解淀粉芽孢杆菌通过ssc-miR-10390调控氧化损伤，其作用靶点是仔猪肠道中的WT1基因

《Animal Microbiome》：Bacillus amyloliquefaciens regulates oxidative damage through ssc-miR-10390 by targeting WT1 in the intestine of piglets

　　摘要
早期断奶或肠道病原体暴露常会导致仔猪肠道上皮细胞氧化应激，从而破坏氧化还原平衡，损害紧密连接完整性，并最终削弱肠道屏障功能。据报道，解淀粉芽孢杆菌SC06（SC06）能够调节仔猪的氧化应激和肠道屏障功能，但miRNA在这些过程中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨SC06对miRNA谱的影响及其潜在的作用机制。共有32只断奶仔猪或IPEC-J2细胞被分为四组，采用2×2因子设计（分别接受或不接受SC06处理，以及是否同时接受敌草快（DQ）处理）。结果显示，敌草快增加了MDA含量，降低了抗氧化酶的活性，并损害了肠道和IPEC-J2细胞的屏障功能。SC06增强了抗氧化能力和屏障功能，同时调节了miRNA谱，例如在仔猪和IPEC-J2细胞中的ssc-miR-10390。进一步研究证实了ssc-miR-10390在缓解空肠氧化损伤中的作用。通过使用ssc-miR-10390模拟物、抑制剂和siRNA，我们发现ssc-miR-10390可以通过靶向WT1来增强抗氧化功能和紧密连接，并减轻IPEC-J2细胞的炎症。总之，ssc-miR-10390-WT1通路在SC06介导的仔猪空肠黏膜氧化损伤缓解中起着重要作用。

引言
在仔猪生产过程中，断奶、饲料污染和高密度饲养等压力因素可能导致肠道氧化应激。由于肠道在消化、营养吸收、消化酶分泌和免疫方面起着重要作用，氧化损伤会降低饲料利用率，增加菌群失调和腹泻的发生率，最终导致生长迟缓[1]。物理屏障、化学屏障、免疫屏障和微生物屏障共同构成了肠道屏障的整体功能。关于物理屏障，氧化应激会导致紧密连接蛋白解聚，使大分子物质（如细菌和毒素）从肠腔进入黏膜下组织，最终进入全身循环[2]。此外，氧化应激会降低MUC1和MUC2基因的表达，从而损害黏膜屏障功能[3]。过量ROS还会减少肠道免疫因子（如B淋巴细胞免疫球蛋白和黏膜表面分泌型免疫球蛋白A）的分泌[4]。氧化应激还与仔猪的微生物屏障密切相关[5]。在氧化应激状态下，变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门的致病菌数量显著增加，而拟杆菌门的数量减少，导致微生物多样性显著下降[6]。因此，肠道微生物群、免疫系统和上皮屏障功能之间的动态相互作用对健康至关重要。在稳态下，紧密连接蛋白的表达、黏液层的形成和调节性T细胞的分化共同维持免疫耐受性。然而，在生态失衡状态下，潜在病原体及其产物占主导地位，引发过度炎症信号，导致屏障功能障碍和慢性炎症[2,3,4,5,6]。

微小RNA（miRNA）是长度约为20至24个核苷酸的内源性小非编码RNA片段，通过碱基互补配对识别靶基因，降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译，从而影响蛋白质表达。多项研究表明，miRNA可以通过结合与氧化应激或抗氧化相关的基因来调节细胞的氧化还原状态[7]。Xie等人[8]发现，ssc-miR-183通过靶向纤维连接蛋白1基因表达，缓解了断奶仔猪海马神经元中的脂多糖（LPS）诱导的氧化应激。Zhang等人[9]表明，ssc-miR-192可减轻猪颗粒细胞的氧化损伤。ssc-miR-132可以结合与氧化应激相关的基因，如叉头框O3（FOXO3）[10]。最近的研究建立了益生菌与宿主miRNA调节之间的联系，后者又调节肠道屏障功能和免疫力。例如，大肠杆菌与T84上皮细胞的共培养改变了多种miRNA（如hsa-miR-203）的表达，促进了紧密连接蛋白的表达[11]。同样，双歧杆菌和布尔氏酵母通过调节参与屏障完整性和免疫细胞功能的miRNA，减轻了啮齿动物模型中的肠道损伤[12, 13]。在仔猪中，补充布尔氏酵母被证明可以影响ssc-miR-423-5p的表达，从而影响免疫细胞增殖[14]。总体而言，这些发现突显了miRNA作为益生菌作用的关键介质的作用。然而，解淀粉芽孢杆菌SC06通过何种特定的miRNA机制改善猪的肠道健康仍需进一步研究。先前的研究表明，SC06可以通过改善肠道形态、紧密连接功能及肠道微生物多样性来提高仔猪的肠道完整性[15]。SC06还通过提高消化和吸收酶的活性、增强肠道抗氧化能力、自噬和免疫功能来促进仔猪的生长性能[16, 17]。然而，SC06是否通过miRNA来缓解仔猪的氧化应激仍不清楚。

敌草快（DQ）通过干扰循环还原-氧化反应发挥作用。敌草快产生的自由基和有氧氧化会导致超氧阴离子的产生和氧化损伤[18]。近年来，10 mg/kg的敌草快被用于建立断奶仔猪的肠道氧化应激模型[19,20,21]。因此，在本研究中，使用敌草快诱导的氧化应激仔猪和猪肠道上皮细胞（IPEC-J2细胞），研究了SC06对肠道氧化损伤和miRNA表达的影响，并确定了SC06介导的miRNA信号通路的作用。

结果
SC06降低了敌草快处理仔猪的空肠氧化应激
敌草快注射增加了MDA和ROS的含量（P < 0.01），并降低了CAT、SOD和GSH-Px的活性（P < 0.01）。SC06补充剂降低了MDA和ROS的含量（P < 0.01），并提高了CAT（P = 0.02）、SOD（P < 0.01）和GSH-Px（P < 0.01）的活性。此外，在敌草快处理的仔猪中，MDA（P < 0.01）、ROS（P = 0.04）、SOD（P < 0.01）和GSH-Px（P < 0.01）的变化被SC06和敌草快的联合使用所逆转（图1）。

图1
SC06对仔猪空肠氧化应激的影响。a、b、c：同一行中无相同上标的平均值具有显著差异（P < 0.05）。Con组：基础日粮；DQ组：基础日粮并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快；SC06组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06；SC06+DQ组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快。

SC06改善了敌草快处理仔猪的空肠形态
HE染色结果显示，敌草快注射降低了绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C）（P < 0.01）。SC06提高了绒毛高度（P < 0.01）和V/C（P = 0.04）。此外，SC06+DQ组合进一步提高了敌草快处理仔猪的绒毛高度（P < 0.01）（图2a）。TEM分析显示，Con组、SC06组和SC06+DQ组的紧密连接清晰完整，而DQ组的紧密连接不清晰且肿胀（图2b）。

图2
SC06对氧化应激仔猪空肠形态的影响。（a）HE染色，图像在50倍放大下拍摄；（b）TEM，图像在15k倍放大下拍摄。a、b：同一行中无相同上标的平均值具有显著差异（P < 0.05）。红色箭头表示清晰完整的紧密连接；蓝色箭头表示不清晰、肿胀的紧密连接。Con组：基础日粮；DQ组：基础日粮并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快；SC06组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06；SC06+DQ组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快。

SC06改善了敌草快处理仔猪的空肠物理、化学和免疫屏障功能
对于物理屏障功能，敌草快降低了ZO-1、Claudin和Occludin基因的表达（P < 0.01）。SC06提高了ZO-1、Claudin和Occludin基因的表达（P < 0.01）。SC06+DQ组合进一步提高了敌草快处理仔猪的ZO-1（P < 0.01）、Claudin（P = 0.01）和Occludin（P < 0.01）基因的表达（图3a）。对于化学屏障功能，敌草快降低了MUC1和MUC2基因的表达（P < 0.01）。SC06提高了MUC1和MUC2基因的表达（P < 0.01）。SC06+DQ组合进一步提高了敌草快处理仔猪的MUC2基因表达（P < 0.01）（图3b）。对于免疫屏障功能，敌草快降低了IL-10和sIgA的含量及IL-10基因的表达（P < 0.01），并提高了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量及基因表达（P < 0.01）。SC06处理产生了相反的结果（P < 0.01）。SC06+DQ组合降低了IL-6（P < 0.01）、IFN-γ（P < 0.01）、IL-1β（P = 0.04）的含量，并降低了IL-6（P < 0.01）和IFN-γ（P < 0.01）的基因表达（图3c-d）。

图3
SC06对断奶仔猪肠道黏膜屏障的影响。（a）紧密连接基因表达；（b）黏蛋白基因表达；（c）免疫因子基因表达；（d）免疫因子含量。a、b、c：同一行中无相同上标的平均值具有显著差异（P < 0.05）。Con组：基础日粮；DQ组：基础日粮并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快；SC06组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06；SC06+DQ组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快。

SC06改善了敌草快处理仔猪的空肠微生物屏障功能
各组之间的α多样性和β多样性无显著差异（P > 0.05）（图4）。然而，在门水平上，与Con组相比，DQ组中衣原体属的丰度增加（P = 0.04）。在前20个丰富菌科中，与Con组相比，Peptostreptococcaceae（P = 0.02）和Ruminococcaceae（P = 0.04）在SC06组中的丰度降低。与DQ组相比，Corynebacteriaceae（P = 0.03）和Ruminococcaceae（P = 0.04）在SC06+DQ组中的丰度降低。在前20个丰富属中，与Con组相比，Clostridium（P < 0.01）在SC06组中的丰度降低。与DQ组相比，SMB53（P = 0.03）在SC06+DQ组中的丰度降低（表1、2和3；图5）。

图4
SC06对氧化应激仔猪空肠黏膜微生物多样性的影响。（a）α多样性；（b）β多样性。Con组：基础日粮；DQ组：基础日粮并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快；SC06组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06；SC06+DQ组：基础日粮中含有1×10^8 cfu/g的SC06并腹腔注射10 mg/kg体重的敌草快。

表1 SC06组和Con组之间细菌丰度的显著差异
表2 DQ组和Con组之间细菌丰度的显著差异
表3 SC06+DQ组和DQ组之间细菌丰度的显著差异

图5
SC06对氧化应激仔猪空肠黏膜微生物群在门、科和属水平上的丰度影响（前20个）。对照组（Con group）：基础日粮；DQ组：基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射；SC06组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮；SC06+DQ组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射。

不同细菌的功能分析
通过PICRUSt分析研究了肠道微生物群的潜在功能，并基于KEGG对其进行分类预测。与对照组相比，四环素生物合成、溶酶体和视黄醇代谢在DQ组中表达较低（P<0.05），而花生四烯酸代谢和其他类型的O-糖苷生物合成在DQ组中表达较高（P<0.05）。与对照组相比，致病性大肠杆菌感染、吲哚生物碱生物合成和类固醇生物合成在DQ组中表达较低（P<0.05），而肾素-血管紧张素系统和剪接体在SC06组中表达较高（P<0.001）。此外，与DQ组相比，ECM-受体相互作用在SC06+DQ组中表达较低（P<0.05），而视黄醇代谢在SC06+DQ组中表达较高（图6）。

SC06对氧化应激仔猪空肠黏膜中差异细菌KEGG富集的影响
对照组（Con group）：基础日粮；DQ组：基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射；SC06组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮；SC06+DQ组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射。

SC06对DQ处理仔猪空肠miRNA表达的影响
维恩图显示，所有4组中有一个共同的miRNA，Con组和SC06组中有12个共同的miRNA，Con组和DQ组中有21个共同的miRNA，DQ组和SC06+DQ组中有15个共同的miRNA（图7a）。在差异表达的miRNA（DEmiRNA）中，DQ处理上调了ssc-miR-10390（P<0.01）和ssc-miR-138（P<0.01）的表达，同时降低了ssc-miR-4331-5p的表达（P=0.02）。与对照组相比，SC06补充剂降低了ssc-miR-10384的表达（P<0.01），并提高了ssc-miR-7-5p（P<0.01）和ssc-miR-138（P=0.03）的表达。此外，与DQ组相比，SC06+DQ处理降低了ssc-miR-10390和ssc-miR-2483的表达（P<0.01）（表4、5和6；图7b）。

SC06对氧化应激仔猪空肠黏膜miRNA谱的影响
（a）组间维恩图；（b）Con组与DQ组、Con组与SC06组、DQ组与SC06+DQ组之间的差异表达miRNA。对照组（Con group）：基础日粮；DQ组：基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射；SC06组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮；SC06+DQ组：含有1×10^8 cfu/g SC06的基础日粮加上每公斤体重10毫克DQ的腹腔注射。

根据KEGG数据，mTOR和MAPK信号通路在DQ组和对照组之间表达最丰富。MAPK和Ras信号通路在SC06组和对照组之间表达最丰富。此外，Wnt、mTOR和ErbB信号通路在SC06+DQ组和DQ组之间表达最丰富（图8）。

SC06通过ssc-miR-10390减轻了DQ处理IPEC-J2细胞的空肠黏膜氧化损伤
图9a显示，DQ增加了MDA的含量（P<0.01），并降低了CAT、SOD和GSH-Px的活性（P<0.01）。SC06补充剂降低了MDA的含量（P<0.01），并提高了CAT（P=0.01）、SOD（P<0.01）和GSH-Px（P<0.01）的活性。此外，SC06×DQ降低了MDA的含量（P=0.02），并提高了SOD（P<0.01）和GSH-Px（P=0.04）的活性。SC06还显著增加了ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）。SC06×DQ进一步增加了DQ处理IPEC-J2细胞中ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）（图9b）。此外，DQ注射上调了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01），并降低了IL-10的基因表达（P<0.01）。SC06诱导了相反的结果（P<0.01）。SC06×DQ增加了IL-10的基因表达，并降低了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01）（图9c）。SC06还降低了ssc-miR-10390的表达（P<0.01）。SC06×DQ进一步降低了DQ处理IPEC-J2细胞中ssc-miR-10390的表达（P<0.01）（图9d）。

SC06通过ssc-miR-10390减轻了IPEC-J2细胞的氧化损伤
（a）氧化应激；（b）紧密连接基因表达；（c）免疫因子基因表达；（d）ssc-miR-10390的表达。a、b、c：同一行中无相同上标的平均值有显著差异（P<0.05）。对照组（Con group）：基础培养基；DQ组：基础培养基加上950 μmol/mL DQ；SC06组：含有1×10^8 cfu/mL SC06的基础培养基；SC06+DQ组：含有1×10^8 cfu/mL SC06的基础培养基加上950 μmol/mL DQ。

SC06通过ssc-miR-10390缓解了IPEC-J2细胞的氧化损伤
与对照组相比，ssc-miR-10390-NC模拟组（NC）或ssc-miR-10390-NC抑制剂组（NC inhibitor）中ssc-miR-10390的表达没有显著变化（P>0.05）。与NC组相比，ssc-miR-10390模拟组（mimic）中ssc-miR-10390的表达增加（P<0.01）。与NC抑制剂组相比，ssc-miR-10390抑制剂组（inhibitor）中ssc-miR-10390的表达降低（P<0.01）（图S1）。

随后进一步分析了ssc-miR-10390在IPEC-J2细胞中的氧化应激、生理屏障功能和炎症中的作用。对于DQ和SC06处理引起的氧化应激，ssc-miR-10390模拟物的转染增加了MDA的含量（P<0.01），并降低了SOD、CAT和GSH-Px的活性（P<0.01）。ssc-miR-10390抑制剂的转染提高了SOD、GSH-Px和CAT的活性（P<0.01），并降低了MDA的含量（P<0.01）（图10a）。对于DQ和SC06处理引起的生理屏障功能，ssc-miR-10390模拟物的转染降低了ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）。ssc-miR-10390抑制剂的转染提高了ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）（图10b）。对于DQ和SC06处理引起的炎症因子，ssc-miR-10390模拟物的转染增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01），并降低了IL-10的基因表达（P<0.01）。ssc-miR-10390抑制剂的转染提高了IL-10的基因表达（P<0.01），并降低了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01）（图10c）。

SC06通过WT1缓解了IPEC-J2细胞的氧化损伤
如图S2所示，si-WT1-1099的转染具有最佳的干扰效果，并显著降低了WT1的表达水平（P<0.01）。因此，在后续实验中使用了si-WT1-1099。对于DQ和SC06处理引起的氧化应激，si-WT1的转染增加了MDA的含量（P<0.01），并降低了SOD、GSH-Px和CAT的活性（P<0.01）。与si-WT1的转染相比，si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染降低了MDA的含量（P<0.01），并提高了SOD和CAT的活性（P<0.01）（图12a）。对于DQ和SC06处理引起的生理屏障功能，si-WT1的转染降低了ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）。与si-WT1的转染相比，si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染提高了Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01），并降低了ZO-1的基因表达（P<0.01）（图12b）。对于DQ和SC06处理引起的炎症，si-WT1的转染增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01），并降低了IL-10的基因表达（P<0.01）。si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染提高了IL-10的基因表达（P<0.01），并降低了IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达（P<0.01）（图12c）。

预测和验证ssc-miR-10390的目标基因
miRanda数据库预测WT1是ssc-miR-10390的目标基因（表S4）。因此，进行了双荧光素酶报告基因测定来验证目标基因。根据图11，与野生型转染NC相比，ssc-miR-10390模拟物的转染降低了萤火虫荧光素与renilla荧光素的比率（P<0.01）。与突变型转染NC相比，ssc-miR-10390模拟物的转染降低了萤火虫荧光素与renilla荧光素的比率（P<0.01）（图11）。

双荧光素酶报告基因测定
WT+NC组：野生型转染和ssc-miR-NC模拟物（NC）的转染；WT+mimic组：野生型转染和ssc-miR-10390模拟物（mimic）的转染；MUT+NC组：突变型转染和NC的转染；MUT+mimic组：突变型转染和mimic的转染。

SC06通过WT1缓解了IPEC-J2细胞的氧化损伤
如图S2所示，si-WT1-1099的转染具有最佳的干扰效果，并显著降低了WT1的表达水平（P<0.01）。因此，在后续实验中使用了si-WT1-1099。对于DQ和SC06处理引起的氧化应激，si-WT1的转染增加了MDA的含量（P<0.01），并降低了SOD、GSH-Px和CAT的活性（P<0.01）。与si-WT1的转染相比，si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染降低了MDA的含量（P<0.01），并提高了SOD和CAT的活性（P<0.01）（图12a）。对于DQ和SC06处理引起的生理屏障功能，si-WT1的转染降低了ZO-1、Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01）。与si-WT1的转染相比，si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染提高了Claudin和Occludin的基因表达（P<0.01），并降低了ZO-1的基因表达（P<0.01）（图12b）。对于DQ和SC06处理引起的炎症，si-WT1的转染增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达（P<0.01），并降低了IL-10的基因表达（P<0.01）。si-WT1和ssc-miR-10390抑制剂的共转染提高了IL-10的基因表达（P<0.01），并降低了IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表达（P<0.01）（图12c）。肠道上皮细胞通过紧密连接（tight junctions）和粘附连接（adherens junctions）等细胞连接网络形成有效的屏障，有效防止细菌、病毒和内源性毒素进入体内。在本研究中，DQ导致ZO-1、Occludin和Claudin的表达下调，而SC06则导致这些蛋白的表达上调。SC06和DQ对这些紧密连接蛋白相关基因的表达有显著的交互作用。与我们的结果一致，有报道称Bacillus licheniformis能够增加仔猪肠道紧密连接的表达[25]。此外，杯状细胞（Goblet cells）可以分泌黏液来形成化学屏障。MUC1主要位于上皮细胞的腔面，以保护细胞免受极端因素的伤害，而MUC2是肠黏膜黏液层的主要成分。在这里，DQ降低了MUC1和MUC2的转录水平。SC06逆转了这一变化，并且SC06和DQ对MUC2的基因表达有显著的交互作用。进一步地，肠黏膜组织通过肠道相关淋巴组织和免疫细胞分泌TNF-α、白细胞介素（interleukins）和IFN-γ等免疫因子，具有免疫屏障功能。我们发现DQ降低了IL-10和sIgA的含量及其基因表达，同时增加了IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的含量及其基因表达。然而，SC06逆转了这些变化。同时，SC06和DQ在IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量及其基因表达上也存在显著的交互作用。上述发现表明，饮食中添加SC06可以有效改善DQ诱导的仔猪空肠屏障功能。通过体外实验，我们进一步证实SC06显著降低了氧化应激，减轻了炎症，并改善了DQ处理的IPEC-J2细胞中的紧密连接基因表达。类似地，也有研究报道了各种益生菌（如Bacillus subtilis DSM 32,540和Lactobacillus johnelii BS15）对增强仔猪肠道屏障功能的有益作用[26, 27]。肠道微生物群在宿主代谢、免疫和发育中起着重要作用[28]。以往的研究主要集中在仔猪的粪便或盲肠微生物群上。然而，肠道的不同部分在结构、功能和微生物定植方面存在显著差异，这直接导致不同肠道段的基因表达谱和疾病易感性存在区域特异性[29,30,31]。因此，本研究中检测了空肠黏膜细菌。尽管SC06和DQ对组间的α和β多样性没有显著影响，但在当前研究中观察到黏膜微生物群在不同分类水平上存在显著变化。DQ组中Chlamydiae（门）细菌的相对丰度高于Con组。Chlamydiae是人类和猪中常见的病原体，可引起多种疾病[32]。在空肠中，SC06组中的Peptostreptococcaceae（科）、Ruminococcaceae（科）和Clostridium（属）的丰度低于Con组。Peptostreptococcaceae通常被认为是肠道的正常菌群，但Jalanka等人[33]报告称，在溃疡性结肠炎儿童的结肠黏膜中Peptostreptococcaceae的丰度增加。大肠中Ruminococcaceae的丰度增加与克罗恩病（Crohn’s disease）、炎症性肠病（inflammatory bowel disease）和肠易激综合症（irritable bowel syndrome）呈正相关[34]。Clostridium存在于人类和动物的肠道中，其中大多数是非致病性的，只有少数是致病性的。Lactobacillus plantarum ZLP001已被证明可以减轻IPEC细胞中由炎症引起的Clostridium丰度增加[35]。SC06 + DQ组中Corynebacteriaceae（科）、Ruminococcaceae（科）和SMB53（属）的相对丰度低于DQ组。Corynebacteriaceae是人类和动物的致病菌，与炎症密切相关[36]。SMB53是人类临床实践中常见的机会性病原体。Yang等人[37]发现SMB53对猪的肠道有负面影响。KEGG富集分析显示，与Con组相比，DQ组中溶酶体（lysosome）的富集程度较低，而剪接体（spliceosome）的富集程度较高。SC06 + DQ处理比DQ处理更能促进视黄醇（retinol）代谢的富集。与我们的发现一致，Li等人[38]表明Lactobacillus sake JD10的施用促进了RAW 264.7细胞中溶酶体通路的富集。Bacillus licheniformis处理的鱼类中也观察到了剪接体通路的富集增加[39]。用Bacillus subtilis处理的肉鸡中肠道视黄醇代谢通路的富集也有所增加[40]。总之，饮食中添加SC06改善了DQ处理的仔猪的空肠屏障功能。此外，越来越多的证据表明肠道氧化损伤与miRNA的调节密切相关。miRNA测序结果显示，各组之间miRNA的表达存在显著差异。ssc-miR-10390是猪应对各种外部压力和病原体感染的核心分子。例如，在感染猪流行性腹泻综合征冠状病毒（porcine epidemic diarrhea syndrome coronavirus）和非洲猪瘟病毒（African swine fever virus）后，ssc-miR-10390的表达发生了显著变化[41,42,43,44]，它可以通过调节细胞应激下的靶基因来影响细胞存活[45]。同样，ssc-miR-4331-5p已被证明会加剧病毒引起的细胞损伤[46]，而ssc-miR-7-5p则参与形成具有细胞保护功能的调节轴[47]。此外，KEGG富集分析显示，在DQ组和Con组之间，DeMiRNAs主要富集在mTOR和MAPK信号通路中；在SC06组和Con组之间，DeMiRNAs主要富集在Ras和MAPK信号通路中；在SC06 + DQ组和DQ组之间，DeMiRNAs主要富集在Wnt、mTOR和ErbB信号通路中。mTOR信号通路是一种非典型的蛋白激酶，在细胞生长、凋亡、自噬和代谢中起重要作用[48]。Liao等人[48]表明，黄芩素（baicalin）的饮食补充通过mTOR信号通路减轻了猪肠道中的氧化损伤。Qin等人[49]报告称，谷氨酸（glutamate）通过mTOR信号通路减轻了断奶仔猪肠道中的LPS诱导的氧化损伤。MAPK是经典的抗氧化信号通路之一。Lactobacillus rhamnosus GG通过调节MAPK/NF-κB信号通路减轻了猪肠道中的LPS诱导的炎症和屏障损伤[50]。Ras蛋白是ERK的上游信号分子，ERK是MAPK信号通路的一个分支。白藜芦醇（resveratrol）的饮食补充通过MAPK和Ras信号通路减轻了断奶仔猪的腹泻和肠道炎症[51]。Wnt信号通路在调节基因表达和DNA损伤反应以及氧化应激中起关键作用[52]。Yousefi等人[52]发现Nrf2ARE（Nrf2）相关抗氧化基因的表达导致Wnt信号通路的失活。ErbB信号通路与多种信号分子结合，使ErbB成员二聚化或异二聚化，从而启动自磷酸化和下游信号级联[53]。Xie等人[54]表明，crotonaldehyde通过Wnt和ErbB信号通路引起人类主动脉内皮细胞的血管损伤。综上所述，饮食中添加SC06显著调节了空肠miRNAs的表达。基于上述发现，我们发现ssc-miR-10390与动物健康密切相关，并且在DQ组和Con组以及SC06 + DQ组和DQ组之间也是共同的DeMiRNA，因此检测并验证了ssc-miR-10390在调节空肠黏膜健康中的作用。与空肠ssc-miR-10390的表达谱一致，在IPEC-J2细胞中，DQ处理增加了ssc-miR-10390的表达，而SC06则降低了其表达。此外，在DQ和SC06处理后，转染ssc-miR-10390模拟物（ssc-miR-10390 mimic）增加了MDA的含量，降低了抗氧化酶的活性，破坏了紧密连接并加剧了细胞炎症，而转染ssc-miR-10390抑制剂则逆转了这些结果。因此，ssc-miR-10390在SC06介导的IPEC-J2细胞氧化损伤缓解中发挥了重要作用。随后分析了ssc-miR-10390的靶基因。miRanda数据库显示WT1是ssc-miR-10390的靶基因。此外，已有报道表明WT1可以调节氧化应激、凋亡和屏障功能。例如，组蛋白去乙酰化抑制剂丁酸钠（sodium butyrate）诱导的过度乙酰化上调了猪肾成纤维细胞中WT1的基因表达，表明组蛋白乙酰化参与了猪肾细胞中WT1的转录调节[55]。在小鼠胚胎发育过程中，WT1促进肠道和肠系膜的生长[56]。然而，WT1在断奶仔猪肠道氧化应激中的作用尚未被报道。在这里，通过使用双荧光素酶报告基因测定（dual luciferase reporter gene assay），我们验证了WT1是ssc-miR-10390的靶基因。然而，与NC组转染的突变体相比，转染ssc-miR-10390模拟物降低了萤火虫荧光素（firefly luciferin）与reniferin的比率，表明ssc-miR-10390与靶基因WT1的结合位点并非我们预测的那样。这可能是由于物种的特异性。现有数据库中来自猪的验证数据占比不到10%，导致预测结果与猪源WT1的真实结合位点存在偏差。因此，需要进一步验证ssc-miR-10390和WT1的结合位点序列。随后，我们使用RNA干扰技术进一步研究了WT1的作用。结果表明，在DQ和SC06处理后，转染si-WT1增加了MDA的含量以及IL-1β、IL-6、TNF-α和IFN-γ的基因表达，降低了SOD、GSH-Px和CAT的活性以及ZO-1、Claudin、Occludin和IL-10的基因表达。拯救实验的结果表明，共同转染ssc-miR-10390抑制剂和si-WT1可以部分逆转si-WT1引起的抗氧化能力下降、紧密连接破坏和炎症水平升高，并减轻氧化损伤。因此，ssc-miR-10390-WT1通路在SC06介导的IPEC-J2细胞氧化损伤缓解中起着关键作用。

结论
我们的结果表明，SC06补充剂通过提高屏障功能和miRNA谱（如ssc-miR-10390）改善了DQ诱导的氧化应激，尤其是在仔猪空肠和IPEC-J2细胞中。进一步地，通过使用ssc-miR-10390模拟物、ssc-miR-10390抑制剂和siRNA，我们发现ssc-miR-10390可以通过靶向WT1基因增强抗氧化功能和紧密连接，并缓解IPEC-J2细胞中的细胞炎症。这些发现表明，ssc-miR-10390在SC06介导的仔猪空肠黏膜氧化损伤缓解中起着重要作用。

**材料与方法**
**细菌**
SC06菌株已由中国典型培养物中心（China Center for Type Culture Collection）赋予编号（CCTCC No: M2012280）。SC06的培养方法遵循我们之前的研究[57]。简而言之，SC06在Luria-Bertani培养基中培养，并以180 r/min的速度（37 ℃，24小时）摇匀。通过3000 r/min（4 ℃，10分钟）离心收集纯化的SC06。之后，用无菌0.85%氯化钠溶液洗涤SC06两次。在试验过程中，检查了细菌的纯度[58]。

**动物实验设计**
实验采用2 × 2因子设计，使用两种水平的SC06（0和1 × 10^8 cfu/g）和两种水平的DQ注射（0和10 mg/kg）[59]，因此分为对照组（Con）、DQ组、SC06组和SC06 + DQ组。32只初始体重相似（7.51 ± 0.39 kg）的28天大的杜洛克×兰德瑞斯×约克夏杂交断奶仔猪被随机分配到上述4组。每组仔猪被关在各自的围栏中。在实验的第22天，DQ组和SC06 + DQ组的仔猪被腹腔注射DQ，而Con组和SC06组则接受等体积的生理盐水处理。基础饲料按照NRC 2012标准配制（表S1）。

**动物样本收集**
在实验第29天，对仔猪实施安乐死，通过快速心内注射戊巴比妥钠（50 mg/kg体重）并开始颈静脉放血程序以确保死亡。然后解剖空肠的中段并用无菌生理盐水冲洗。空肠段的一部分被固定在4%的paraformaldehyde溶液中，用于Hematoxylin–eosin (HE)染色，另一部分则被切割并固定在电子显微镜固定液中。随后通过用棉签擦拭黏膜来收集空肠黏膜细菌。此外，还仔细刮取了空肠黏膜样本。棉签尖端和空肠黏膜样本立即在液氮中快速冷冻，然后储存在-80°C条件下。

**细胞培养和处理**
IPEC-J2细胞在细胞培养箱（37°C，5% CO2）中培养，使用DMEM/F12（HyClone，美国）培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国）、1%青霉素和1%链霉素。根据我们之前的研究，体外实验采用了2×2因子设计，包括两种SC06剂量（0或1×10^8 cfu/mL）和两种DQ剂量（0或950 μmol/mL）[60]。实验分为4组：对照组（Con）、DQ组、SC06组、SC06 + DQ组。将浓度为5×10^5 cells/mL的细胞悬液接种到12孔培养板中（每孔1 mL，Corning，美国），并在CO2培养箱中培养24小时。SC06组和SC06 + DQ组的细胞首先用1×10^8 cfu/mL的SC06培养6小时，然后向SC06 + DQ组的细胞中加入950 μmol/mL的DQ再培养6小时以诱导氧化应激；而SC06组的细胞则加入等量的PBS（Servicebio，中国）继续培养6小时。对照组和DQ组的细胞在培养箱中培养6小时后，DQ组的细胞再接受950 μmol/mL的DQ处理6小时，对照组细胞则继续用相同体积的PBS处理6小时。

**RNA干扰和细胞转染**
GenePharma Co, LTD（苏州，中国）制备了针对WT1的siRNA（si-WT1）、siRNA阴性对照（si-NC）、ssc-miR-10390模拟物、ssc-miR-NC模拟物、ssc-miR-10390抑制剂和ssc-miR-NC抑制剂（见表S2）。使用Lipofectamine 3000转染试剂（Invitrogen，美国）在Opti-MEM（Gibco，美国）中进行IPEC-2细胞的转染。转染12小时后，将Opti-MEM替换为含有10% FBS（Gibco，美国）的DMEM/F12培养基。随后分别用相应的SC06（0或1×10^8 cfu/mL）或DQ（0或950 μmol/mL）处理细胞6小时。

**目标基因预测和双荧光素酶报告基因检测**
人类胚胎肾293T（HEK-293T）细胞在含有10% FBS（Gibco，美国）、1%青霉素和1%链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，HyClone，美国）中培养，培养条件为37°C、5% CO2。通过TargetScan（www.targetscan.org）、miRBase（www.mirbase.org）和miRanda（www.microrna.org）数据库预测ssc-miR-10390的目标基因。为了验证ssc-miR-10390是否能够靶向WT1，进行了双荧光素酶报告基因实验。具体操作是将WT1 mRNA的野生型和突变型3’UTR克隆到psi-Check2（Promega，美国）载体中，然后与ssc-miR-10390模拟物或ssc-miR-NC模拟物一起转染到HEK-293T细胞中。萤火虫荧光素酶活性作为 normalization 对照。转染48小时后收集HEK-293T细胞，使用Beyotime（中国）的双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶的活性通过Fluoroskan微孔板读数仪（Thermo Scientific，美国）进行测量。

**细胞样本收集**
细胞实验结束后，收集上清液并储存在-20°C的离心管中。随后用PBS清洗细胞三次。向每个孔中加入1 mL Trizol试剂（Tiangen，中国），并将裂解液收集到1.5 mL离心管中，储存在-80°C。

**HE染色和透射电子显微镜（TEM）**
固定的空肠段被包埋后进行HE染色。使用OLYMPUS显微镜（OLYMPUS，日本）观察绒毛高度和隐窝深度，并根据我们之前的研究进行测量[61]。将空肠组织切成1 mm3的小块并固定在电子显微镜固定液中（Xavier Biotechnology Co., Ltd.，武汉，中国）。使用超薄切片机（Leica EM UC7，Wetzlar，德国）将组织切成超薄切片后进行铀酰醋酸染色。样品的电子显微照片由TEM（HITACHI HT7700 120kv，东京，日本）拍摄。

**生化分析**
在冰冷的0.85%盐水中（1:10，w/v）匀浆后，通过离心（2000 × g，10分钟，4°C）收集空肠黏膜蛋白质。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，中国）测量蛋白质浓度。通过ELISA试剂盒（Enzyme-Linked Co., Ltd.，上海，中国）测定丙二醛（MDA）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）以及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性。空肠黏膜中的ROS含量也通过ELISA试剂盒（Meimian Industrial Co., Ltd.，江苏，中国）测定。严格按照制造商说明书操作。使用SpectraMax iD3（Molecular Devices，中国）仪器测量吸光度。

**实时定量PCR（RT-qPCR）**
RNA提取和RT-qPCR按照我们之前的研究方法进行[62]。基因引物见表S3。使用miRNA 1st strand cDNA合成试剂盒（Vazyme，中国）和BioRad CFX96?实时PCR系统（Bio-Rad Laboratories，美国）通过RT-qPCR测定miRNA表达水平。β-actin和GAPDH用于标准化mRNA转录本水平。U6用于标准化miRNA转录本水平。采用2^-ΔΔCq方法估计目标基因的表达量。

**DNA提取和空肠黏膜细菌分析**
使用粪便基因组DNA提取试剂盒（Tiagen，中国）提取空肠黏膜细菌DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，并用UV分光光度计进行定量。使用338 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）引物通过PCR扩增V3-V4区域。最后，将样本提交给Illumina MiSeq平台进行测序。

**小RNA文库构建和测序**
使用Trizol试剂提取空肠黏膜RNA。使用NEB Next Multiplex Small RNA Library Prep for Illumina试剂盒制备小RNA文库。使用Agilent 2100 Bioanalyzer和Agilent High Sensitivity DNA Kit检测文库质量，Pico Green检测文库的总浓度，qPCR测定文库的有效浓度。这些操作均在Illumina PE150模式下完成。原始数据由Panomic Biomedical Technology Co., Ltd.（苏州，中国）开发的脚本进行质量检查。这些序列与miRBase中的猪miRNA前体和成熟体序列进行比对以注释检测到的miRNAs。使用DeSeq1.30.0软件分析两种比较组之间miRNAs的差异表达。利用miRanda数据库预测miRNAs的目标基因，随后使用clusterProfiler3.4.4软件进行差异miRNAs的目标基因KEGG通路富集分析。

**统计分析**
使用SPSS 20.0软件进行方差分析，通过Tukey多重比较方法识别组间显著差异。结果以均值和标准误差表示，P<0.05表示有显著差异。