与病毒性病原体（泰勒鼠脑脊髓炎病毒）的共感染倾向于提高宿主的耐受性，但显著增强了宿主对贝克利氏血吸虫（Heligmosomoides bakeri）的抵抗力

《Veterinary Research Communications》：Co-infection with a viral pathogen (Theiler’s murine encephalomyelitis virus) tended to improve host tolerance but significantly enhanced resistance to Heligmosomoides bakeri

　　摘要
宿主清除寄生虫的能力（抵抗力）以及减少特定寄生虫负担影响的能力（耐受性）通常在单一病原体感染的情况下进行描述。我们开发了一种小鼠感染模型，以研究共感染对宿主对Heligmosomoides bakeri的抵抗力和耐受性的影响。C57BL/6小鼠被感染了寄生虫H. bakeri和Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒（TMEV），这两种病原体都存在于小肠中。我们使用了两种感染方案来研究病原体接种顺序对宿主抵抗力和耐受性的影响（H-V方案：先感染寄生虫；V-H方案：先感染病毒）。实验中还包括了未感染的对照组、仅感染H. bakeri的小鼠以及仅感染TMEV的小鼠。我们的数据显示，在H-V方案下，宿主对H. bakeri的抵抗力显著增强，表现为恢复的H. bakeri数量减少了30%（p = 0.023），结肠中的虫卵数量减少了57%（p = 0.035），与仅感染H. bakeri的小鼠相比。此外，与仅感染H. bakeri的小鼠相比，宿主对H. bakeri感染的耐受性也提高了39%（p = 0.052）。虽然H-V方案对宿主抵抗力的积极影响更为明显，但在V-H方案中的效果不那么显著。我们的假设——即宿主的抵抗力和耐受性会因病原体负荷增加而降低——被推翻，这对疾病控制具有重要的意义。

引言
宿主有两种可能的机制来抵御病原体感染：抵抗力（清除病原体的能力）和耐受性（抑制病原体对生产力和健康状况影响的能力）（Medzhitov 2007；Svensson和R?berg 2010；Hayward等人2014；Lough等人2015）。抵抗力和耐受性的测量方法有根本不同。抵抗力是根据宿主体内的病原体负荷（每个个体或每种组织类型）来衡量的；一般来说，在相似的病原体暴露或接种条件下，病原体负荷较低的个体被认为具有更强的抵抗力（R?berg等人2009）。另一方面，耐受性通常表现为宿主健康状况或表现特征与体内病原体负荷之间的回归斜率；在相似的病原体暴露或接种条件下，更陡峭的负斜率表明个体具有更强的耐受性（Simms 2000；McNew等人2019）。在感染研究中，耐受性并不经常被测量；尽管一些研究报告了感染对表现的影响，但很少有研究明确考虑表现与体内病原体负荷之间的关系。量化宿主对感染的耐受性与确定其抵抗力同样重要，因为具有耐受性的个体即使在严重感染的情况下也能保持较高的表现。

在寄生虫学领域，迄今为止许多关于宿主抵抗力和耐受性的研究仅限于单一病原体感染，而实际上宿主往往同时感染多种病原体（Cox 2001；Susi等人2015）。到目前为止，共感染对宿主抵抗力和耐受性的影响以及可能影响这些因素的研究还很少且理解不足。有研究表明，涉及的病原体类型、感染时间、病原体的生态位以及它们在宿主体内的复制方式可能会影响这种影响，但具体模式并不一致。更好地理解共感染对宿主防御机制的影响对于有效的疾病控制至关重要。

在本研究中，我们旨在量化共感染和病原体感染顺序对感染Heligmosomoides bakeri的小鼠的抵抗力和耐受性的影响，作为经常面临多重病原体挑战的牲畜的模型。H. bakeri自然存在于小鼠体内，并已被用作人类和牲畜慢性肠道线虫感染的模型（Behnke等人2009）。由于C57BL/6小鼠对H. bakeri感染的反应较慢，因此它们是研究牲畜寄生虫感染的良好模型（Athanasiadou等人2015）。第二种病原体是Theiler’s鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）。TMEV是一种单链正链RNA病毒，属于Picornaviridae科的Cardiovirus属。TMEV是一种神经趋向性的肠道啮齿动物病原体，通过口-粪途径传播。尽管TMEV在胃肠道中的细胞趋向性尚不清楚，但有证据表明它与肠道表面的黏液密切相关，并且已被证明可以与杯状细胞结合（Tsunoda等人2009）。H. bakeri和TMEV都可能导致亚临床疾病（Oleszak等人2004；Maizels等人2012），这是导致牲畜生产力和效率下降的主要原因之一（Houdijk等人2017）。先前的证据表明，肠道蠕虫与病毒的共感染会损害宿主的抵抗力，因为它会增强肠道病毒（如鼠诺如病毒和鼠星状病毒）的感染和传播（Desai等人2021综述）；关于病毒病原体对蠕虫负荷的影响，现有证据较少。使用TMEV作为模型病毒病原体，使我们能够测试我们的假设：与H. bakeri处于相同生态位的细胞内病原体的共感染会损害宿主的反应、对H. bakeri的抵抗力和耐受性。我们还假设病原体的接种顺序会影响宿主抵抗力的表现，因为这可以通过寄生虫学参数来衡量。

材料与方法
实验动物和饲养
该实验获得了苏格兰农村学院（SRUC）、英国伦理审查委员会（ED AE 09/2017）的批准，并在内政部的授权下进行（PPL 60/4935）。共提供了65只雌性C57BL/6小鼠（由繁殖公司确定大约5周大），饲养在温度为21±1°C、光照周期为12:12小时（07:00–19:00 h）的房间中。选择雌性小鼠是因为它们比雄性小鼠更不易感染蠕虫（Sellau等人2024），因此研究结果可能具有更广泛的意义。小鼠被分组饲养在底部有硬质材料的笼子中（每笼5只），每周提供新鲜的垫料，并用碎纸作为环境丰富物。小鼠可以自由摄取标准维持饲料（14%粗蛋白；Special Diet Services，Lillico Biotechnologies，英国）。

感染方案和实验设计
实验包括以下每种处理组的两个生物学重复实验（即不同的笼子）。
实施了两种感染方案，以确定病原体暴露顺序是否会影响共感染对小鼠抵抗力和耐受性的影响（图1）。在H-V感染方案中，首先接种H. bakeri（H），然后接种TMEV（V）；而在V-H感染方案中，首先接种TMEV，然后接种H. bakeri。在每种感染方案中，小鼠暴露于四种感染情况之一：每种病原体单独感染（仅H. bakeri或仅TMEV）、两种病原体共同感染（共感染，Co-inf）或假感染对照组（sham Con）。H. bakeri感染是通过口服灌胃给予250个L3期感染幼虫（悬浮在0.2毫升水中）（Houdijk和Bünger 2007）。TMEV感染是通过口服灌胃给予10^6个plaque形成单位（p.f.u）的无毒TMEV BeAn菌株（感谢Fragkoudis博士提供），该菌株悬浮在0.2毫升Dulbecco改良Eagles培养基（DMEM）中（Kang等人2007）。选择这些剂量的TMEV和H. bakeri是为了达到亚临床感染水平，因为已知这种感染会影响小鼠的生长（Oleszak等人2004；Kang等人2007；Houdijk和Bünger 2007）。

实验设计
C57BL/6小鼠接受了两种共感染方案。在H-V方案中（n = 10），小鼠在第0天（D0）口服给予0.2毫升250个H. bakeri第三期感染幼虫（L3），第8天（D8）给予0.2毫升10^6 PFU TMEV或DMEM。在V-H方案中（n = 10），小鼠在第0天（D0）口服给予0.2毫升10^6 PFU TMEV或DMEM，第1天（D1）给予0.2毫升250个H. bakeri第三期感染幼虫（L3）。对照组小鼠（n = 5）在第0天（D0）口服给予0.2毫升水，第8天（D8）给予DMEM。根据方案，在初次病原体感染后的第14天或第15天对小鼠实施安乐死。

详细感染方案见图1。在H-V方案中，小鼠在第0天（D0）接受0.2毫升250个H. bakeri第三期感染幼虫或水（对照组），第8天（D8）接受0.2毫升10^6 PFU TMEV或DMEM。在V-H方案中，小鼠在第0天（D0）接受0.2毫升10^6 PFU TMEV或DMEM，第1天（D1）接受0.2毫升250个H. bakeri第三期感染幼虫或水。对照组小鼠在第0天（D0）口服给予0.2毫升水，第8天（D8）给予DMEM。根据方案，在初次病原体感染后的第14天或第15天对小鼠实施安乐死。

测量和样本收集
在整个实验过程中，每2到3天收集一次每笼小鼠的体重数据和饲料拒绝情况。在这些日子里，每天都会称量拒食的饲料量，并根据每个笼子的需求添加新鲜的饲料。实验方案中规定的下午时间点（PM），通过二氧化碳吸入的方式人道地杀死小鼠并解剖以收集样本。将小肠切开并放入含有PBS的试管中，然后在37°C下孵育3小时，以便虫体从组织中迁移出来。组织和收集到的虫体随后被保存在5%的甲醛溶液中，直到进行定量分析。分别对雄性和雌性虫体进行计数；收集并称量结肠内容物，并使用改进的浮选技术（Christie和Jackson 1982）对结肠内容物中的虫卵进行计数。然后将结肠中的虫卵数量乘以结肠内容物的重量，以考虑由于个体差异（如饲料摄入量或虫卵排泄模式的差异）导致的稀释效应。数据以结肠中的虫卵数量（EIC）表示。EIC、雄性和雌性虫体数量、每单位体重的虫卵数量以及总虫体数量被用作评估宿主对H. bakeri抵抗力的指标。

为了确认病毒感染是否成功，在小鼠死亡后（PM）收集了血液和组织样本。重要的是要证明TMEV的口服接种能够导致病毒在小肠中的感染和持续存在，同时那里也存在成年H. bakeri。通过斑块测定法（Plaque assays）来量化血液中的TMEV病毒载量（viraemia）（Kang等人2007年）；所有样本都进行了两次重复分析（技术重复），并且该测定法重复了两次。此外，在PM时收集的脑和小肠样本被保存在RNAlater中用于RNA提取，以检测共感染组和仅TMEV感染组中的病毒RNA存在情况。RNA提取使用Qiagen RNeasy mini试剂盒（CAT编号74104，Qiagen，英国）按照制造商的指南进行。使用Nanodrop光谱仪（Nanodrop technologies Inc.，美国）测量RNA的数量和A260/280、A260/230比值以评估RNA纯度。cDNA合成使用Thermo Scientific Verso cDNA合成试剂盒（CAT编号AB1453A，Thermo Scientific，英国）按照制造商的指南进行，寡核苷酸作为RT引物。cDNA合成的热循环程序为42°C 30分钟，接着是95°C 2分钟。PCR使用Thermo Scientific Platinum? II Hot-Start PCR Master Mix（Cat编号14000013，Thermo Scientific，英国）进行。引物已在之前的研究中公布（Uhde等人2016年），正向引物为GACTAATCAGAGGAACGTCAGC，反向引物为GTGAAGAGCGGCAAGTGAGA（扩增子大小为129 bp）。标准PCR的热循环程序为95°C 3分钟，40个循环，每个循环98°C 15秒，60°C 20秒，72°C 1分钟，最后在72°C下延伸20秒。PCR产物通过凝胶电泳可视化。

如前所述，耐受性是通过宿主表现与体内病原体负担之间的线性回归的斜率来衡量的；斜率越陡，表示耐受性越低（即每单位病原体负担变化时宿主表现的下降速度越快）（Lough等人2015年）。本研究中用于估计耐受性的表现指标包括PM时的尸体重和体重（BW）增长，后者通过D14/D15时的最终体重与初始体重之差来估算。先前的研究表明，尽管BW是最常研究的性能指标，但它受到肠道填充波动的影响，而尸体重则不受此影响（Athanasiadou等人2015年）。在耐受性回归分析中，使用总虫体数量和EIC作为寄生虫负担的衡量指标。更具体地说，总虫体数量作为寄生虫负荷的直接测量值被用作耐受性估计的直接自变量，而EIC被用作间接自变量。因此，基于尸体重与总虫体负担、尸体重与EIC、体重增长与总虫体负担以及体重增长与EIC之间的回归，得出了四种不同的耐受性估计值。

动物表现（以体重增长表示）通过两种不同的方式进行分析：在每个感染方案内部以及跨方案进行。为了评估共感染随时间的影响，实验被分为三个阶段：感染前、感染中和感染后。感染前阶段定义为任何感染处理之前的时期（即第0天之前）。感染中期定义为第一次感染处理之后的时期（H-V方案中为第0天至第8天，V-H方案中为第0天至第1天），而感染后期定义为第二次感染处理之后的时期（H-V方案中为第9天至第14天，V-H方案中为第2天至第15天）。为了确定共感染对表现的影响，使用一般线性混合模型（general linear mixed model）分析了体重增长。模型中包括的固定效应有方案（两种方案，即H-V和V-H）、感染模式（四种模式，即共感染、仅H. bakeri感染、仅TMEV感染和假感染Con）以及时期（三个阶段；感染前、感染中和感染后），还包括所有可能的二元和三元交互作用。此外，将感染前的体重作为体重增长的协变量纳入模型，将笼子内的小鼠身份作为随机效应，以保守地考虑潜在的个体水平随机性，从而防止第一类错误。为了确定共感染对小鼠对H. bakeri抵抗力的影响，在R包LME4中实现了线性模型，以EIC、虫体数量和每单位体重的虫卵数量作为响应变量。在H-V方案中，包括了在第9天处死的小鼠的虫体数量数据（用于TMEV检测）；在V-H方案中，第1天处死的小鼠没有寄生虫学结果。在分析之前，对EIC、虫体数量和每单位体重的虫卵数量进行了对数转换，以考虑其分布的偏斜并标准化模型残差。模型中包括的固定效应有：方案（H-V和V-H）、感染模式（两种模式；共感染和仅H. bakeri感染）及其交互作用。使用AIC来确定最适合的模型；选择AIC值最低的模型作为每个变量的最终模型。对于EIC，最终模型是包含固定效应（方案和感染模式）和交互作用（方案*感染模式）但不包含随机效应的lm模型。最终模型进一步使用performance包中的‘check_model’函数（Lüdecke等人2021年）进行了拟合优度检查（补充文件S2-model fit）。对于虫体数量和每单位体重的虫卵数量，最终模型是包含固定效应（方案和感染模式）但不包含交互作用和随机效应的lm模型。当存在显著的主效应时（例如在EIC中），使用emmeans包中的‘emmeans’函数（Lenth 2024）进行了事后分析，调整了多重比较。对于转换后的数据，结果以95%置信区间（CI）的形式呈现。

在R包lmer中实现的回归模型用于评估共感染对寄生虫感染小鼠对H. bakeri感染耐受性的影响。回归模型使用尸体重或体重增长作为因变量，感染模式（两种模式；共感染和仅H. bakeri感染）作为固定效应，寄生虫负担（log10 (WC + 1) 和 log10 (EIC + 1) 以及初始体重作为协变量。通过在最终模型中添加感染模式 × 寄生虫负担的交互作用项作为额外的固定效应，获得了具体的耐受性斜率估计值，其中非显著变量已从最终模型中移除。使用AIC来确定模型选择，而最终模型的拟合优度使用performance包（Lüdecke等人2021年）进行检查。由于感染方案对耐受性没有影响，因此将两种共感染方案（H-V和V-H）的数据合并用于耐受性分析。基于F检验统计量的耐受性斜率估计之间的显著差异提供了共感染与单一寄生虫感染对H. bakeri耐受性影响的证据。

在TMEV感染的小鼠的小肠和大脑中未检测到病毒血症，但检测到了病毒RNA。在病毒挑战后第1天（V-H和H-V方案分别为第1天和第9天）收集的血液样本进行的检测中未检测到病毒斑块，表明宿主的病毒血症低于检测限。大多数已发表的研究采用脑内或腹腔内接种TMEV的方法；我们证明了TMEV的口服接种导致病毒在接种后24小时内出现在小肠中（和/或第14/15天出现在大脑中）。图2B显示，在接种后24小时内大脑中检测到的病毒RNA非常少。

图2
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感染了TMEV单独或与H. bakeri共感染的小鼠的脑（A）和小肠（B）样本的PCR产物的凝胶电泳图。第1天的样本在死亡后合并（每个感染方案中有两只小鼠被安乐死，总共四只小鼠）。第14/15天的样本在最终死亡后合并（剩余的小鼠被安乐死）。阳性对照来自TMEV感染的细胞培养物。条带的存在表明特定合并样本中存在病毒RNA。

在H-V方案中（图2），在病毒感染后第1天（9 DPI），在仅TMEV感染和共感染处理的小肠样本中检测到了病毒RNA；在病毒感染后第1天，动物的脑中没有检测到病毒RNA（图2B；图1和图2）。在第14 DPI，仅在TMEV感染和共感染动物的小肠和脑样本中检测到了TMEV RNA。
在V-H方案中（图2），在病毒感染后第1天（1 DPI），在仅TMEV感染和共感染动物的小肠和脑样本中检测到了TMEV RNA。在第15 DPI，仅在TMEV感染和共感染动物的小肠和脑样本中检测到了TMEV RNA。在单个肠道样本（样本14；图2A）中未检测到病毒RNA，可能是由于技术错误或病毒从小肠中清除，因为在研究结束时在同一动物的脑中检测到了病毒RNA（样本14；图2B）。

共感染没有影响小鼠的体重增长。在整个实验期间，无论是在H-V方案还是V-H方案中，小鼠的体重增长都没有显著差异。同样，接受共感染挑战的小鼠在两种方案中的体重增长相似（H-V方案为0.142克，V-H方案为0.141克；标准误差为0.548，p > 0.1）。

最终模型中宿主抵抗力特征的统计结果显示在表1中。方案和感染模式之间存在显著的交互作用（p = 0.037）。在H-V感染方案中，共感染小鼠的结肠中的虫卵数量比仅H. bakeri感染的小鼠少57%（经过95%置信区间调整后的均值：分别为5,051（509–567）与12,563（4,518–7,057）个虫卵，p = 0.035；图3）。在同一方案中，共感染小鼠的雄性虫体数量较少（共感染为48（11–15），仅H. bakeri感染为65（5–6）；雌性虫体数量较少（共感染为93（16–20），仅H. bakeri感染为122（9–10）；总虫体数量较少（共感染为157，仅H. bakeri感染为208；p = 0.023；图4）。共感染处理的繁殖力比仅H. bakeri感染低45%（共感染为每只雌性虫体53（6–7）个虫卵，仅H. bakeri感染为每只雌性虫体106（43–73）个虫卵；p = 0.015；图5）。

表1 使用R包LME4进行的线性模型分析的结果，测试了方案和感染模式及其可能的交互作用对雌性、雄性和总虫体数量、EIC以及每单位体重的虫卵数量的影响。

图3
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感染了250个H. bakeri感染性幼虫单独或与TMEV共感染的小鼠的结肠中虫卵（EIC；每克粪便中的虫卵数量）的经过反转换的最小二乘均值，在两种感染方案（H-V和V-H；n = 6）中。图中显示了每只小鼠的EIC（感染诱导细胞计数），标记代表了置信区间。图4的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图片。图中还展示了单独感染250个H. bakeri感染性幼虫或与TMEV共感染的小鼠中，雌性（A）、雄性（B）和总蠕虫数量的反变换最小二乘均值，共使用了两种感染方案（H-V，n=10；V-H，n=6）。每只小鼠的雌性、雄性和总蠕虫数量用标记表示，条形图代表置信区间。总蠕虫负担中还包括无法鉴定为雄性或雌性的蠕虫（例如部分蠕虫）。图5的替代文本也可能是使用人工智能生成的。全尺寸图片。图中还展示了单独感染250个H. bakeri感染性幼虫或与TMEV共感染的小鼠的人均繁殖力反变换最小二乘均值，同样使用了两种感染方案（H-V和V-H；n=6）。每只小鼠的人均繁殖力用标记表示，条形图代表置信区间。在V-H感染方案中，观察到了类似但不具有统计学显著性的趋势；共感染的小鼠结肠中的虫卵平均数量为3,209个（2,031–5,534个），而仅感染H. bakeri的小鼠结肠中的虫卵数量为7,147个（1,860-3,105个）（p=0.118；图3）。同样，总蠕虫数量（共感染组为199个（34–40个），仅感染H. bakeri组为220个（18–20个；p=0.105），雄性蠕虫数量（共感染组为69个（10–12个），仅感染H. bakeri组为71个（3–4个；p=0.158），以及雌性蠕虫数量（共感染组为104个（21–26个），仅感染H. bakeri组为122个（16–18个；p=0.098；图4）也与仅感染H. bakeri的小鼠没有统计学差异。两种感染方案下的共感染组蠕虫数量没有差异（H-V组为157个，V-H组为199个；标准误11.27；p=0.262）。仅感染H. bakeri的小鼠相比共感染的小鼠耐受性较差。耐受性分析通常产生负的最小二乘均值（LSM）耐受性斜率估计值，这些值显著低于零（P<0.05），无论感染方式或分析中使用的表现和寄生虫负担特征如何（图6）。这表明小鼠对H. bakeri感染并不完全耐受。此外，仅感染H. bakeri的小鼠的耐受性始终较低（即耐受性斜率估计值更陡）。当使用尸体重量作为响应变量时，LSM耐受性斜率估计值为共感染组为-0.0062±0.0037，仅感染H. bakeri组为-0.0163±0.0082（p=0.052；图6A），相当于共感染组耐受性提高了39%；当使用体重增加作为响应变量时，这些估计值为共感染组为-0.0004±0.0002，仅感染H. bakeri组为-0.0011±0.0005（p=0.058；图6B）。图6的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图片。图中还展示了通过回归分析，单独感染250个H. bakeri感染性幼虫或与TMEV共感染的小鼠对H. bakeri的耐受性估计值，基于表现与体内寄生虫负担的关系。（A）尸体重量与总蠕虫数量；（B）体重增加与总蠕虫数量；（C）尸体重量与EIC；（D）体重增加与EIC。标记表示个体动物。基于尸体重量与EIC（共感染组-0.181±0.027，仅感染H. bakeri组-0.261±0.035；p=0.071；图6C）和体重增加与EIC（共感染组-0.011±0.002，仅感染H. bakeri组-0.018±0.009；p=0.098；图6D）的耐受性也观察到了类似但不太明显的差异。讨论据我们所知，这是首次在存在病毒病原体的情况下，量化了对肠道蠕虫相对易感的宿主的抵抗力和耐受性的研究。尽管之前有许多研究描述了共感染模型（Desai等人2021年），但很少有研究探讨肠道蠕虫与病毒之间的动态关系（例如Osborne等人2014年），并且这些研究大多量化了蠕虫对病毒载量的影响，而不是病毒挑战对蠕虫和宿主防御的影响。我们的假设是，在与同一种生态位的病毒病原体共感染的情况下，暴露于H. bakeri的小鼠在抵抗力和耐受性方面会受到更大的影响。相反，我们观察到在已经建立H. bakeri感染后给予TMEV对宿主抵抗H. bakeri有显著的积极影响，表现为EIC（p=0.035）、蠕虫负担（p=0.023）和人均繁殖力（p=0.015）的改善。我们还观察到，共感染的小鼠对H. bakeri感染的耐受性反应更好（p=0.052）。因此，我们的初始假设被推翻了。此外，我们发现病原体的给予顺序会影响宿主防御策略的表现，因为在已经建立H. bakeri感染后给予TMEV对抵抗力的积极影响大于在H. bakeri感染前给予TMEV的影响。与之前的寄生虫抵抗力研究一致（Raberg等人2007年；Hayward等人2014年；Athanasiadou等人2015年），我们将EIC和蠕虫负担分别作为抵抗力的间接和直接指标。在H-V感染方案中，共感染的小鼠排出的虫卵数量显著减少，蠕虫负担也显著降低。C57BL/6小鼠通常被认为对H. bakeri感染的反应较慢，Th2免疫反应诱导缓慢，导致在感染后8-20周内排出寄生虫（Reynolds等人2012年）。观察到的对H. bakeri抵抗力的提高可能归因于H. bakeri在小肠中的建立减少或早期蠕虫排出。之前的研究报道了共感染对抵抗力的不同影响。在Litomosoides sigmodontis感染期间给予Influenza A病毒会导致宿主对病毒的易感性增加，肺部的病毒滴度更高，临床症状出现得更早，但未影响成年蠕虫的数量（Hardisty等人2022年）。另一方面，与仅感染一种病原体的小鼠相比，共感染T. spiralis的小鼠对Influenza A病毒的抵抗力增强（Furze等人2006年）。然而，这对蠕虫没有影响。据我们所知，之前研究共感染在同一生态位的情况（如Osborne等人2014年）显示宿主对病毒病原体的抵抗力有所下降，但对蠕虫的影响尚未真正测量。共感染对抵抗力影响的原因仍有争议；先前的研究表明观察到的表型可能与免疫变化有关（Du Plessis等人2013年；Karadjian等人2014年）。在Nippostrongylus brasiliensis共感染期间观察到的M. tuberculosis负担减少与肺部CD4 T细胞（Th1和Th2辅助细胞）的早期激活以及中性粒细胞和肺泡巨噬细胞数量的增加有关（Du Plessis等人2013年）。L. sigmodontis和Plasmodium spp的共感染导致小鼠的丝虫负担减少，这与促炎细胞因子的循环增加一致（Karadjian等人2014年）。尽管并不总是能够确定因果关系，但免疫反应的变化可能至少部分解释了观察到的抵抗力变化。这一观点得到了我们研究中共感染顺序的影响的支持，即H-V方案中的小鼠抵抗力的改善更为显著。C57BL/6小鼠通常被认为对TMEV有强烈的反应（Oleszak等人2004年），它们会上调强烈的1型免疫反应以抵御病毒。在H-V方案中，病毒在H. bakeri幼虫重新出现的小肠期间给予，这可能对宿主的免疫系统产生了调节作用，从而提高了对H. bakeri的抵抗力。实际上，在最近的一项研究中，TMEV感染的巨噬细胞被证明上调了IL33的mRNA表达（Esmael和Petro 2023年），这种细胞因子被认为对抵抗蠕虫寄生虫有积极影响（Hung等人2020年）。此外，TMEV的脑内接种已被证明会增加感染小鼠肠道固有层的CD4+ T细胞数量（Carrillo-Salinas等人2017年）；如果TMEV的口服给药在肠道也有类似效果，这可能是我们研究中观察到的H. bakeri蠕虫数量减少的原因。因此，TMEV可能在调节对H. bakeri的免疫反应中起作用（无论是通过IL33的调节还是CD4+ T细胞的参与），因为在H-V方案中给予TMEV时蠕虫已经存在于小肠中。已经证明H. bakeri的抵抗力受到肠道微生物群变化的影响（Reynolds等人2012年）。先前的证据表明，TMEV的脑内接种会在SJM/J小鼠接种后14天改变肠道微生物群的相对丰度（Carrillo-Salinas等人2017年）。如果TMEV的口服接种导致微生物组的变化，它们也可能影响宿主对H. bakeri的抵抗力。此外，共存在于同一生态位的病原体（如我们的研究）也可能受到空间或资源竞争的影响。在疟疾共感染研究中（Huijben等人2011年）展示了资源竞争，两种针对相同年龄和类型的红细胞的不同疟疾寄生虫之间存在直接的资源竞争，导致其中一种寄生虫的寄生虫血症降低。在流行病学研究中假设了空间竞争，其中共感染的人类寄生虫感染者比单一病原体感染者表现出显著较低的自然贾第虫-蠕虫共感染率（Blackwell等人2013年）。我们研究中TMEV在小肠中的存在（H-V方案第14天和V-H方案第15天，通过PCR证实）表明TMEV的口服给药使病毒停留在小肠中，这在野生小鼠中也有观察到（Clatch等人1985年）。不能排除H. bakeri和TMEV之间存在竞争的可能性；无论是资源竞争还是空间竞争，微生物群的变化或免疫介导的变化都可能有利于共感染的小鼠。我们的预期是共感染也会对H. bakeri的耐受性产生不利影响。然而，共感染的小鼠比仅感染H. bakeri的小鼠表现出更高的耐受性。在我们的研究中，耐受性通过四种不同的方式进行了估计；宿主的耐受性基础相对不为人所了解，因此在计算耐受性时最好考虑宿主适应性和病原体严重性的多个不同特征，以准确了解宿主-寄生虫相互作用的本质（Jackson等人2014年）。所有四种耐受性估计结果相似，共感染的小鼠对H. bakeri感染的耐受性都高于仅感染H. bakeri的小鼠。先前的研究表明，在T. spiralis和Influenza病毒共感染期间，小鼠的肺部病理减少，体重恢复加快（Furze等人2006年）。在那项研究中，共感染并未影响病毒清除，这表明对体重恢复和肺部病理的积极影响可能与共感染动物的抵抗力提高无关。尽管那项研究中没有直接计算耐受性，但在没有病原体负担减少的情况下，表现的改善（体重）和适应性的提高表明耐受性的提高。作者推测，在共感染动物中观察到的炎症标志物减少可能归因于螺旋体（T.spiralis）抑制炎症的能力，这可能是导致病理变化减轻的原因，同时并未影响病毒的载量（即病毒抗性未受影响）。在我们的模型中，TMEV引发的免疫反应可能也具有类似的抗炎作用，从而提高共感染小鼠的耐受性。进一步研究这些机制将有助于制定感染控制措施。总之，本研究发现，在寄生虫感染早期阶段让宿主接触病毒病原体，可以改变C57BL/6小鼠对H.bakeri的抵抗性和耐受性反应。本研究遵循了动物研究中的3R原则（Lewis 2019），因此使用了最少数量的实验动物。在实验设计和统计分析中，我们采取了严格措施以减少I型和II型错误，例如通过尽量减少分析中未考虑的潜在混杂因素。尽管如此，仍需要通过具有不同遗传背景的小鼠进行类似的实验来验证本研究的结果。这项概念验证研究表明，共感染以及病原体感染的顺序可能会影响抵抗性和耐受性研究的结论，因此在未来的研究中需要仔细考虑这些因素。这些相互作用背后的机制尚需进一步研究，并可能受到遗传、生理或环境因素的影响。