来自沿海沙地的Bacillus stercoris的基因组导向抗菌潜力：该菌对包括耐多药金黄色葡萄球菌（MRSA）在内的多重耐药细菌具有抑制作用

《International Microbiology》：Genome-guided antimicrobial potential of Bacillus stercoris from coastal sand with activity against multidrug-resistant bacteria, including MRSA

　　摘要
沿海沙滩环境孕育着多样的细菌群落，但其抗菌潜力尚未得到充分探索。本研究通过体外、计算机模拟和离体实验，评估了来自巴西海滩沙子的细菌分离株2AT10的抗菌潜力。2AT10是一种杆状革兰氏阳性细菌，表现出广谱抗菌活性，其培养上清液对革兰氏阳性细菌（包括耐多药金黄色葡萄球菌（MRSA））具有更强的疗效。两种不同处理方式所得上清液的抗菌活性在热处理、酶消化和pH变化后均有所下降，表明其蛋白水解谱相似。傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测到C=O和NO?基团，表明存在酰胺官能团。重要的是，这些上清液在离体绒毛尿囊膜实验中未引起刺激。基因组分析确定2AT10属于粪肠杆菌（Bacillus stercoris），该菌含有编码亚叶酸菌素A（subtilosin A）、杆菌菌素（bacilysin）、杆菌杆菌菌素（bacillibactin）、杆菌烯（bacillaene）和类似乳酸菌素的细菌素（lactococcin）的基因，这些物质均具有抗菌活性。此外，还检测到sboA基因的突变，该基因参与亚叶酸菌素A的生物合成，并与体外溶血活性及对革兰氏阳性细菌的增强抗菌活性相关。分子对接和动力学分析表明，类似乳酸菌素的细菌素可能与金黄色葡萄球菌的磷转移酶系统转运蛋白的膜成分发生相互作用，可能增加膜通透性。

背景
随着传统抗菌药物耐药性的增加，近几十年的研究主要集中在发现新的抗菌化合物以对抗耐药微生物。细菌代谢产物（如细菌素、脂肽、铁载体和挥发性化合物）受到了广泛研究。细菌素是一种核糖体合成的抗菌肽，包括由乳酸球菌产生的乳酸菌素（lactococcin）和由芽孢杆菌产生的亚叶酸菌素（subtilosin）（?ahingil等人2011年，Dinesen等人2025年，Zhao等人2022年）。乳酸菌素和亚叶酸菌素已被证明能破坏细胞膜并对革兰氏阴性和阳性细菌具有显著活性（Martinez等人2000年，Algburi等人2017年，?ncül和Y?ld?r?m 2019年）。IIa类和IId类细菌素（如Lactococcin 972）是非乳杆菌素和非肽类细菌素，可以直接作用于磷转移酶碳水化合物转运系统（PTS）（Martinez等人2000年，Hernández-González等人2021年，Martinez等人1999年）。

沿海沙滩是全球数百万人的热门休闲场所，其中沙子中栖息着多种微生物。大多数相关研究关注的是沙子中致病微生物对人类健康的潜在威胁（Whitman等人2016年，Teixeira等人2020年，Degenhardt等人2020年）。最近的一项研究旨在表征沙滩微生物组的致病潜力，发现从该环境中分离出的细菌约有19.75%属于粪肠杆菌属（Bacillus），其中以耐盐粪肠杆菌（Bacillus halotolerans）、环状粪肠杆菌（Bacillus circulans）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）等物种为主（Soffritti等人2023年）。基于比较基因组分析，粪肠杆菌亚种stercoris最近被重新分类为独立物种Bacillus stercoris。该菌主要从土壤中分离得到，与植物和动物废弃物残留物相关（Singh等人2024年，Chouaia和Dittmer 2024年）。研究表明，B. stercoris产生的次级代谢产物与其他相关物种不同（Dunlap等人2020年）。多数文献探讨了该菌对植物病原菌（如胶孢壳霉（Colletotrichum gloeosporioides）、双叉壳针孢（Coniothyrium diplodiella）、镰刀菌属（Fusarium spp.）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的抑制作用，以及其促进植物生长的作用（Wang等人2021年，Pengproh等人2023年）。尽管已知芽孢杆菌属具有抗菌活性并能产生细菌素等化合物，但人们对B. stercoris的关注较少。本研究首次探讨了B. stercoris的基因组与其体外抗菌活性之间的关联，特别是其对多种耐抗生素细菌病原体（包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌作用。同时，首次通过计算机模拟分析了类似乳酸菌素的细菌素与金黄色葡萄球菌磷转移酶系统转运蛋白之间的相互作用。

方法
**样品采集与分离**
本研究使用了位于巴西阿拉卡茹（Aracaju-SE）Atalaia海滩（坐标10.997482，-37.052538）的沙样。样本从三个等距离点采集，深度分别为3厘米的干燥和湿润沙层，使用无菌Falcon管收集后冷藏待处理（Prashanthi等人2021年）。首先将2克沙样与10毫升磷酸盐缓冲液混合均匀，然后在20°C下以12,000 × g离心10分钟，取100微升上清液（未经稀释及稀释10^-2和10^-4倍）接种于KASVI?营养琼脂培养基上，37°C培养24小时（Khaleghi等人2019年）。对具有独特形态的细菌菌落进行抗菌性质检测。

**细菌菌株**
本研究使用的ATCC指示菌株包括大肠杆菌（Escherichia coli，ATCC 23226和ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 8095和ATCC 25923）、耐久肠球菌（Enterococcus durans，ATCC 551225）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853和ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，ATCC 13883）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii，ATCC 19606）。

**抗菌筛选**
首次筛选采用琼脂覆盖法（Carvalho等人2006年）。使用九种ATCC指示菌株进行抗菌活性检测，所有菌株均在37°C下于Nutrient Broth（NB，KASVI?）中过夜培养，浓度为1 × 10^8 CFU/mL。

**形态学特征与抗菌谱**
通过光学显微镜（Olympus? CX23）和对比相位显微镜（Olympus? CKX53）分析2AT10在营养琼脂和血液琼脂中的生长特性及革兰氏染色结果。抗菌谱检测按照临床和实验室标准协会（CLSI）标准进行。

**上清液的抗菌活性**
2AT10在NB培养基中于37°C下静态培养不同时间（12、24、48和72小时）。其抗菌活性首先使用两种上清液（S和SP）进行评估，方法参考de Carvalho等人（2006年）。选择该菌株作为指示菌是因为其在先前实验中表现出较高的敏感性。上清液S是通过在4°C下以12,000 × g离心25分钟获得的。离心后的细菌沉淀物重新悬浮于0.9%盐水溶液（pH 2）中，室温下搅拌1小时后再离心（12,000 × g，4°C）。从这一步获得的上清液即为SP组分。S和SP还接受了热处理（40°、50°、60°、70°、80°、90°C各20分钟和100°C 15分钟）、蛋白水解处理（用1 mg/mL蛋白酶K在37°C下处理1和2小时）及pH稳定性测试（Anvisa 2008年，Reda和Refaie 2019年）。这些处理后的S和SP的抗菌活性分别与未经处理的S和SP进行了比较。

**2AT10对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长与抗菌活性**
通过测定600 nm处的光密度（OD600）监测2AT10在37°C、静态条件下的生长情况，培养基为Luria-Bertani（LB）、NB和根据Jamil等人（2007年）方法制备的改良培养基（MOD）。如上所述，使用25 μL 0.5 OD的起始菌液在3 mL培养基中分析生长曲线。为了评估2AT10对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315的抗菌活性，在LB、NB和MOD培养基中分别于24、48和72小时收集上清液S。使用Amiri等人（2022年）描述的琼脂孔扩散法分析抗菌活性。随后，还使用其他耐抗生素临床细菌分离株作为抗菌敏感性指标。将2AT10在MOD培养基中于37°C下静态培养24小时，使用上清液S进行抗菌测试。

**上清液的傅里叶变换红外光谱分析**
使用配备钻石/硒化锌（ZnSe）晶体的傅里叶变换红外光谱仪（IRAffinity-1 S，Shimadzu，日本京都）进行FTIR分析，光谱范围为400–4000 cm^-1，分辨率为4 cm^-1，共扫描128次。数据使用Labsolutions软件（Yu等人2021年）进行处理。

**离体绒毛尿囊膜测试（HET-CAM）**
根据Luepke（1985年）、Palmeira-de-Oliveira等人（2018年）和Machado等人（2023年）的方案，使用受精鸡胚进行离体绒毛尿囊膜（HET-CAM）测试，以定性评估上清液S和SP的刺激性。NaOH（1 M）和NaCl（0.9%）溶液分别用作阳性及阴性对照。

**基因组测序、注释与组装**
2AT10在37°C、12,000 × g条件下过夜培养，离心后获取细胞沉淀物用于基因组DNA提取。使用Wizard? Genomic DNA Purification Kit（Promega Corporation，美国）进行DNA提取。基因组测序采用Illumina? HiSeq 2500平台（美国加州），使用ThruPLEX DNA-Seq Kit（Takara）构建150 bp配对末端文库。质量分析和序列修剪分别使用FastQC v. 0.12.1（https://github.com/s-andrews/FastQC）（Wingett和Andrews 2018年）和Fastp v. 0.23.3（https://github.com/OpenGene/fastp）（Chen等人2018年）进行。基因组组装使用Unicycler v. 0.5.0（https://github.com/rrwick/Unicycler）（Wick等人2017年）完成。CheckM2 v. 1.0.2（https://github.com/chklovski/CheckM2）（Chklovski等人2023年）用于评估基因组完整性及污染程度，GUNC v. 1.0.6（https://github.com/grp-bork/gunc）（Orakov等人2021年）用于识别污染片段。使用QUAST v. 5.0.2（https://github.com/ablab/quast）（Gurevich等人2013年）评估基因组片段化情况。MOB-suite v. 3.1.9（https://github.com/phac-nml/mob-suite）（Robertson和Nash 2018年）用于鉴定、组装和分类质粒及其他移动遗传元件。基因组数据存储在GenBank中，并使用NCBI PGAP（https://github.com/ncbi/pgap）进行注释（Gen Bank ID GCA_041765565.1，RefSeq ID GCF_041765565.1，Tatusova等人2016年）。

**分类鉴定与系统发育**
2AT10及相关基因组进行了两种分类鉴定。首先使用Type (Strain) Genome Server（TYGS，https://tygs.dsmz.de/）（Meier-Kolthoff和G?ker 2019）通过数字DNA-DNA杂交（dDDH）将查询基因组与类型菌株基因组数据库进行比较，同一物种的基因组dDDH值高于70%作为筛选标准。其次使用Genome Taxonomy Database Toolkit（GTDB-Tk，https://github.com/Ecogenomics/GTDBTk）（Chaumeil等人2019）通过平均核苷酸同一性（ANI）将基因组与GTDB（https://gtdb.ecogenomic.org/）进行比对，同一物种内的ANI值高于95%（Rodriguez等人2024年）。B. stercoris最初被归类为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的亚种（Dunlap等人2020年）。为支持其作为独立物种的重新分类，我们使用ANI和系统发育树将B. stercoris的基因组与枯草芽孢杆菌及其他五个近缘物种进行了比较。除了2AT10之外，还从GenBank（2024年7月）下载了另外16个B. stercoris的基因组，并对其进行了分类学和污染情况检查。ANI分析使用的是pyANI v. 0.2.12（https://github.com/widdowquinn/pyani）进行的。系统发育树是使用OrthoFinder v. 2.5.5（https://github.com/davidemms/OrthoFinder）构建的，参数设置为“-M msa -T fasttree”，这意味着使用MAFF v7.525进行多序列比对，使用FastTree v. 2.1.11进行系统发育推断。Bacillus amyloliquefaciens DSM7（GCF_000196735.1）被用作外群，树状图使用itol（https://itol.embl.de/）进行可视化（表S2）。

**次级代谢产物预测**
次级代谢产物的预测最初是通过antiSMASH 7.0（https://antismash.secondarymetabolites.org/）（Medema等人，2011年）生成的。此外，还使用了全基因组功能注释工具eggNOG mapper（http://eggnog-mapper.embl.de/）（Cantalapiedra等人，2021年）来识别可能参与次级代谢产物产生的代谢途径。UniProt（https://www.uniprot.org/）和Blastp（blast.ncbi.nlm.nih.gov）被用来验证eggNOG mapper的预测结果。此外，还使用BAGEL 4工具（http://bagel4.molgenrug.nl/）（de Jong等人，2006年）来识别细菌素和RiPP基因。为了评估sbo-alb位点基因的突变，使用Jalview 2.11.4.1（https://www.jalview.org/）将2AT10基因组中相应基因的氨基酸序列与UNIPROT数据库（https://www.uniprot.org）中的所有相关基因进行了比较。

**计算生物活性预测**
在B. stercoris基因组中发现的一种乳球菌素家族成员（BsLac）的结构使用Alphafold 3服务器（https://alphafoldserver.com/）（Abramson等人，2024年）进行了建模和验证。此外，BsLac的3D结构经过了5000轮共轭梯度能量最小化处理，随后使用GROMACS 2025（Spoel等人，2005年）进行了两个等压（1 ATM）和等温（310 K）分子动力学（MD）平衡步骤，每个步骤持续1纳秒（ns）。此外，在相同条件下进行了5 ns的稳定性MD模拟，以解决蛋白质结构中的任何冲突。

**研究BsLac对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的潜在作用机制**
我们分析了GlcB（UniProt ID: Q7A3G4）的3D结构，以评估BsLac阻断负责葡萄糖转运到细菌细胞质中的TM7区域的能力（McCoy等人，2016年）。此外，还使用BsLac的氨基酸序列在UniProt数据库中进行了BLASTp搜索，以评估其与IId类乳球菌素的相似性。同源序列进一步使用Clustal Omega服务器（Sievers和Higgins，2018年）进行了比对。

**蛋白质分子对接**
为了进行分子对接，定义了GlcB TM7区域的氨基酸。为此，使用了来自B. cereus BcMalT麦芽糖转运蛋白的模板5IWS（McCoy等人，2016年），因为它与GlcB具有同源性，并使用ChimeraX（Pettersen等人，2004年）进行了结构比对，其中5IWS中的保守氨基酸His240对应于GlcB结构中的Gly239，以及Ser234和Leu240。因此，该区域被定义为与BsLac对接的GlcB TM7区域。对接计算使用HADDOCK服务器（Honorato等人，2024年）进行，针对GlcB的TM7区域，并使用默认参数。最佳复合物是根据最低的对接得分以及BsLac结构在GlcB TM7口袋中的位置来选择的。

**稳定性MD模拟**
最佳的GlcB-BsLac复合物使用GROMACS 2025进行了500 ns的稳定性MD模拟。使用CHARMM-GUI服务器（Park等人，2023年）准备了该复合物。蛋白质经历了5000轮共轭梯度能量最小化处理，随后在恒定体积和温度（NVT）下进行了1 ns的平衡动力学步骤，以及在连续压力和温度（NPT）下进行了第二个平衡步骤，两者都使用了Berendsen恒温器（Lemkul，2018年）。此外，还使用上述相同的温度和压力参数进行了500 ns的稳定性MD模拟。复合物的稳定性通过GlcB TM7区域的整体骨架RMSD和同一区域内氨基酸的波动来衡量。此外，还评估了MD模拟过程中形成的氢键数量和系统的能量。

**统计分析**
所有实验都重复进行了三次，并在至少两个独立的实验中进行了验证。结果以生物重复实验的平均值±标准偏差表示。对于吸光度测量，数值被归一化到对照条件。组间统计差异使用双因素（2-way）ANOVA进行分析。对于细菌生长和抗菌活性的分析，比较了培养时间和上清液类型；对于生长的统计分析，比较了时间和培养基；对于热处理、pH值和酶处理，比较了处理组和对照组。当检测到显著效应时，使用Tukey的事后检验来确定组间的成对差异。统计显著性标准为p < 0.05。所有分析都是使用GraphPad Prism（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行的。

**细菌分离株和抗菌潜力**
共获得了八个形态不同的菌落，其中只有分离株2AT10因其卓越的抗菌活性而被选为进一步研究对象。分离株2AT10抑制了ATCC指示菌株的生长，如金黄色葡萄球菌（S. aureus）、表皮葡萄球菌（S. epidermidis）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和大肠杆菌（E. coli）（图S1）。对于耐久肠球菌（E. durans）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和鲍曼不动杆菌（A. baumannii）没有观察到显著的抑制作用（表1）。

**表1 Atalaia Beach分离株2AT10的抑制谱，使用琼脂覆盖法**
**全尺寸表格**

**2AT10的革兰氏染色和光学显微镜分析**
确定2AT10是一种产孢的、杆状的、革兰氏阳性细菌（图1A，B）。在固体培养基上，2AT10生长为边缘不规则的干燥白色菌落（图S2）；在液体培养基中，在静态生长条件下观察到了生物膜的形成。在血琼脂上，2AT10表现出α-溶血性。此外，2AT10对所有测试的抗生素都敏感（表S3）。

**图1**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**
显微镜图像：(a) 2AT10营养细胞的40倍光学图像；(b) 100倍对比相下的孢子图像。

**2AT10来源上清液的抗菌活性**
上清液S和SP在测试不同培养时间后显示出对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抗菌活性（表2）。所有后续分析选择了48小时的培养时间。

**表2**
使用琼脂扩散法测量2AT10来源上清液S和SP对金黄色葡萄球菌ATCC 25923的抑制圈直径。上清液是在NB培养基中，在不同培养时间（12、24、48和72小时）下静态条件下获得的。

**2AT10来源上清液的酶学、热稳定性和pH稳定性**
一种革兰氏阳性菌株（金黄色葡萄球菌ATCC 25923）和一种革兰氏阴性菌株（铜绿假单胞菌ATCC 27853）在初步抗菌测试中显示出阳性结果。经过蛋白酶K处理后，S和SP组分对金黄色葡萄球菌ATCC 25923和铜绿假单胞菌ATCC 27853的抗菌活性降低（图2；表S4）。此外，活性随酶处理时间的延长而逐渐减弱。结果表明，这两种上清液可能具有相似的蛋白水解代谢特征。值得一提的是，SP（来自沉淀物的上清液）可能只含有在1小时搅拌过程中仍附着在细菌膜上并在0.9%盐水（pH 2）中分离出来的分子（Todorov，2009）。

**图2**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**
与2AT10来源上清液对金黄色葡萄球菌ATCC 25923（左侧面板）和铜绿假单胞菌ATCC 27853（右侧面板）的抗菌活性相关的图表，分别经过（a）热处理、（b）酶处理和（c）pH处理后的结果。C1代表未经处理的上清液S；C2代表未经处理的沉淀物上清液SP；S1代表经处理的上清液S；S2代表经处理的沉淀物上清液SP。对照组和处理组的抗菌活性有统计学差异（双因素ANOVA，p < 0.05）。条形的缺失表示处理后活性完全丧失。

**图2**
如图2所示，热处理降低了S和SP对两种指示菌株的抗菌活性。温度的影响在较低范围内有限，40°C时活性降低了26–42%，50°C时降低了43–60%。当暴露于60°C和70°C时，S和SP的初始抑制活性仅保留了15–35%，而暴露于80°C和100°C时则完全丧失了抗菌活性。上清液S在40°C时显示出更大的热敏感性，而SP的活性降低始于60°C。从酶学角度来看，两种上清液都比热处理和pH条件更稳定。在所有测试的pH条件下，S和SP的抗菌活性都降低了。

**对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌潜力**
还评估了培养基对2AT10生长和抗菌活性的影响。为此，2AT10在三种不同的培养基（LB、NB和MOD）中进行了培养，并使用上清液S进行了抗菌测试（表3；图S3）。LB中的光密度高于NB和MOD，但生物量的增加并未促进抗菌活性。总体而言，MOD中的细菌生长显示出比LB和NB更大的抗菌活性，两者之间存在统计学差异（双因素ANOVA，p < 0.0001）。这些结果表明，观察到的体外抗菌活性并不严格依赖于细胞数量。

**表3**
使用孔扩散法测量了在Luria-Bertani肉汤（LB）、营养肉汤（NB）和改良培养基（MOD）中培养24、48和72小时后的2AT10上清液S对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌N315的抗菌活性。全尺寸表格。

**表4**
总结了2AT10对各种临床相关、耐抗生素病原菌的抗菌活性。在耐甲氧西林和耐万古霉素的临床分离株中观察到了生长抑制。值得注意的是，与通过密切接触传播的皮肤感染相关的金黄色葡萄球菌P333（LV CA MRSA）表现出最显著的抑制圈，其次是其他MRSA临床分离株（Sassi等人，2017年）。结果与耐甲氧西林葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus的分离株相似。相反，耐万古霉素的肠球菌和革兰氏阴性细菌没有表现出活性。这些结果支持细菌上清液与更强的抑制效应之间的关联，主要针对葡萄球菌属（Staphylococcus sp.），无论其是否具有抗生素抗性。

**上清液的FTIR谱**
尽管两种上清液显示出相似的整体FTIR谱，但在光谱特征上观察到了细微差异。在2300–3700 cm?1区域，SP的透射率值低于S，表明两种粗混合物的整体组成或化学成分浓度存在差异（图S4）。在SP中观察到一个接近1531 cm?1的带，而在S中不存在；虽然这个区域通常与N–O伸缩振动相关，但在复杂混合物中的归属仍然不确定。在SP中，一个大约3250 cm?1的宽带与O–H伸缩相关，通常与含羟基的化合物或水相关。在两个样本中都存在一个接近1637 cm?1的带，这是C = O伸缩或N–H弯曲模式的特征。此外，SP在2000 cm?1以上的区域显示出较低的透射率，进一步支持了两种上清液之间的组成差异。然而，由于这些样本是未分馏的混合物，光谱反映了多个组分的重叠信号。因此，这些特征应被视为一般的化学指纹，而不是特定代谢物的证据。

**2AT10来源上清液的非刺激性效应**
S和SP对鸡蛋膜没有显示出任何改变，完全没有刺激性。用阴性对照处理的膜也没有显示出预期的改变，而阳性对照在暴露后的30秒内产生了强烈的出血现象（图3）。

**图3**
此图像的替代文本可能是使用AI生成的。

**全尺寸图像**
鸡蛋绒毛尿囊膜在0秒、30秒、2分钟和5分钟时分别用2AT10来源的上清液S和SP以及相应的阴性（NaCl 0.9%）和阳性（NaOH 1 M）对照处理后的情况。

**分类学鉴定和系统基因组学**
2AT10基因组（Gen Bank ID GCA_041765565.1，RefSeq ID GCF_041765565.1，访问号JBEMBP00000000）通过TYGS和GTDB-TK被分类为B. stercoris，其DDH和ANI值分别高于70%和95%，与类型菌株相比。该基因组被组装为一个草图基因组，包含40个contig，4,108,661 bp，GC含量为43.74%，且没有质粒。基因组注释共识别出4,156个编码蛋白质的基因（CDS基因）、70个tRNA基因、5个rRNA基因（其中1个完整，4个部分缺失）以及106个假基因。关于B. stercoris 2AT10基因组序列的最低限度信息（MIGS）详见表S5。本研究中分析的所有16个公开的B. stercoris基因组均被归类为B. stercoris。B. subtilis类型菌株与B. stercoris基因组之间的ANI值在95.18%到95.35%之间，而B. stercoris基因组内部的ANI值则在98.5%到99.99%之间。通过比对1,254个共有蛋白质构建的系统发育树显示，所有B. stercoris菌株属于同一个分支，而B. subtilis则属于另一个分支（见图4）。

图4：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**全尺寸图像：**
(a) ANI热图显示了Bacillus stercoris及其他Bacillus物种（包括Bacillus amyloliquefaciens DSM7、Bacillus inaquosorum KCTC 13429、Bacillus spizizenii TU-B-10、Bacillus subtilis ATCC 6051、Bacillus tequilensis NCTC 13306、Bacillus vallismortis DSM 11031）之间的相似性。
(b) B. stercoris与其他Bacillus物种的系统发育树。该树是通过使用OrthoFinder v. 2.5.5工具，并设置参数“-M msa -T fasttree”，基于1,254个单拷贝基因的比对结果构建的。

**2AT10基因组中编码次级代谢产物的基因**
使用antiSMASH 7.0和BAGEL 4.0的分析工具，共识别出12个与次级代谢产物生成相关的生物合成基因簇（BGCs）。其中，非核糖体肽合成酶（NRPS）和III型聚酮合成酶（T3PKS）最为常见（见表5）。属于RiPP类的sactipeptide簇（代表在核糖体上合成并在翻译后修饰的肽）也显示出与已知抗菌蛋白subtilosin A的100%序列相似性（见图S5、S6）。在2AT10基因组中预测到了与subtilosin A生成相关的sboA-alb操纵子。将sboA基因与B. subtilis菌株中的sboA基因进行比对后，发现存在Huang等人（2009年）先前描述的相同突变，即第6位氨基酸从苏氨酸替换为异亮氨酸。此外，参与subtilosin A生物合成的albG和albD调控蛋白与UniProt数据库中同源序列相比，分别发生了15个和6个氨基酸的替换（见表S6）。

**表5：** 使用antiSMASH分析得到的基因簇及其相关信息（类型、大小、在基因组中的位置、最相似的已知基因簇以及相似度）。

表5中观察到的一些低相似度可能与特定化合物相关基因簇中的基因数量较少有关。被归类为“其他”或“RiPP-like”的基因簇（例如与1-碳青霉烯-2-Em-3-羧酸相关的基因簇，相似度为16%）虽然不常见于革兰氏阳性菌株中，但也确实存在。此外，使用EggNOG映射器功能注释工具（补充数据集S1）发现了一个与乳球菌素生成相关的基因（本文中称为BsLac），其e值为1.67e-66，bit得分为210，表明其与功能已知的同源物具有高度序列相似性。序列同源性分析（见图S7a）证实了100%的覆盖率和40%的氨基酸一致性，该基因与来自Lactococcus的Lactococcin 972家族细菌素具有相似性（NCBI ID: WP_017863933.1）。

**计算生物活性预测**
对于GlcB-BsLac蛋白复合物的分子对接分析显示，其能量值为-114 Kcal/mol，其中BsLac的末端卷曲区域（Met1至Asp27）位于GlcB蛋白的TM7结构域内（见图5a和b）。详细的对接可视化结果（见图5c）表明，BsLac可能通过其外膜面与GlcB转运蛋白结合，其C末端卷曲区域靠近GlcB的TM7螺旋结构。有趣的是，这种对接位置与用于定义GlcB对接区域的模板蛋白（5IWS）相似（见图S7a和b的结构比对）。

**图5：** 该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。

**全尺寸图像：**
(a) GlcB（蓝色）与BsLac（粉色）复合物的整体对接位置。其中，TM7结构域内的螺旋氨基酸Arg233、Ser234和Gly239用黄色标出。
(b) BsLac（粉色）的整体对接位置，以表面模式显示GlcB（蓝色）的结构。该视图显示BsLac的整个末端卷曲区域位于TM结构域内，特别是TM7螺旋结构内。
(c) BsLac（粉色）卷曲区域在GlcB（蓝色）TM结构域内的详细视图，其中Arg233、Ser234和Gly239等氨基酸被标出。

**分子动力学稳定性分析**
GlcB-BsLac复合物的分子动力学模拟结果显示，在500纳秒的模拟过程中，BsLac始终位于GlcB蛋白的TM结构域内，靠近预测的对接位置。此外，比较GlcB的Apo形式（无蛋白结合状态）和Holo形式（结合有BsLac的形式）的RMSD图（见图S8A）表明，在前250纳秒内，Holo形式的RMSD值有所增加，这可能表明BsLac的末端卷曲结构诱导了转运蛋白的闭合状态。进一步分析RMSF图（见图S8B）发现，与TM7结构域和活性位点相关的关键氨基酸在复合物中的波动较小，表明BsLac的存在可能阻碍了葡萄糖的通过。此外，两种蛋白质在模拟过程中的氢键数量保持稳定，每100皮秒帧内平均有2到20个氢键（见图S8C、S8D）。

**Lennard-Jones和Coulomb参数下的GROMACS能量计算**
Lennard-Jones和Coulomb参数的计算结果显示，复合物形式（Holo形式）在两种情况下都具有能量优势（见图S8E、S8F），能量值分别为-6.1×10? kJ/mol至-6.5×10? kJ/mol和-4.22×10? kJ/mol至-4.18×10? kJ/mol。这些数据表明GlcB-BsLac复合物在能量上优于Apo形式。此外，系统的总能量也为负值，表明两者之间的相互作用是可能的。

**讨论**
关于B. stercoris的研究相对较少，这可能与其最近的重新分类有关。这一分类突显了它与B. subtilis之间的密切进化关系，表明这两种物种在基因组功能和潜在微生物活性方面可能存在相似性（Chouaia和Dittmer 2024，Dunlap等人2020）。从2014年（首次提交基因组数据）到2024年，共有17个B. stercoris或B. subtilis subsp. stercoris的基因组被提交到GenBank。其中只有4个基因组的相应数据被发表在科学论文中。关于这些物种的首批报道出现在2019年的PubMed上，到2024年已有21篇相关文章。在这些出版物中，有8篇专门探讨了它们的抗菌潜力。其中只有2篇将基因组数据与体外分析结果进行了关联，其余文章则关注生物技术应用，尤其是酶活性和耐受性。

本研究中的2AT10分离株被鉴定为B. stercoris，显示出对多种ATCC参考菌株及耐药临床细菌分离株（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌）的强体外抗菌活性，包括多种耐药的金黄色葡萄球菌分离株。研究表明，由于革兰氏阴性菌具有外膜，其对抗菌剂的敏感性较低，这可能是抑制谱较窄的原因（Lehman和Grabowicz 2019，MacNair和Brown 2020）。本研究中观察到的体外抗菌活性可能与基因组中预测的多种代谢产物的共同作用有关；然而，这些代谢产物的具体贡献仍需通过实验确定（Chouaia和Dittmer 2024，Wang等人2021，Ye等人2023，Ku等人2024）。

本研究中分析的上清液对革兰氏阳性菌的抗菌活性更为显著，这可能与参与subtilosin A生物合成的sboA基因突变有关；然而，在缺乏化合物水平验证的情况下，这种关系仍属推测。Huang等人（2009）的研究首次报道了sboA基因中的这一突变，并发现该突变与对革兰氏阳性菌的增强抗菌活性相关。2AT10基因组中预测的sboA-alb操纵子与乳球菌素生成相关，其e值为1.67e-66，bit得分为210，表明与功能已知的同源物具有高度序列相似性。序列同源性分析（见图S7a）证实了100%的覆盖率和40%的氨基酸一致性，与Lactococcus中的Lactococcin 972家族细菌素具有相似性（NCBI ID: WP_017863933.1）。

**结论**
尽管关于B. stercoris的研究有限，但这可能与其最近的分类变更有关。这一分类强调了它与B. subtilis之间的密切进化关系，表明两者在基因组功能和潜在微生物活性方面可能存在相似性（Chouaia和Dittmer 2024，Dunlap等人2020）。从2014年到2024年，共有17个B. stercoris或B. subtilis subsp. stercoris的基因组被提交到GenBank，其中只有4个基因组的相应数据被发表在科学论文中。关于这些物种的首批报道出现在2019年的PubMed上，到2024年已有21篇相关文章。其中8篇论文专门研究了它们的抗菌潜力。在这些出版物中，只有2篇将基因组数据与体外分析结果进行了关联，其余论文则关注生物技术应用，特别是酶活性和耐受性。

本研究中的2AT10分离株表现出对多种ATCC参考菌株及耐药临床细菌分离株（包括革兰氏阳性和革兰氏阴性菌）的强体外抗菌活性，包括多种耐药的金黄色葡萄球菌分离株。研究表明，由于革兰氏阴性菌具有外膜，其对抗菌剂的敏感性较低，这可能是抑制谱较窄的原因（Lehman和Grabowicz 2019，MacNair和Brown 2020）。本研究中观察到的体外抗菌活性可能与基因组中预测的多种代谢产物的共同作用有关；然而，这些代谢产物的具体贡献仍需通过实验验证（Chouaia和Dittmer 2024，Wang等人2021，Ye等人2023，Ku等人2024）。

本研究中分析的上清液对革兰氏阳性菌的抗菌活性更为显著，这可能与参与subtilosin A生物合成的突变sboA基因有关；然而，在缺乏化合物水平验证的情况下，这种关系仍属推测。Huang等人（2009）的研究首次报道了sboA基因中的这一突变，并发现其与对革兰氏阳性菌的增强抗菌活性相关。萜烯簇（与碳青霉烯类抗生素相关）常见于革兰氏阴性菌中，如Serratia sp.和Erwinia sp.（Bycroft等人1988）。2AT10基因组中的萜烯簇（相似度为16%）可能代表尚未被充分研究的新的生物合成途径（McGowan等人1997）。蛋白酶处理后抗菌活性的降低表明，蛋白质成分对两种上清液（S和SP）的生物活性有贡献。这一观察结果与FTIR数据一致，后者表明这些上清液中含有与蛋白质混合物相关的功能基团（Villa-Rodriguez等人2021，Mujaddidi等人2021，Yadav等人2023）。Fugaban等人（2024）和Amiri等人（2022）的研究也发现，B. stercoris和Bifidobacterium lactis的上清液具有酶活性和热敏感性，并且对pH变化敏感。值得注意的是，B. stercoris 2AT10基因组中的许多次级代谢产物基因簇（如bacillaene和fengycin）对温度敏感（Li等人2021，Gimenez等人2021），而subtilosin A和bacilysin则具有热稳定性、酶稳定性和pH稳定性（Alajlani 2022，Abdulmalek和Yazgan-Karata? 2023）。我们推测S和SP上清液之间的差异可能与用于代谢产物回收的方法不同有关：S上清液可能含有细菌生长过程中主动分泌的化合物，如脂肽和其他可扩散分子，而SP上清液则富含在洗涤步骤中释放的膜相关化合物。

S和SP上清液在HET-CAM测试中均未表现出刺激性。其他研究（如Wang等人2024）也使用HET-CAM方法发现，微生物代谢产物通常不具有刺激性。许多具有抗生素特性的物质（如四环素）会对鸡胚尿囊膜产生轻微刺激作用，而氨苄西林的刺激性更强（Hut等人2021）。HET-CAM方法因其高度血管化和功能性膜结构而被认为是可靠的替代方法，其优势在于快速、经济且无动物实验需求。此外，MTT等定量方法也可用于评估毒性水平。尽管如此，HET-CAM方法的成本较低且产生的有毒废物较少，因此是一个可行的选择（Uner等人2023）。

使用antiSMASH和BAGEL进行的基因组挖掘识别出多个与已知生物合成基因簇高度相似的基因簇。相比之下，BsLac蛋白并未被这些工具识别为典型的生物合成基因簇的一部分。其鉴定是基于EggNOG-mapper的功能注释，该工具显示其与Lactococcin 972家族成员具有显著序列相似性。这种注释方法依赖于基于同源性的推断，而非保守的基因簇结构。antiSMASH和BAGEL工具未能检测到BsLac，可能反映了当前数据库中某些较少被研究的细菌素类别或非典型遗传组织的代表性不足（Medema等人2011，Cantalapiedra等人2021）。由于Lactococcins在Bacillus属中的研究较少，因此本研究提出BsLac可能是B. stercoris中的新蛋白质。Lactococcus产生的lactococcin 972与BsLac之间的结构比对显示40%的氨基酸一致性，表明这两种蛋白质在功能上具有保守性。

磷酸转移酶系统（PTS）转运蛋白可以介导多种糖类（如葡萄糖和甘露糖）的摄取和磷酸化（Ge等人2024）。PTS转运蛋白的膜整合成分（在本研究中以金黄色葡萄球菌的GlcB为代表）通常作为II类细菌素的受体（Jeckelmann和Erni 2020）。此外，Lactococcin 972属于IId类细菌素，据报道它通过直接作用干扰PTS（磷酸转运系统）来破坏乳酸菌的细胞膜（Hernández-González等人2021年，Holo等人1991年，Li等人2023年）。PTS转运蛋白在金黄色葡萄球菌（S. aureus）等革兰氏阳性细菌中较为常见。在本研究中，由于UniProt中仅提供了与S. aureus相关的PTS转运蛋白结构GlcB的数据（研究主要关注体外实验结果），我们进行了计算机模拟分子对接和动力学分析，预测BsLac与GlcB之间存在相互作用，这可能解释了我们在实验中观察到的更强抗菌活性；然而，目前尚无直接证据将这种预测的相互作用与体外观察到的抗菌活性联系起来。我们的一个假设是，BsLac与GlcB的结合可能导致细胞内及跨膜成分的泄漏，这些成分对细胞膜的完整性至关重要，其机制可能是通过增加通透性和诱导孔洞形成实现的（Zhu等人2022年，Li等人2023年）。革兰氏阴性细菌缺乏PTS系统，这可能是导致其体外抗菌活性较低的原因之一。

不同研究者指出，II类乳酸菌素的C端环区通常负责阻断PTS转运机制（Hernández-González等人2021年，Li等人2023年，Tymoszewska和Aleksandrzak-Piekarczyk 2024年）。如图S7所示，这类乳酸菌素的C端区域通常通过面向外膜的一面穿透蛋白质受体，并到达跨膜区域（Li等人2023年，Tymoszewska和Aleksandrzak-Piekarczyk 2024年）。此外，与其他IId类细菌素的研究类似，我们可以推测BsLac可能通过与S. aureus的葡萄糖PTS转运蛋白相互作用，阻断该蛋白的开启-关闭状态机制，这一机制对葡萄糖的吸收至关重要（如5IWS模板所描述的那样）。正如我们的研究所示，BsLac进入靠近TM5和TM7区域的C端区域后，可能会使该受体永久性关闭，从而阻止糖分进入细菌细胞质（McCoy等人2016年）。

尽管尚未有明确的报道说明乳酸菌素对S. aureus的体外或计算机模拟实验中的抗菌活性，但多项研究表明它们在乳酸菌共培养中对这种病原体具有潜在作用（Hasan等人2025年，Yaacob等人2022年，Darbandi等人2022年）。例如，乳酸菌素A、B和M对乳酸菌属（Lactococcus）有效，而来自L. lactis的乳酸菌素BZ能抑制单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和大肠杆菌（Escherichia coli）的生长（Darbandi等人2022年，Yildirim等人2016年，?ncül和Y?ld?r?m 2019年）。从Bacillus velezensis中分离并纯化的类似Lactococcin 972的细菌素Lcn972对多种芽孢杆菌属（Bacillus spp.）和与土壤病原菌相关的链霉菌属（Streptomyces spp.）具有抗菌活性（Zhao等人2022年）。我们的计算机模拟分析首次初步揭示了预测的乳酸菌素样蛋白（BsLac）与S. aureus中的GlcB之间可能的相互作用，提示了一种潜在的作用机制，但仍需通过实验验证。

已知乳酸菌素和亚枯草菌素A能够破坏细胞膜（Tymoszewska和Aleksandrzak-Piekarczyk 2024年），因此它们的联合使用可能会增强膜破坏作用并增加细菌细胞死亡。基于此，我们推测BsLac和亚枯草菌素A之间可能存在协同效应，从而增强对革兰氏阳性细菌的抗菌活性；不过这一推测仍需通过实验验证。

结论：从海岸沙子中分离得到的产孢革兰氏阳性菌株Bacillus stercoris 2AT10表现出显著的抗菌活性，尤其是对包括耐甲氧西林的MRSA在内的革兰氏阳性细菌。观察到的生物活性主要来源于细菌生长过程中产生的多种代谢产物。基因组分析显示该菌株含有多个与已知抗菌化合物相关的生物合成基因簇，这支持了其作为生物活性分子来源的潜力。此外，通过功能注释鉴定出一个类似乳酸菌素的序列，但其生产和抗菌活性以及其对观察到的抗菌效果的贡献仍需通过实验验证。计算机模拟分析提示预测的乳酸菌素样蛋白（BsLac）可能与S. aureus中的膜相关转运蛋白发生相互作用。然而，这些发现仍处于假设阶段，应谨慎解读，因为目前尚无直接实验证据支持这种相互作用或其抗菌作用。鉴于B. stercoris的分类变更和对其特性了解有限，需要进一步研究以分离和鉴定活性化合物，验证其作用机制，并确定其潜在应用价值。未来的工作应侧重于化合物纯化、定量活性评估以及预测分子相互作用的实验验证。