的发生和发展。本研究探讨了间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（MSC-EVs）在缓解nAMD相关视网膜下纤维化方面的治疗潜力。

方法

MSC-EVs来源于人类骨髓中的间充质干细胞，并通过纳米粒子追踪分析、透射电子显微镜和Western Blotting技术进行了表征。使用两阶段激光诱导模型在C57BL/6J小鼠中诱导视网膜下纤维化。MSC-EVs被分别通过玻璃体内注射（1×10^8个颗粒/眼，单次注射）或眶后注射（1×10^8个颗粒，间隔四天进行两次注射）的方式在第二次激光照射后立即给药。第二次激光照射后10天采集眼睛样本，进行胶原-1和CD31或iso-lectin B4的免疫染色。在体外实验中，原代人RPE细胞和ARPE-19细胞被TGF-β2（10 ng/mL）处理以诱导上皮-间充质转化（EMT）；腹膜巨噬细胞被TGF-β1（10 ng/mL）处理以诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞的转化（MMT）。48小时后，这些细胞与MSC-EVs（细胞与MSC-EV的比例为1:2000）共同培养3天。通过免疫细胞化学和定量PCR（qPCR）检测肌成纤维细胞标志物（αSMA、纤维连接蛋白和胶原-1）。人iPCS来源的巨噬细胞（iMACs）、骨髓来源的巨噬细胞、腹膜巨噬细胞和BV2小胶质细胞被LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）处理24小时，同时或不同时加入MSC-EVs（1:2000）。利用小RNA测序技术鉴定MSC-EVs中的特定功能分子，并通过qPCR评估与免疫相关的基因表达。

结果

玻璃体内和眶后注射MSC-EVs分别使胶原-1+纤维化病变减少了46%和30%，并显著抑制了浸润的Iba-1+细胞。在体外实验中，MSC-EVs减弱了TGF-β2诱导的RPE细胞中αSMA、纤维连接蛋白和胶原-1在蛋白质和mRNA水平的上调。同样，经TGF-β1处理的巨噬细胞中Acta2、Fn1和Col1a1的表达在MSC-EV处理后也显著降低。在LPS+IFN-γ刺激的免疫细胞中，MSC-EVs显著抑制了所有细胞类型中Il6和Il1b的表达，并降低了iMACs、腹膜巨噬细胞和BV2细胞中Inos、Tnfa和Cd86的表达。在MSC-EVs中鉴定出富集的hsa-miR-21-5p，该分子参与了TGF-β相关的信号通路。miR-21-5p的过表达抵消了TGF-β1对RPE和巨噬细胞中促纤维化标志物的上调作用。

结论

局部注射MSC-EVs有效缓解了nAMD小鼠模型中的视网膜下纤维化并减少了炎症，这可能是通过miR-21-5p介导的上皮-间充质转化（EMT）和巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）的抑制以及炎症的减轻实现的。MSC-EVs为nAMD中的黄斑纤维化提供了一种新型的无细胞治疗策略。

背景

视网膜下纤维化是新血管性年龄相关性黄斑变性（nAMD）导致不可逆视力丧失的原因。持续的黄斑炎症通过激活促纤维化细胞并持续损伤组织来推动纤维化的发生和发展。本研究探讨了间充质干细胞衍生的细胞外囊泡（MSC-EVs）在缓解nAMD相关视网膜下纤维化方面的治疗潜力。

方法

MSC-EVs来源于人类骨髓中的间充质干细胞，并通过纳米粒子追踪分析、透射电子显微镜和Western Blotting技术进行了表征。使用两阶段激光诱导模型在C57BL/6J小鼠中诱导视网膜下纤维化。MSC-EVs被分别通过玻璃体内注射（1×10^8个颗粒/眼，单次注射）或眶后注射（1×10^8个颗粒，间隔四天进行两次注射）的方式在第二次激光照射后立即给药。第二次激光照射后10天采集眼睛样本，进行胶原-1和CD31或iso-lectin B4的免疫染色。在体外实验中，原代人RPE细胞和ARPE-19细胞被TGF-β2（10 ng/mL）处理以诱导上皮-间充质转化（EMT）；腹膜巨噬细胞被TGF-β1（10 ng/mL）处理以诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞的转化（MMT）。48小时后，这些细胞与MSC-EVs（细胞与MSC-EV的比例为1:2000）共同培养3天。通过免疫细胞化学和定量PCR（qPCR）检测肌成纤维细胞标志物（αSMA、纤维连接蛋白和胶原-1）。人iPCS来源的巨噬细胞（iMACs）、骨髓来源的巨噬细胞、腹膜巨噬细胞和BV2小胶质细胞被LPS（100 ng/mL）和IFN-γ（20 ng/mL）处理24小时，同时或不同时加入MSC-EVs（1:2000）。利用小RNA测序技术鉴定MSC-EVs中的特定功能分子，并通过qPCR评估与免疫相关的基因表达。

结果

玻璃体内和眶后注射MSC-EVs分别使胶原-1+纤维化病变减少了46%和30%，并显著抑制了浸润的Iba-1+细胞。在体外实验中，MSC-EVs减弱了TGF-β2诱导的RPE细胞中αSMA、纤维连接蛋白和胶原-1在蛋白质和mRNA水平的上调。同样，经TGF-β1处理的巨噬细胞中Acta2、Fn1和Col1a1的表达在MSC-EV处理后也显著降低。在LPS+IFN-γ刺激的免疫细胞中，MSC-EVs显著抑制了所有细胞类型中Il6和Il1b的表达，并降低了iMACs、腹膜巨噬细胞和BV2细胞中Inos、Tnfa和Cd86的表达。在MSC-EVs中鉴定出富集的hsa-miR-21-5p，该分子参与了TGF-β相关的信号通路。miR-21-5p的过表达消除了TGF-β1对RPE和巨噬细胞中促纤维化标志物的上调作用。

结论

局部注射MSC-EVs有效缓解了nAMD小鼠模型中的视网膜下纤维化并减少了炎症，这可能是通过miR-21-5p介导的上皮-间充质转化（EMT）和巨噬细胞向肌成纤维细胞转化（MMT）的抑制以及炎症的减轻实现的。MSC-EVs为nAMD中的黄斑纤维化提供了一种新型的无细胞治疗策略。