TSHB基因在多浪羊中的表达谱鉴定及其在颗粒细胞中的功能作用

《BMC Genomics》：Identification of TSHB gene expression profile in Duolang sheep and its functional role in granulosa cells

　　

目的： 促甲状腺激素β亚基（TSHB）基因作为糖蛋白激素β亚基家族成员，已在多种物种的卵巢组织和颗粒细胞（Granulosa Cells, GCs）中被检测到，提示其可能参与卵巢功能的调节。然而，其在多浪羊中的分子调控机制和功能作用尚不清楚。 方法： 克隆多浪羊TSHB基因的编码序列并鉴定其高表达的生长发育阶段。构建TSHB过表达和siRNA干扰模型，探讨其对多浪羊卵泡期卵巢GCs增殖、凋亡及激素分泌的影响。 结果： 在四个不同时间点进行的CCK-8检测显示，TSHB过表达显著增强了GCs的增殖，伴随Cyclin E/CDK2和Bcl-2的上调，以及Bax和Caspase3的下调。干扰则显示出与过表达相反的趋势（p< 0.05）。ELISA结果显示，TSHB过表达显著降低了雌激素水平。干扰显示出与过表达相反的趋势（p< 0.05），这与类固醇急性调节蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein, STAR）和CYP19A1表达量的降低一致。此外，qPCR分析表明，TSHB显著上调了TSHR和FSHR的表达（p< 0.05）。 结论： 上述结果表明，TSHB基因促进多浪羊GCs的增殖，为其卵泡发育提供了新的视角。

多浪羊TSHB基因表达谱鉴定及其在颗粒细胞中功能作用的学术解读

研究背景与立项依据

新疆地区少数民族众多，羊肉是当地饮食的重要组成部分，随着生活水平提高，对羊肉的需求量激增，但新疆大多数绵羊品种存在性成熟晚、初情期延迟和繁殖率低的问题，导致供需失衡。多浪羊作为新疆本土品种，以其优异的繁殖性能著称，具有高排卵率和双羔率。卵巢作为雌性生殖系统的主要器官，其卵泡发育和激素分泌至关重要，而颗粒细胞（GCs）的增殖与分化是卵泡发育的核心。尽管GCs在生殖中的作用已被广泛研究，但关于多浪羊GCs介导卵泡发育的具体分子通路尚未完全阐明。近期研究表明，TSHB及其受体（TSHR）在多种生物的生殖组织中表达，提示其可能在性腺中发挥旁分泌或自分泌功能。然而，TSHB在多浪羊GCs中的生物学效应及其对细胞功能的调控机制仍属空白。鉴于此，研究人员针对多浪羊TSHB基因展开了系统性的分子特征分析与功能验证，旨在填补这一领域的空白，相关成果发表在《BMC Genomics》上。

关键技术方法概述

本研究首先采集了处于不同生理阶段（青春期前、青春期、青春期后）的多浪羊下丘脑、垂体、卵巢、输卵管和子宫组织样本。通过PCR技术克隆了多浪羊TSHB基因的编码区序列（CDS），并利用生物信息学软件对其理化性质、蛋白结构及进化关系进行了预测。研究人员分离培养了多浪羊卵泡期的卵巢GCs，通过免疫荧光染色鉴定细胞纯度。在此基础上，构建了TSHB过表达载体（pcDNA3.1-TSHB）和siRNA干扰体系，利用脂质体转染技术导入GCs。通过CCK-8法检测细胞活力，结合qPCR和Western blotting技术分析细胞周期、凋亡及类固醇合成相关基因（如Cyclin E、CDK2、Bcl-2、Bax、Caspase3、STAR、CYP19A1）的mRNA及蛋白水平变化，并利用ELISA检测细胞上清液中雌二醇（E2）和孕酮（P4）的分泌水平。

研究结果

TSHB基因克隆与序列分析

利用青春期多浪羊垂体cDNA为模板，扩增获得了长度为498 bp的TSHB基因片段。序列比对显示，该序列与绵羊（Ovis aries）和山羊（Capra hircus）的TSHB氨基酸同源性最高（均为100%），与斑马鱼（Danio rerio）同源性最低（34.8%）。系统发育树分析进一步证实多浪羊TSHB与绵羊和山羊亲缘关系最近。

TSHB蛋白特性分析

预测分析表明，多浪羊TSHB蛋白由138个氨基酸组成，分子量约为15.61 kDa，理论等电点为8.20，呈碱性。该蛋白富含半胱氨酸（9.4%），无色氨酸，不稳定指数为47，属于亲水性不稳定蛋白。跨膜区预测显示其无跨膜结构，信号肽预测显示其存在信号肽切割位点（第20和21位氨基酸之间），提示其为分泌型蛋白。二级结构预测显示其主要由无规卷曲（66.7%）和延伸链（22.5%）构成。

TSHB基因在不同阶段和组织中的表达谱差异

qPCR检测结果显示，TSHB在五个被检组织中均有表达，但在垂体中的表达量显著高于其他组织（P< 0.05）。在下丘脑和输卵管组织中，青春期阶段的TSHB表达水平显著高于青春期前和青春期后（P< 0.05），提示TSHB可能与多浪羊初情期的启动有关。

多浪羊卵巢GCs的分离培养与鉴定

通过切割卵泡壁收集GCs并进行原代培养，传至第二代时细胞形态清晰，呈短梭形。免疫荧光染色检测卵泡刺激素受体（FSHR）显示阳性细胞比例超过95%，证实了所培养细胞的确为GCs。

TSHB基因促进GCs增殖

荧光显微镜观察证实转染效率良好。CCK-8检测及mRNA水平分析显示，TSHB过表达显著促进了GCs的增殖（P< 0.01），而干扰组则抑制增殖。Western blotting结果进一步验证了这一趋势。

TSHB基因对GCs增殖和凋亡相关基因的影响

qPCR和Western blotting分析表明，TSHB过表达显著上调了细胞周期进程相关基因Cyclin E和CDK2的mRNA及蛋白水平，同时上调抗凋亡基因Bcl-2，下调促凋亡基因Bax和Caspase3的表达。这表明TSHB可能通过调节Bcl-2/Bax平衡和抑制Caspase3活化来促进细胞存活。

TSHB基因对GCs雌激素和类固醇激素的影响

研究发现，TSHB过表达显著下调了类固醇合成关键基因STAR和CYP19A1的mRNA及蛋白水平。ELISA结果也显示，过表达组细胞上清液中的E2和P4分泌量显著降低（P< 0.05）。此外，TSHB过表达还显著上调了TSHR和FSHR的mRNA水平，提示TSHB可能增强GCs对促性腺激素的敏感性。

讨论与结论总结

本研究首次系统阐明了多浪羊TSHB基因的分子特征及其在GCs中的生物学功能。传统观点认为TSHB主要由垂体分泌并调节甲状腺轴，但本研究发现其在多浪羊卵巢组织中亦有表达，且在青春期垂体中高表达。功能实验证实，TSHB在体外能够显著促进GCs的增殖并抑制其凋亡，这主要通过激活Cyclin E/CDK2信号轴和调节Bcl-2家族蛋白的比例来实现。值得注意的是，虽然TSHB促进了细胞增殖，但却抑制了类固醇激素（E2、P4）的合成，表现为STAR和CYP19A1的下调。这种“促增殖、抑激素”的双重效应揭示了TSHB在卵泡发育早期可能扮演的重要角色，即通过促进GCs数量增加来为后续优势卵泡的选择和黄体化做准备，而非直接参与当下的类固醇合成。此外，TSHB对FSHR的上调作用暗示了其可能通过增强GCs对FSH的响应能力来间接调控卵巢功能。综上所述，该研究为多浪羊高繁殖力性状的遗传机制解析提供了新的分子靶点，并为家畜生殖内分泌调控网络的完善提供了理论依据。