饮食对猪肠道菌群（resistome）的调节与微生物氨基酸代谢密切相关

《Animal Microbiome》：Dietary regulation on gut resistome linked with microbial amino acid metabolism in pigs

　　摘要
膳食蛋白质在塑造肠道微生物群和调节肠道氨基酸代谢方面起着关键作用。肠道微生物群被认为是携带抗菌耐药基因的储存库。然而，氨基酸代谢与抗生素耐药组（resistome）之间的关系仍不甚明了。本研究使用猪模型，通过比较膳食酪蛋白水解物饮食与完整酪蛋白饮食的影响来探讨这一关系。代谢组学分析显示，酪蛋白水解物的添加主要改变了氨基酸代谢，表现为包括酪氨酸和谷氨酰胺在内的几种氨基酸水平显著降低，同时氨基酸衍生物的代谢物水平升高。宏基因组学分析表明，这些代谢变化与肠道微生物的变化密切相关，尤其是大肠杆菌（Escherichia）和双歧杆菌（Bifidobacterium）属。与此一致的是，与氨基酸转运和代谢相关的微生物基因的丰度增加。值得注意的是，酪蛋白水解物添加后，抗生素耐药基因（ARGs）和移动遗传元件（MGEs）的丰度显著增加。综合代谢组学-耐药组相关性分析揭示了包括酪氨酸和谷氨酰胺在内的多种氨基酸与不同抗生素耐药基因亚型之间的显著关联，表明氨基酸代谢与抗生素耐药潜力之间存在紧密耦合。宏基因组学的分箱和组装进一步明确了这些功能特征的分类学来源。具体而言，在Ferguson大肠杆菌（Escherichia fergusonii）和嗜热双歧杆菌（Bifidobacterium thermophilum）中，与氨基酸代谢、抗生素耐药基因和移动遗传元件相关的基因在同一contig上共定位，且基因组距离较近。这些发现共同强调了微生物氨基酸代谢与耐药组之间的强烈联系，表明膳食酪蛋白水解物重塑了肠道生态系统中的微生物代谢功能和抗生素耐药潜力。

引言
不同形式的膳食蛋白质，包括完整蛋白质和蛋白质水解物，可以通过塑造微生物群落组成、调节代谢活性以及影响宿主-微生物相互作用来不同地影响肠道健康[1, 2]。富含肽结合氨基酸和生物活性肽的酪蛋白水解物已被提出作为一种营养干预措施，以改善肠道功能和代谢稳态，可能比完整酪蛋白具有优势。先前的研究表明，膳食酪蛋白水解物可以加速胃排空[3]，促进肠内分泌细胞发育[4]，并有助于乳酸杆菌（Lactobacillus amylovorus）在小肠中的定植[5]。更近期的证据进一步表明，酪蛋白水解物可以调节上皮细胞的氨基酸和肽转运以及胃酸分泌[6]。尽管取得了这些进展，但酪蛋白水解物如何影响肠道生态系统中的微生物氨基酸代谢仍不甚明了。微生物对氨基酸的转运和代谢是肠道生态系统功能的核心[7]。除了作为微生物生长的能量来源外，肠道腔内的氨基酸还是影响肠道健康和宿主生理的多种代谢物的前体[8]。例如，微生物的氨基酸代谢可以生成神经活性化合物，突显了肠道微生物群与肠道-大脑轴之间的功能联系[9]。除了这些针对宿主的影响外，越来越多的证据表明，微生物的氨基酸代谢还与抗菌耐药基因的表达和分布密切相关。耐药组（resistome）指的是微生物群落中所有抗生素耐药基因（ARGs）的集合，包括病原性和非病原性微生物所携带的基因[10]。这些基因可能是内在的，自然编码在特定细菌物种中，也可能是通过突变和水平基因转移获得的[11]。抗生素耐药基因编码多种机制，使细菌能够抵抗抗生素的作用，包括药物失活、抗生素靶位点的修饰以及抗菌化合物的主动排出。虽然抗生素耐药基因广泛分布于肠道微生物群中，可能不会立即构成临床威胁，但它们通过选择压力或基因转移事件有可能成为抗菌耐药性的重要来源[12, 13]。功能上，抗生素耐药基因编码了多种耐药策略，如抗生素的酶促降解、外排泵系统以及靶点修饰，并且经常与促进其在微生物群落中移动和传播的移动遗传元件（MGEs）相关联[14,15,16]。虽然抗生素耐药基因传统上是在抗生素暴露的背景下研究的，但越来越多的证据表明，非抗生素因素（包括营养物质的可用性和微生物代谢活性）也会影响其丰度和持久性[17, 18]。例如，精氨酸限制已被证明可以诱导金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进入耐受状态，从而降低其对抗生素的敏感性[19]。相反，细菌代谢物如氨基酸和核苷酸可以增强细胞代谢活性，使耐受的细菌群体重新敏感，并提高抗生素的效果[20]。总的来说，这些发现强调了氨基酸转运和代谢作为肠道微生物群中耐药性动态的新兴调节因素。

在这项研究中，使用喂食含有酪蛋白水解物或完整酪蛋白的猪作为模型，来研究膳食对肠道氨基酸代谢和耐药组的调节作用。通过整合宏基因组学和代谢组学分析，我们表征了酪蛋白水解物添加后微生物在氨基酸转运和代谢途径中的反应。鉴于膳食氨基酸组成和盲肠氨基酸谱的显著差异，进一步检查了相应的抗生素耐药基因和移动遗传元件的变化。这些分析旨在阐明膳食酪蛋白水解物如何调节微生物代谢和抗菌潜力，为氨基酸、肠道微生物群和耐药组之间的相互作用提供了新的见解。

材料与方法
动物实验设计和样本收集
所有动物护理和实验程序均完全符合南京农业大学动物护理和使用委员会批准的伦理指南（批准号SYXK (Su) 2017-0007）。本研究的主要目的是探讨不同膳食蛋白质形式（特别是完整酪蛋白与酪蛋白水解物）的生物学效应。试验在南京农业大学动物科学和技术学院的研究设施中进行。共有16头杜洛克×兰德拉斯×约克夏杂交公猪（63 ± 2天大），平均初始体重为19.09 ± 0.61公斤，随机分配到两种膳食处理组（每组8头）：完整酪蛋白添加组（IC）和酪蛋白水解物添加组（HC），具体方法如我们之前的研究所述[3]。实验饮食的组成和营养谱详见表S1。为了保持膳食平衡，猪每天接受标准饲料量的85%，分三次均匀喂食，并在整个研究期间自由饮水。猪舍的环境温度维持在24 ± 2°C。喂养试验持续28天，在此期间密切监测动物的健康和福利状况。定期进行通风和清洁以保持卫生条件。每日观察包括饲料摄入量、粪便稠度和一般行为，以评估整体健康状况。在第29天实验结束时，所有猪通过静脉注射4%戊巴比妥溶液（40 mg/kg体重）麻醉，并通过放血处死。盲肠内容物样本在无菌条件下收集，立即转移到无菌冻管中，迅速冷冻在液氮中，并储存在-80°C直到进一步分析。

宏基因组学测序
使用E.Z.N.A.? Stool DNA Kit（Omega Bio-Tek, USA）根据制造商的说明从盲肠内容物样本中提取微生物基因组DNA。通过1%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量和完整性。随后，使用Covaris S220超声仪（Woburn, MA, USA）将每个样本的1 μg DNA片段化。使用商业可用协议（Biozeron, China）制备DNA文库，并在Illumina HiSeq X平台上进行测序，读取长度为150 bp的配对末端序列。原始读段经过质量控制处理，使用Trimmomatic（v0.36）去除测序接头和低质量碱基（参数：ILLUMINACLIP: adapters.fa:2:30:10 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75）[21]。为了去除宿主来源的序列，使用bowtie2软件（v2.5.4）将清洁后的读段与Sus scrofa参考基因组（Sscrofa11.1, Ensembl release 104）对齐。此外，使用Bowtie2将质量控制后的读段与人类参考基因组（hg19）和PhiX174基因组对齐，并在下游分析前移除映射到这些参考基因组的读段。使用Kraken2（v2.0.6）进行宿主去除读段的分类学分类，参数为（--threads 16 --quick --report-zero-counts --gzip-compressed --paired）。然后使用MEGAHIT（v1.1.1-2-g02102e1）进行宿主去除读段的组装，参数为（--min-contig-len 500）。使用Prodigal [22]从组装的contig中预测开放阅读框（ORFs）。使用CD-HIT（v4.8.1）以严格参数（-n 9 -c 0.95 -G 0 -M 0 -d 0 -aS 0.9 -r 0 -T 40）将重复的ORFs聚类为非重复基因目录[23]。使用Salmon软件（v1.1.0）[24]进行基因丰度量化[24]。

非靶向代谢组学
大约100毫克冷冻盲肠内容物用液氮冻碎，并用80%甲醇（0.1%甲酸）提取。 vortex后，在冰上孵育5分钟，然后在15,000 ×g、4°C条件下离心5分钟。上清液用LC-MS级水稀释至53%甲醇，转移到干净的试管中，并在相同条件下再次离心10分钟。最终上清液用于LC-MS/MS分析。

代谢物分析
使用Vanquish UHPLC与Q Exactive? HF Orbitrap MS（Thermo Fisher）结合Hypersil GOLD C18柱（100 × 2.1 mm, 1.9 μm）进行代谢物分析，流速为0.2 mL/min。17分钟的梯度为：2% B（0–1.5分钟），2–100% B（1.5–12.0分钟），100% B（12.0–14.0分钟），100–2% B（14.1–14.9分钟），2% B（14.9–17.0分钟）。流动相为正模式下的0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）；负模式下的5 mM醋酸铵（pH 9.0）。MS条件：喷射电压3.2 kV，毛细管温度320°C，鞘气40，辅助气体10。

数据使用Compound Discoverer 3.1进行处理，包括特征提取、对齐和定量（质量容忍度5 ppm，RT容忍度0.2分钟，峰值强度≥100,000，S/N≥3）。强度归一化到总离子电流，并使用mzCloud、mzVault和MassList进行代谢物鉴定，注释来自KEGG（https://www.genome.jp/kegg）、HMDB（https://hmdb.ca）和LIPID MAPS（https://www.lipidmaps.org）。

短链脂肪酸和有机酸的测量
盲肠内容物中的短链脂肪酸（SCFAs）分析遵循我们实验室建立的方案[5]。使用高效液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific, USA）测定盲肠内容物中的甲酸、乳酸和琥珀酸浓度。对于标准曲线，将20毫克的乳酸、甲酸和琥珀酸分别溶解在1毫升双蒸水中制备储备溶液，然后连续稀释2–20倍并过滤（0.22 μm）。为了获取样本，将约0.5克的消化物悬浮在1.5毫升水中，涡旋混匀后以12,000转/分钟的速度离心10分钟。取1毫升上清液与200微升25%的偏磷酸混合，并在-20°C下过夜保存。解冻后，再次离心两次（每次12,000转/分钟，各15分钟），然后通过0.22微米的滤膜过滤，并使用HPLC进行分析。酸的浓度是根据标准曲线计算得出的。

**ARGs和MGEs的鉴定**
ARGs的鉴定使用了ARGs-OAP（版本3.2.4）工具，基于FASTQ格式中去除宿主后的读段进行默认设置。下载了mobileOG-db（版本2.0）数据库用于构建MGE数据库。MGEs是通过将ORFs文件与mobileOG数据库对齐来识别的，使用的参数为 (--evalue 1e-10 --id 90 --max-target-seqs 70)。每个样本中的原核细胞数量通过ARGs-OAP估算，随后将MGE的丰度按每个细胞的拷贝数进行归一化。

**MAG分箱、分类学分类和功能注释**
使用MetaSPAdes（版本3.14.0）和默认参数，从去除宿主后的读段生成高质量的宏基因组组装。然后使用MetaWRAP流程将每个样本的contigs分箱为宏基因组组装体（MAGs），该流程整合了三种分箱算法：MetaBAT2、MaxBin2和CONCOCT。保留完整性大于70%且污染率小于5%的MAGs用于后续分析。分箱后，使用dRep（版本3.5.0）在样本间进行去重复处理，参数为(-sa 0.9 -pa 0.85)，并使用CheckM中的lineage_wf方法评估基因组质量。去重复后的MAGs的分类学分类是使用GTDB-Tk（版本2.3.2）和GTDB参考数据库（版本R214）进行的。

**ORFs的预测**
使用Prodigal在宏基因组模式下从去重复后的MAGs中预测ORFs。使用PhyloPhlAn（版本3.1.68）在高多样性设置下构建系统发育树。MAG来源的ORFs的功能注释使用了多个数据库：使用KOfamKOALA（exec.Annotation）分配KEGG同源物；通过DIAMOND与CARD数据库比对（参数为--evalue 1e-10 --id 80 --max-target-seqs 70）鉴定ARGs；如前所述，通过DIAMOND与mobileOG数据库比对来鉴定MGEs。

**统计分析和可视化**
所有数据均在R语言中进行分析和可视化。由于目标有机酸和选定微生物基因的非正态分布，使用了非参数统计方法进行分析。对于两组之间的比较，应用了Mann–Whitney U检验。当P值小于0.05时，认为差异具有统计学意义。代谢组数据在代谢物丰度进行对数2变换后，使用limma包进行分析。P值使用Benjamini–Hochberg方法进行了多重检验校正。差异代谢物定义为假发现率（FDR）≤0.10且|log2倍变化|≥1的代谢物，OPLS-DA的VIP≥1用于特征优先级排序。此外，名义P值小于0.05且0.10< FDR≤0.25的代谢物被视为潜在的（趋势级别）变化。基于KEGG化合物ID和limma衍生的统计结果，使用基于秩的GSEA方法（fgsea）进行KEGG通路富集分析，并使用FDR校正后的P值评估通路级别的显著性。此外，使用MetaboAnalyst分别分析增加和减少的代谢物以识别特定方向的代谢变化。

**微生物特征与代谢物之间的关联**
使用mixOmics R包中实现的稀疏偏最小二乘（sPLS）回归框架探索微生物特征与代谢物之间的关联。相关网络使用R中的Spearman方法和igraph包构建。

**ARGs和MGEs的差异丰度分析**
使用MaAsLin2进行ARGs和MGEs的差异丰度分析。使用适当的归一化和转换，通过多变量线性模型建模ARG/MGE特征与实验组之间的关联，FDR<0.05的特征被认为是显著不同的。使用vegan R包中的adonis2函数通过PERMANOVA计算beta多样性的R2和P值。为了评估代谢组谱型与抗生素抗性相关特征之间的全局一致性，基于每个数据集的排序结果进行了Procrustes分析。使用Mantel检验进一步量化不同数据矩阵之间的关联，而使用Spearman的秩相关分析评估个别代谢物与ARG基因丰度之间的特征级关联。

**系统发育树的可视化**
系统发育树使用itol.embl.de网站进行可视化。基因簇使用ChiPlot在线平台（https://www.chiplot.online）进行可视化。

**结果**
酪蛋白水解物重塑了盲肠代谢组，对氨基酸代谢产生了显著影响
为了研究酪蛋白水解物对盲肠代谢谱的影响，我们进行了非靶向代谢组分析。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示IC组和HC组之间存在明显的分离，表明酪蛋白水解物补充后整体代谢特征发生了变化（图1A）。

**代谢组分析和IC组与HC组之间的代谢物差异**
(A) OPLS-DA得分图显示了组间的样本分离情况。(B) 基于全局代谢物变化的KEGG通路富集分析。归一化富集得分（NES）表示在IC组中富集的通路（NES<0，粉色）或HC组中富集的通路（NES>0，绿色）。点的大小代表对通路富集有贡献的代谢物数量，颜色代表FDR校正后的P值。(C) IC组与HC组之间差异代谢物的圆形热图。代谢物按生化类别分组。差异代谢物定义为FDR<0.1、|log2 FC|≥1且VIP≥1的代谢物。FDR在0.1≤FDR<0.25之间的代谢物被视为潜在的（趋势级别）变化。外圈表示log2 FC，内圈表示统计显著性。(D) 上调（D）和下调（E）代谢物的通路影响分析。(F) 显示甲酸、乳酸和琥珀酸浓度的条形图。(G) 显示总短链脂肪酸（SCFAs）浓度的条形图。

**不预先选择差异代谢物的通路级代谢改变分析**
为了在不预先选择差异代谢物的情况下表征通路级别的代谢改变，基于IC组和HC组之间排序的全局代谢物变化，使用fgsea进行了KEGG通路富集分析。该分析揭示了多个氨基酸相关通路的显著富集，包括氨基酸生物合成、氨基酰-tRNA生物合成和色氨酸代谢，组间存在明显的方向性富集模式（图1B）。

**差异代谢物的进一步分析**
随后进行了差异代谢物分析，识别出一组在组间显示显著或趋势级别变化的代谢物。根据FDR<0.1、|log2 FC|≥1和VIP≥1的综合标准，这些代谢物被定义为显著改变的代谢物，而FDR在0.1≤FDR<0.25之间的代谢物被视为潜在变化。这些具有鉴别性的代谢物主要参与氨基酸代谢及其下游衍生物。具体来说，几种氨基酸（如酪氨酸和谷氨酰胺）在HC组中显著减少，而芳香族氨基酸衍生的代谢物（包括犬尿氨酸、酪胺和肾上腺素）显著增加（图1C）。

**进一步阐明代谢物水平变化的通路**
为了进一步阐明驱动这些代谢物水平变化的通路，分别对上调和下调的代谢物进行了通路拓扑分析（图1D和E）。在HC组中升高的代谢物主要映射到酪氨酸代谢通路（FDR<0.05），这是受影响最大的通路；而在HC组中减少的代谢物主要与苯丙氨酸代谢和苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成通路相关（FDR<0.05）。

**有机酸的定量分析**
除了氨基酸相关的改变外，定量分析还显示HC组中琥珀酸浓度显著下降，而甲酸和乳酸水平保持不变（图1F）。此外，HC组中短链脂肪酸（SCFAs）的总浓度显著增加，主要是由于丙酸水平的升高（图1G）。总体而言，这些结果表明酪蛋白水解物的补充显著重塑了盲肠代谢环境，对氨基酸代谢和下游发酵产物产生了显著影响。

**改变的氨基酸谱与微生物属和宏基因组编码的运输及代谢功能相关**
鉴于在盲肠代谢组中观察到的氨基酸谱的变化，接下来我们检查了这些变化是否与肠道微生物群组成的变化和微生物的功能潜力有关。基于代谢组结果，我们关注了一组表现出显著变化的氨基酸及相关代谢物，包括谷氨酰胺、丝氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，并检查肠道微生物群的变化是否可以解释这些变化。为此，应用了稀疏偏最小二乘（sPLS）分析将选定的代谢物与属级别的微生物谱相关联。

**微生物属与氨基酸和参与氨基酸运输及代谢的微生物基因之间的关联**
在这个框架内，sPLS模型识别出在第一组分上的载荷最能解释微生物组成与选定氨基酸特征之间协变的细菌属，突出了与改变的氨基酸景观最密切相关的分类单元（图2A和B）。与氨基酸载荷方向相反的属（如大肠杆菌）与这些代谢物呈负相关，而具有相同载荷方向的属（包括双歧杆菌和巨球菌）则呈正相关。为了进一步明确这些关联的方向和强度，基于sPLS选定的代谢物和属构建了相关网络，从而可视化正负属-氨基酸关系（图2C）。

**代谢组谱与抗生素抗性相关特征的全球一致性评估**
为了评估代谢组谱与抗生素抗性相关特征之间的全球一致性，基于每个数据集的排序结果进行了Procrustes分析。使用Mantel检验进一步量化了不同数据矩阵之间的关联，而使用Spearman的秩相关分析评估了个别代谢物与ARG基因丰度之间的特征级关联。

**酪蛋白水解物对微生物群和抗生素抗性的影响**
为了评估酪蛋白水解物对微生物抗生素抗性潜力的影响，使用ARGs-OAP流程基于去除宿主的宏基因组读段对ARGs进行了分析。Alpha多样性分析显示HC组的ARG多样性显著增加，Shannon指数和Simpson指数均表明这一点（图3A）。一致地，基于Jaccard距离的Beta多样性分析显示组间ARG谱的明显分离（R2=0.162，P=0.001；图3B）。除了组成变化外，HC组的整体ARG负担也趋于增加。具体来说，ARG的相对丰度——作为ARG占总基因数的比例——在酪蛋白水解物补充后呈增加趋势（P=0.08；图3C）。按抗性类别对ARG进行分层后，进一步发现HC组中与多重耐药性、多粘菌素、磺胺类和三甲氧嘧啶抗性相关的基因富集（图3D）。在222个检测到的ARG亚型中，有48个亚型基于FDR阈值<0.05在组间差异富集（图3E）。在这些中，有46种ARG亚型在HC组中的丰度显著增加，而只有两种ARG——ileS和erm(X)——相对于IC组有所减少（图3F），这表明在添加酪蛋白水解物后，抗性组（resistome）的丰度发生了明显的变化。图3的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。对IC组和HC组之间的抗生素抗性基因（ARGs）和移动遗传元件（MGEs）进行了比较分析。(A) ARGs的Shannon和Simpson alpha多样性指数的箱线图。(B) 基于Jaccard距离的ARGs的主坐标分析（PCoA）。(C) 显示ARGs占基因总数的百分比的条形图。(D) 按抗生素类别分类的ARG类型的堆叠条形图。(E) 组间差异ARG亚型的概述。在总共222种ARG亚型中，显示了差异性和非差异性的比例。(F) HC组和IC组之间差异ARG亚型的圆形热图。外环代表log2倍数变化（HC vs. IC），内环注释表示ARG类型。(G) MGEs的Shannon和Simpson alpha多样性指数的箱线图。(H) 基于Jaccard距离的MGEs的主坐标分析（PCoA）。(I) 按功能类别分类的MGEs的堆叠条形图。(J) HC组和IC组之间差异MGE特征的火山图。x轴代表log2倍数变化，y轴显示–log10(FDR)。鉴于抗生素抗性传播与MGEs之间的密切关系，我们进一步检查了各组之间的MGE谱型。HC组中MGEs的多样性显著改变，这从增加的Shannon和Simpson指数可以看出（图3G），以及基于Jaccard距离的MGE谱型的明显分离（图3H）。功能分类显示，在添加酪蛋白水解物后，四个主要的MGE类别——整合/切除、转座、噬菌体相关元件和重组/修复功能——显著富集（图3I）。差异分析进一步揭示了MGE丰度的显著变化，有790个MGE特征在HC组中显著富集，而只有5个MGE相对于IC组有所减少，如基于FDR阈值<0.05的火山图所示（图3J）。此外，大多数差异丰度最高的50个MGE在分类上归属于大肠杆菌和其他肠杆菌科成员（图3K），这表明这些分类单元中移动遗传元件的普遍性增加。这些结果共同表明，酪蛋白水解物的添加与抗性组和移动基因组的扩张有关，可能增加了肠道微生物组中的水平基因转移能力。微生物组-代谢组整合揭示了氨基酸与抗生素抗性基因之间的密切关联，为了研究氨基酸代谢的变化是否与抗性组和移动基因组的变化有关，我们进行了综合分析，将氨基酸相关代谢物与ARG和MGE谱型结合起来。Procrustes分析显示，氨基酸相关代谢物的整体排序结构与ARG谱型（r=0.62，P=0.002）以及MGEs（r=0.64，P=0.0014）之间存在显著一致性，表明样本间的代谢变异与抗性组/移动基因组配置有密切对应关系（图4A）。补充Procrustes分析的Mantel相关分析进一步证明了氨基酸相关代谢物、氨基酸相关功能基因、ARGs和MGEs以及微生物alpha多样性和分类组成之间的显著关联（图4B）。这些相关性主要是正相关的。值得注意的是，ARGs和MGEs之间表现出强烈的正相关（r=0.81，P<0.001），并且两者都与氨基酸谱型呈正相关，ARGs的相关系数为r=0.32，MGEs的相关系数为r=0.31（图4B）。这些结果共同表明，氨基酸代谢的变化与微生物群落结构和抗性相关遗传特征的协调变化同时发生。为了更详细地解析这些关系，我们检查了单个氨基酸与ARG类别之间的相关性。几种氨基酸及其代谢衍生物，包括谷氨酰胺、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、犬尿酸及相关化合物，与多个ARG类别表现出显著关联，特别是多药和β-内酰胺抗性类别（图4C）。最后，在ARG亚型水平上的相关性分析揭示了氨基酸及其代谢衍生物之间的不同关联模式（图4D）。核心氨基酸，包括酪氨酸和谷氨酰胺，主要与ARG亚型呈负相关，而氨基酸衍生的代谢物和下游发酵产物如酪胺和犬尿酸主要与ARGs呈正相关，表明底物氨基酸与其代谢产物的关联趋势不同。这些综合分析表明，氨基酸代谢的变化与抗性组和移动基因组的协调变化密切相关，突显了微生物代谢活动与对抗性基因谱型的紧密耦合。基于MAG的分析显示了同时具有氨基酸代谢和抗生素抗性基因的微生物分类单元。为了进一步识别具有氨基酸利用和抗生素抗性基因基因组潜力的微生物，从盲肠宏基因组数据集中重建了274个高质量的MAGs。生成了一个全面的系统发育树来说明这些MAGs的分类分布，并在门水平上提供了注释（图5）。对MAGs中功能基因的分布分析显示，虽然大多数MAGs具有运输和代谢氨基酸的基因组潜力——特别是酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、丝氨酸和异亮氨酸——但只有一部分含有与SCFA运输或抗生素抗性相关的基因（图6）。值得注意的是，bin54作为一个独特的富集MAG脱颖而出，它同时拥有参与氨基酸运输和代谢、SCFA运输以及ARGs的基因。它还包含所有MAGs中数量最多的MGEs。这些特征表明，bin54可能作为一个关键的微生物节点，将营养物质的处理与盲肠微生物组中抗性基因的移动联系起来。图5的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。274个宏基因组组装基因组（MAGs）的系统发育树。从最内层到最外层，同心热图环分别代表门水平的微生物分类、氨基酸（AA）转运蛋白、AA代谢基因、VFA转运蛋白、ARGs和MGEs。图6的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。在同一contig上共定位的AA转运/代谢基因、ARGs和MGEs。（A）热图显示了同时拥有这三种功能基因的MAGs中AA转运蛋白、AA代谢基因、ARGs和MGEs的分布。右侧面板显示了每个MAG的分类注释。bin142（B）和bin54（C）中代表性contig的基因簇，显示了共定位的ARGs、MGEs和AA相关基因。彩色箭头表示不同的基因类别：AA相关基因（橙色）、ARGs（蓝色）、MGEs（绿色）。图6A总结了同时编码与氨基酸运输和代谢、抗生素抗性以及MGEs相关的基因的所有MAG，以及它们相应的分类。值得注意的是，bin121（Campylobacter sp945873855）、bin54（Escherichia fergusonii）、bin46（Limosilactobacillus mucosae）、bin58（Streptococcus alactolyticus）和bin142（Bifidobacterium thermophilum）代表了盲肠微生物组中具有多方面功能潜力的微生物分类单元。进一步分析了每个bin内相关基因的contig水平分布，以探索这种共现背后的基因组结构。值得注意的是，只有bin54和bin142包含氨基酸运输/代谢基因、ARGs和MGEs在相同支架上紧密共位的contigs（图6B和C）。详细的基因簇分析显示了代表性MAGs中氨基酸运输和代谢基因（例如，ABC.P.A.A、ABC.P.A.P、aapP、aapM、aapQ）、抗生素抗性基因（例如，tgpA、acrF、acrA、acrB、mdfA）和MGEs（例如，xer、PSLT501）在相同contig上的物理共定位（图6B和C）。其中，bin54_node_2637是功能上最一致的contig，与氨基酸吸收、抗性和移动性相关的基因密集聚集。这种基因组排列表明，营养代谢与抗性基因在单个微生物基因组内的传播之间存在潜在的功能耦合。在这项研究中，使用了猪模型来研究酪蛋白水解物对微生物氨基酸代谢和肠道抗性组的影响。酪蛋白水解物的添加与腔内氨基酸可用性的显著变化相关，这些变化与微生物氨基酸运输和代谢途径密切相关。值得注意的是，ARGs和MGEs的增加丰度与微生物组组成和氨基酸谱型有很强的关联。此外，宏基因组组装基因组分析显示，抗性组成分与参与氨基酸运输和代谢的基因共存，支持了微生物营养利用与抗性相关遗传特征之间的潜在机制耦合。酪蛋白水解物改变了肠道中的氨基酸可用性，可能会引发宿主和肠道微生物群的协调适应性反应。首先，酪蛋白水解物的添加显著降低了盲肠消化物中几种氨基酸的浓度，包括酪氨酸和谷氨酰胺，尽管饮食中的游离氨基酸水平较高[6]。这种明显的差异表明，来自酪蛋白水解物的饮食氨基酸在胃肠道中被更有效地利用，而不是在远端肠道积累。与此解释一致的是，先前的肽组学研究表明，酪蛋白水解物加速了胃肠道的通过，并产生了更小、更均匀的肽谱，导致在上部肠道中更早、更有效地吸收氨基酸，并减少了向远端肠道的氮输送[25]。与腔内氨基酸可用性的改变相一致，宿主的氨基酸吸收能力得到增强，这从酪蛋白水解物添加后胃体中氨基酸转运蛋白的上调得到证实[6]。扩展这些发现，本研究的宏基因组分析进一步显示，在酪蛋白水解物组中，编码ATP结合盒（ABC）型L-氨基酸转运蛋白的微生物基因显著富集。这些高亲和力、ATP依赖的运输系统使细菌能够从周围环境中有效地获取氨基酸和小肽[30, 31]。重要的是，最近的研究表明，酪蛋白衍生的寡肽不仅作为微生物的营养底物，还可以作为调节因子，诱导肽和氨基酸运输系统及相关代谢途径的表达[26]。这种肽介导的调节可能促进了微生物的营养吸收和代谢活动，从而在竞争性肠道条件下赋予生长和环境适应性优势。总之，这些观察结果表明，酪蛋白水解物可能诱导宿主-微生物群对富含氨基酸和肽的腔内环境的协调适应。胃肠道是ARGs的主要储存库和传输中心[27]，而MGEs（如质粒和转座子）促进了它们在微生物群落中的水平传播[15]。新兴证据表明，微生物代谢状态，特别是那些受营养可用性影响的代谢状态，在调节抗生素抗性中起着重要作用[28]。值得注意的是，本研究中升高的ARGs和MGEs与几种氨基酸（包括酪氨酸和谷氨酰胺）呈负相关，表明氨基酸代谢可能与抗性组动态有关。这一观察结果与先前的报告一致，即氨基酸可用性的波动与猪中ARG丰度的时间变化相关[29]。更具体地说，个别氨基酸似乎对肠道抗性组有不同且有时取决于上下文的影响。例如，补充0.2%的甲硫氨酸与母猪肠道微生物群中ARGs的减少有关[30]。除了在群落水平上的ARG流行度变化外，机制研究进一步表明，L-甲硫氨酸的补充可以通过重新编程细菌代谢和表观遗传调控来恢复tigecycline敏感性的tet(X)-阳性大肠杆菌，从而减弱抗性表型，而不一定消除抗性基因[31]。同样，谷氨酰胺也被认为是一个关键的代谢调节因子，将氨基酸利用与抗生素敏感性联系起来。谷氨酰胺补充已被证明可以增强中枢碳代谢，包括激活三羧酸循环和增加NADH的产生，从而提高质子动力并促进耐药细菌对抗生素的吸收[32]。这些发现进一步支持了氨基酸驱动的代谢重编程主要在功能层面上影响抗生素耐药性的观点，并且个别氨基酸对抗药性的影响高度依赖于代谢环境和微生物的生理状态。除了氨基酸本身的可用性外，氨基酸及其发酵产物的下游代谢命运也可能与肠道耐药组动态密切相关。在酪蛋白水解物组中，琥珀酸水平降低而丙酸水平升高，表明微生物代谢流向发生了改变，倾向于丙酸的生产[33]。越来越多的证据表明，丙酸与肠道耐药组密切相关，因为丙酸水平与特定抗生素抗性基因（ARGs）和甲基化修饰基因（MGEs）的数量和时间波动有关，这突显了短链脂肪酸作为连接微生物活性与耐药相关遗传特征的重要代谢中间体[34]。同时，酪蛋白水解物补充后色氨酸代谢也发生了显著变化。犬尿氨酸途径中的代谢物（包括犬尿氨酸和犬尿氨酸酸）显著增加，表明色氨酸的利用和转化得到了增强。支持色氨酸代谢与耐药组反应之间联系的研究表明，抑制微生物活性的抗生素干预会导致色氨酸相关代谢物的减少以及抗生素抗性基因数量的显著变化[35]。另一方面，来自吲哚的色氨酸代谢物吲哚-3-羧醛减少，表明色氨酸代谢在不同的下游分支中发生了重新分配。此外，另一种来自吲哚的代谢物吲哚-3-乙酸也被报道与不同生态环境中的抗生素抗性基因变化密切相关[36]。综上所述，这些发现表明，中枢发酵产物和特定分支的色氨酸衍生代谢物都与肠道耐药组动态紧密相关。

抗生素抗性基因和与氨基酸代谢相关的基因在细菌基因组中似乎具有位置上的关联。在本研究中，通过宏基因组组装和分箱技术来分析参与氨基酸转运和代谢的基因、挥发性脂肪酸转运蛋白、抗生素抗性基因以及甲基化修饰基因的基因组分布。值得注意的是，在埃舍里奇菌（Escherichia fergusonii）和嗜热双歧杆菌（Bifidobacterium thermophilum）中，与氨基酸转运、抗生素抗性基因和甲基化修饰基因相关的基因位于同一 contigs 上，表明营养获取与抗性相关功能之间存在紧密的基因组耦合。与此观察结果一致，先前的研究也报告了大肠杆菌（Escherichia coli）中抗生素抗性基因和代谢基因的显著共现——尤其是那些参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因，这些基因经常位于同一质粒上[37]。代谢基因存在于接合质粒上被认为有助于通过降低质粒携带的适应性成本并增强细菌在抗生素压力下的生存能力来维持和传播抗生素抗性基因。除了直接编码抗性决定因子外，甲基化修饰基因还可以通过重新分配细胞内资源并改变营养吸收和代谢流（包括与氨基酸获取和利用相关的途径）来间接重塑宿主代谢，即使在没有甲基化修饰基因编码的代谢酶的情况下也是如此[38]。这种与甲基化修饰基因相关的代谢重编程已被证明会影响细菌的适应性和种间相互作用，从而影响群落结构和功能。此外，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）中的氨基酸和肽转运蛋白已被证明会影响细菌的生存能力、毒力和抗生素抗性，这表明膜转运系统可能是减弱耐药性表型的潜在靶点[39]。总体而言，这些发现表明埃舍里奇菌表现出类似的基因组组织结构，其中氨基酸转运蛋白不仅数量众多，而且经常与抗生素抗性基因和甲基化修饰基因共位。这种基因组排列突显了一种潜在的适应策略，即通过增强营养获取能力与抗性决定因子相结合，从而促进细菌的适应性并有助于抗生素抗性在肠道环境中的持续存在和传播。

本研究存在一些局限性。首先，根据主要研究目标，实验设计仅比较了酪蛋白水解物和完整酪蛋白，没有设置额外的正常蛋白质对照组。虽然这种设计使我们能够专门评估蛋白质水解的效果，但它限制了我们对不同蛋白质来源或基线蛋白质条件如何影响氨基酸代谢和耐药组特征的更广泛评估。其次，观察到的氨基酸代谢（包括下游发酵产物）与抗生素抗性基因之间的关联基于相关性分析，因此无法从当前数据中推断出因果关系。未来需要通过靶向微生物操作、同位素追踪或控制干预实验来阐明氨基酸代谢途径与耐药组动态之间的机制联系。

总体而言，酪蛋白水解物补充通过改变肠道微生物群的宏基因组预测的氨基酸转运和利用能力，从而改变了盲肠中的氨基酸代谢。这些代谢变化伴随着肠道耐药组的相应变化。综上所述，我们的发现强调了肠道生态系统中微生物氨基酸代谢与抗生素抗性之间的密切关联。