赫里福德牛眼鳞状细胞癌（BOSCC）的转录组分析

《Veterinary Oncology》：Transcriptome analysis of bovine ocular squamous cell carcinoma (BOSCC) in Hereford cattle

　　摘要

背景
牛眼鳞状细胞癌（BOSCC）是赫里福德牛中常见的一种上皮肿瘤，尤其影响那些眼部无色素区域的牛。鉴于其遗传易感性，这项探索性研究旨在识别与BOSCC发展相关的基因和通路。

方法
从五头纯种赫里福德牛中获取了眼部肿瘤样本，并从三头健康动物中获取了对照样本。进行了组织病理学分析和全转录组测序。使用Gene Ontology和KEGG对改变的通路进行了分析。

结果
组织病理学分析确认了BOSCC的特征，如角蛋白珠、淋巴细胞浸润以及有丝分裂和血管生成的增加。转录组测序发现，与健康对照组相比，肿瘤组织中有836个基因表达下调，845个基因表达上调。上调的关键基因包括TRPV3、KRT6A、KLK6、MMP13、PROKR2、IL31RA、DHRS9和MMP9，这些基因都与角质形成细胞增殖、肿瘤进展、侵袭和转移有关。下调的基因如GPHA2、TNN、EMILIN3、BGLAP、TGFB1、MATN4、CHAD和CLEC3A参与维持角膜缘干细胞、细胞黏附和肿瘤抑制。

结论
这些发现为BOSCC的遗传基础提供了重要见解，揭示了免疫反应的改变、癌症中的转录失调以及与肿瘤发展相关的病毒蛋白相互作用。这些初步结果可以指导未来的基因组研究，有助于开发选择性育种计划，以降低赫里福德牛的疾病易感性。

引言
牛眼鳞状细胞癌（BOSCC）是影响牛生活质量的一种常见肿瘤[1]。它是眼睛中的主要上皮肿瘤，发生在眼部和眼周组织，包括结膜、角膜巩膜交界处、瞬膜、角膜、眼睑皮肤等[2]。BOSCC可以由现有的病变（如乳头瘤）发展而来，或者作为侵袭性肿瘤独立出现。这种肿瘤能够通过淋巴结扩散到眼骨和其他相邻结构[3]。多种因素参与了这种肿瘤的发展，如遗传易感性、缺乏眼部色素、紫外线辐射（UV）、病毒感染、饮食和动物的年龄[4]。紫外线辐射通过导致DNA损伤、减弱免疫反应和产生活性氧物种来影响上皮层，从而导致细胞损伤和氧化应激[5]。由于黑色素在表皮中对紫外线具有光保护作用[6]，BOSCC主要影响眼部无色素区域的动物。这种肿瘤在多个品种中都有发现，但在赫里福德牛及其杂交品种中更为常见，因为这些动物由于品种标准而表现出遗传选择的面部色素减退。与此相关的是，遗传易感性是促进牛肿瘤发展的另一个重要因素，大约30%的病例具有遗传原因[4]。鉴于遗传易感性作为影响因素的重要性，了解参与BOSCC发展的基因至关重要。在这项研究中，我们通过RNA-seq进行全转录组测序，分析了肿瘤组织和健康眼组织之间的差异基因表达，以识别可能参与该疾病发展的候选基因。RNA-seq是一种非常强大的工具，广泛用于癌症研究，允许分析差异基因表达以识别肿瘤水平的生物标志物[7]。据我们所知，之前尚未有关于BOSCC基因表达谱的研究。

材料与方法
样本收集
由合格的兽医在野外手术中从五头成年纯种赫里福德牛的眼部区域收集了肿瘤样本，遵循乌拉圭兽医学院的动物福利协议。为了对照目的，从屠宰场获取了三头同品种且眼部无色素区域的健康动物的正常角膜组织（n=3）。组织被切成5毫米的小块，并浸入Trizol试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，美国）。每个样本被分成两个子样本，分别用于组织病理学分析和转录组测序。样本在冷藏容器中运输。

组织病理学处理
对于组织病理学分析，样本首先用甲醛固定，然后通过乙醇系列（70%、95%和100%）脱水，浸入氯仿中，最后嵌入蜡中。获得5微米厚的切片，并用Hematoxylin-Eosin染色。

病理特征和组织病理学图像分析
使用MoticEasyOne扫描仪将组织切片数字化，并用Motic DSAssistant软件进行图像分析。根据先前的描述[3, 8]和肿瘤的宏观位置（角膜、巩膜、眼睑组织、上眼睑或下眼睑及第三眼睑），对牛眼鳞状细胞癌进行了组织病理学分类。还分析了组织侵袭情况，包括远离主肿瘤的深层侵袭、围绕主肿瘤的小独立岛状结构或周围组织的最小侵袭迹象。此外，显微镜下的分化程度分为三个等级：高度分化，特征为大的角蛋白珠、明显的肿瘤岛和明显的鳞状分化；中度分化，表现为小到中等大小的角蛋白珠和岛状结构以及鳞状分化；以及低度分化，表现为单个细胞的角蛋白化、少量的小肿瘤岛和较差的细胞分化。还分析了有丝分裂指数，包括每个高倍视野中有六个以上有丝分裂象、两到六个有丝分裂象以及零到两个有丝分裂象。最后，还分析并描述了眼睑的色素沉着或脱色特征、淋巴细胞浸润、血管生成和纤维化。

分子分析
肿瘤组织和正常眼组织保存在Trizol中，并储存在-80°C的冷冻柜中直至处理。每侧5毫米的组织样本通过干冰运送到BGI（加利福尼亚[9]，进行RNA提取和测序。使用DNBSEQ真核链特异性mRNA文库生成文库。RNA测序使用150 bp配对末端读取进行，所有样本在同一条泳道上测序，每个样本至少产生4500万个读取。测序后，通过去除接头序列、污染物和低质量读取来过滤原始读取。

生物信息学分析
使用FastQC（v 0.11.9）[10]分析序列质量[10]。从Santa Cruz Genome Browser数据库[11, 12]获取了Bos taurus参考基因组ARS-UCD1（UCSC bosTau9）。使用HISAT2（v 2.2.1）[13]将序列与参考基因组对齐。使用SAMtools（v 1.17）[14]进行对齐分析，随后使用Picard（v 3.0）[15]进行后续处理。使用MultiQC[16]编译QC摘要和文库组成。使用HTSeq-count（v 2.0.4）[17]进行读取计数。后续分析在R（v 4.4.0）[18]和RStudio（v 2021.09.0）[19]中进行。使用EdgeR（v 4.2.0）[20]进行差异基因表达分析。为了将基因纳入差异表达分析，序列在至少六分之一的样本中的表达水平（以百万计的计数CPM为单位）必须达到最低要求（样本截止值为1/6）。选择假发现率（FDR）< 0.05且|log2FC| > 1的基因作为差异表达基因。我们进行了精确条件检验（精确二项检验的推广）来比较两组独立样本。使用的归一化方法是TMM。

结果
首先通过检查和组织病理学确认了BOSCC的诊断，并表征了肿瘤级别、侵袭模式和基质变化。80%的肿瘤上眼睑完全脱色，下眼睑轻度脱色，20%的肿瘤双眼均完全脱色。肿瘤位于前角膜和巩膜区域。80%的肿瘤影响了瞬膜，60%的肿瘤涉及眼睑和第三眼睑。根据分化程度，40%的肿瘤为低度分化，60%为高度分化。所有样本都表现出淋巴细胞浸润，在某些情况下既在角蛋白珠内也在其外，伴有有丝分裂、血管生成增加和纤维化。此外，我们还检测到40%的样本在肿瘤过程中不同位置有黑色素细胞，存在于多形性细胞和角化不良中（图1）。

图1
赫里福德牛眼鳞状肿瘤（BOSCC）的代表性组织病理学图像。a：角蛋白珠，观察到角膜上皮紊乱。b：后角膜上皮和角膜基质中的黑色素细胞浸润。c：血管生成增加。d-e：细胞分裂。f：显示内部淋巴细胞浸润的角蛋白珠。g-h：角蛋白珠和血管。

测序结果
为了表征与BOSCC相关的全基因组转录变化，我们按照材料与方法部分中的详细说明对肿瘤组织和正常眼组织进行了RNA-seq。FastQC显示，每个样本的测序产生了4500万到4800万个读取，读取长度和碱基质量得分（中位数Phred ≥ 35）符合预期。MultiQC显示，平均84.7%的序列对应于mRNA，0%对应于rRNA。平均53.6%的读取映射到编码区域，28%映射到UTR，7.5%映射到内含子，7.2%映射到基因间区域，3.8%未对齐，0%映射到核糖体基因。根据这些结果，使用上述FDR和log2FC值的标准搜索了差异表达基因（DEGs）。与正常组织相比，肿瘤组织中有836个基因表达下调，845个基因表达上调，15621个基因的表达水平没有显著差异。在对照动物中，观察到与角膜上皮相关的基因高表达，如ALDH3A1、KRT12、KRT3和CLU。这种模式与之前的人类角膜基因表达分析相似[24]。在差异表达基因中，FDR值最高的基因在BOSCC样本中上调，包括TRPV3、CXCL8、M-SAA3、KRT6A、KLK6、MMP13、PROKR2、IL31RA、DHRS9和MMP9，log2FC值在6到11之间。在同一样本中下调的基因包括GPHA2、FAM180B、TNN、FAM240A、EMILIN3、BGLAP、TGFB1、MATN4、CHAD和CLEC3A，log2FC值在-12到-6之间（表1）。火山图显示了最显著差异表达基因的表达水平（图2）。使用热图[25]显示了不同样本之间的表达模式，观察到肿瘤组织中高表达的基因在正常组织中表达较低，反之亦然（图3）。

表1
按FDR值排序的主要DEGs及其log2FC和p值

图2
增强型火山图显示FDR值< 0.05的主要差异表达基因。Y轴：-Log10(FDR)，X轴：Log2倍数变化。正的Log2FC值对应于肿瘤中上调的基因，负值对应于下调的基因。红色点表示最相关的基因，这些基因满足统计显著性标准并表现出最大的表达变化幅度。绿色点表示也具有统计显著性但表达变化幅度较小的基因。

图3
1681个差异表达基因（FDR < 0.05，|log2FC| > 1）在肿瘤和正常样本中的热图。正的Z分数用粉色表示（上调），而负的Z分数用蓝色表示（下调）。X轴：样本。1–5：BOSCC，6–8：正常组织。Y轴：差异表达基因。

**通路分析**
基因本体论（GO）分析显示，在生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）领域中存在多个改变的通路，其中以下通路具有最高的统计显著性。在生物过程（BP）类别中，改变涉及与免疫反应、生物体防御和细胞通讯相关的通路。具体来说，改变的通路包括对其他生物体的反应（GO:0051707）、对生物刺激的反应（GO:0009607, GO:0043207, GO:0009617）以及种间相互作用（GO:0044419）。在免疫细胞的激活和调节的核心过程中也发现了改变，包括细胞激活（GO:0001775）及其调节（GO:0050865）、白细胞激活（GO:0045321）及其调节（GO:0002694）、淋巴细胞激活（GO:0046649）及其调节（GO:0051249），以及细胞粘附过程（GO:0007155）。在分子功能（MF）类别的分析中，发现了免疫信号传导的改变。检测到了趋化因子活性（GO:0008009）和细胞因子活性（GO:0005125）。关键的受体结合活性包括受体配体活性（GO:0048018）、细胞因子受体活性（GO:0004896）和免疫受体活性（GO:0040375）。特定的相互作用包括细胞因子受体结合（GO:0005126）、趋化因子受体结合（GO:0042379）和CCR趋化因子受体结合（GO:0048020）。还识别出了信号调节功能，如信号受体激活剂活性（GO:0030546）和信号受体调节剂活性（GO:0030545）。此外，抗原呈递过程也发生了改变：MHC蛋白复合体结合（GO:0023023）和MHC II类蛋白复合体结合（GO:0023026）。

在细胞组分（CC）层面，与细胞表面和细胞外环境相关的结构发生了改变，观察到的具体位置包括细胞表面（GO:0009986）、质膜外侧（GO:0009897）和膜的一侧（GO:0098552）。细胞外成分包括细胞外基质（GO:0031012）和外部包膜结构（GO:0030312）。关于大分子结构，MHC蛋白复合体（GO:0042611）和MHC II类蛋白复合体（GO:0042613）发生了改变，以及各种超分子成分：超分子聚合物（GO:0099081）、超分子纤维（GO:0099512）和超分子复合体（GO:0099080）。最后，还识别出了细胞骨架和收缩结构，如聚合物细胞骨架纤维（GO:0099513）和肌节（GO:0030017）（表2）。UpSet图[26]总结了富集的BP、MF和CC术语之间的交集（图4）。

**表2** 与改变的生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）相关的基因本体论通路。该表显示了每个类别中最重要的12个富集GO术语，按假发现率（FDR）排序。对于每个术语，显示了GO术语ID、每个通路中的基因数量和FDR值。

**图4**
UpSet图显示了生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）的主要富集方式中基因的交集。上方的条形图（交集大小）显示了矩阵中指示的GO术语组合共有的基因数量。粉色的实心圆表示该GO术语存在于该列的交集中。

与这些受影响的通路结果一致，KEGG通路富集突出了细胞因子-细胞因子受体相互作用（bta04060）、病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用（bta04061）以及癌症中的转录失调（bta05202）。使用pathview包[27]将这些差异表达基因（DEGs）映射到这些通路上，结果显示在bta04060中，67个基因上调，5个基因下调；在bta04061中，所有31个基因均上调；在bta05202中，33个基因中有29个上调（表3）。

**表3** 涉及差异表达基因的KEGG通路。该表显示了KEGG代码、通路中的基因数量和q值。

**讨论**
据我们所知，这是首次对BOSCC进行的转录组分析。所有病例的病理学特征都与BOSCC一致，表现为通常不角化的角膜表面上皮中出现明显的角蛋白珠和异常角蛋白积累，伴有淋巴细胞浸润、有丝分裂活动增加和基质重塑。由于角膜上皮是分层的但不角化的，广泛的角蛋白化反映了肿瘤细胞的鳞状分化，而不是正常的角膜细胞生物学特性。在兽医和人类病理学中曾报道过色素性鳞状细胞癌（SCC）的变体，有时其中混有树突状黑色素细胞；我们部分病例中的黑色素细胞成分与这些描述相符[28, 29]。鉴于肿瘤样本中高度未分化的组织，我们的基因表达结果可能主要反映了角膜上皮（正常样本）与起源肿瘤组织之间的差异。然而，由于病变主要发生在角膜，这些差异确实反映了正常状态与肿瘤状态之间的区别。

**角蛋白化和鳞状分化**
转录组信号表明角蛋白化和鳞状分化是主要主题。我们观察到KRT6A的表达增加，这是一种对鳞状分化和上皮再生的应激反应性角蛋白，这与SCC中描述的高增殖程序一致[30,31,32]。调节上皮细胞生长/迁移的丝氨酸蛋白酶KLK6也升高[33,34,35]。TRPV3是一种典型的分层鳞状上皮钙通道，其表达上调；尽管通常在表皮角质形成细胞中讨论，但在这里它可能标志着肿瘤细胞采用了角化上皮程序[36,37,38]。

**肿瘤微环境、炎症和免疫反应**
我们注意到一个一致的炎症特征，表明存在肿瘤相关的免疫环境。GO/KEGG富集突出了白细胞激活和迁移、细胞因子产生以及细胞因子-细胞因子受体相互作用。与此一致的是，CXCL8/IL-8上调，这与促肿瘤生成作用、血管生成和MMP激活以及在角膜上皮中UV诱导的IL-8产生一致[39,40,41]。IL31RA也升高，这与IL-31/IL31RA信号可以促进肿瘤进展和转移的报告相符[42, 43]。SAA3是一种在角膜表面表达的急性期反应物，也升高，这与炎症、组织重塑和角膜新生血管形成一致[44,45,46]。关于KEGG术语“病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体相互作用”，这些信号可能反映了免疫激活的增强，而不是病毒引起的直接证据，并表明肿瘤微环境中存在强烈的细胞因子介导的炎症反应。尽管如此，有报道称乳头瘤病毒可以与UV共同作用导致非黑色素瘤皮肤癌[47]，这值得进一步研究。我们还观察到了其他依赖于背景且特征不明显的信号，需要进一步研究。TGFB1的表达降低，符合其在早期作为肿瘤抑制因子、在晚期具有促肿瘤生成作用的特点[48,49,50]。DHRS9被报道为对UV有反应，并在各种癌症中表达不一，其升高可能反映了角膜表面的UV相关应激[51,52,53]。PROKR2是一种参与迁移/侵袭信号的GPCR，在这里上调，值得进行功能测试[54, 55]。在下调的、特征不明显的转录本中，FAM180B在几种癌症中表达降低，可能影响分化[56,57,58]，而FAM240B的注释较少，可能是BOSCC相关的新候选基因。

**细胞外基质重塑和侵袭**
显著的细胞外基质重塑表明了侵袭行为。细胞外基质中胶原含量的富集与MMP9和MMP13的强烈上调相平行，这两种蛋白是促进侵袭和血管生成的经典介质[59,60,61,62]。相反，粘附/基质调节因子CHAD、EMILIN3、MATN4、TNN和CLEC3A的表达降低，这与侵袭中的粘附和基质结构改变一致[63,64,65,66,67,68]。值得注意的是，BGLAP/骨钙素在这里表达降低，而在一些非眼部癌症中则表达升高，这表明其具有组织特异性作用[69, 70]。与角膜和角膜缘稳态相关的信号也很明显。角膜缘干细胞标记物GPHA2下调，这与角膜表面稳态的紊乱一致，也有报告指出增殖/分化会降低GPHA2的表达[71, 72]。此外，文献将角膜损伤反应与IL-1α和MMP诱导联系起来；我们的样本显示IL-1α和多种MMPs表达增加，强化了修复样但可能有利于肿瘤的状态[73]。

**局限性**
与任何研究一样，有几个局限性需要提及：样本量较小、解剖异质性以及批量RNA-seq缺乏细胞类型分辨率，这可能会模糊上皮与基质/免疫的贡献。因此，这些发现是初步的，需要在更大的独立队列中验证。未来的工作应通过免疫组化或免疫荧光验证关键蛋白质，原位定位表达，结合细胞状态反卷积或单细胞方法，并筛查病毒序列。跨病变阶段的纵向采样以及跨品种/色素表型的比较将有助于确定因果关系和普遍性。总体而言，BOSCC表现出协调的肿瘤相关炎症、上皮角蛋白化/鳞状分化以及ECM重塑和角膜缘稳态的破坏——为兽医肿瘤学和角膜表面研究提供了机制框架和一组有针对性的基因和通路。

**结论**
本研究提供了对Hereford牛眼鳞状细胞癌的初步全转录组分析。据我们所知，这是首次探索BOSCC的全局表达谱的研究。样本是在野外工作中收集的，反映了兽医在日常工作中遇到的病理病例。获得的信息可以作为未来对该疾病进行基因组研究的基础，并且从长远来看，有助于开发用于选择不易感动物的分子测试。肿瘤样本表现出典型的BOSCC病理学特征，包括角蛋白珠、淋巴细胞浸润、有丝分裂增加和血管生成。考虑到样本量较小的限制，我们的差异基因表达分析识别出几个在肿瘤发展中起作用的过表达和低表达基因。通路分析揭示了与免疫反应、转录失调和病毒蛋白相互作用相关的生物过程改变，这与肿瘤过程一致。这些发现为BOSCC的遗传基础提供了初步见解，并可作为未来旨在开发选择性育种计划以减轻Hereford牛这种疾病的基因组研究的基础资源。