制造三维主动脉根部模型，用于体外评估钙化性主动脉瓣狭窄

《Annals of Biomedical Engineering》：Manufacturing 3D aortic root models for in vitro assessment of calcific aortic valve stenosis

　　摘要
目的
钙化主动脉瓣狭窄（AS）的特点是瓣叶硬化和主动脉瓣（AV）瓣口的狭窄。临床上，重度AS定义为平均跨瓣压降（ΔP）≥40 mmHg和主动脉瓣面积（AVA）≤1.0 cm2。为了模拟钙化AS的血液动力学特征，开发了主动脉根部（AR）模型。

方法
根据患有AV狭窄患者的计算机断层扫描血管造影（CTA）数据，重建了参数化的AR几何结构。通过3D打印模具使用硅胶铸造制造模型，同时改变两个参数：磷酸钙含量（50 mg vs 100 mg）和AV自由边缘切口（50% vs 100%）。在脉动模拟环路中测试这些模型，以测量ΔP、反流和AVA。还对圆柱形硅胶-钙复合样品进行了无约束压缩测试。

结果
所有模型均保持了结构完整性，并一致地再现了中度至重度的AS血液动力学条件：ΔP范围在22至49 mmHg之间，而最大AVA从1.14 cm2降低到0.49 cm2。所有配置均实现了完全的舒张期闭合。在广义线性混合效应模型中，钙负荷和自由边缘切口显著影响了AS的严重程度。模型间的变异性可以忽略不计，同一模型内的重复测量显示残余变异性较低。硅胶-钙复合材料的压缩硬度（0.3–2 MPa）与体外钙化瓣叶组织的硬度相当。

结论
所提出的建模策略和AR模型能够可靠地再现钙化AS的血液动力学特征。通过进一步改进和验证，这一实验框架可以在受控实验条件下支持对不同AS表型的公平和可重复的血液动力学比较。

引言
钙化主动脉瓣狭窄（AS）是一种慢性进行性疾病，其特征是主动脉瓣（AV）组织硬化和瓣叶钙化，这导致瓣叶变硬并最终使AV瓣口狭窄[1]。症状性重度AS通过主动脉瓣置换术（AVR）治疗，可以是外科手术（SAVR）或经导管植入（TAVI），这两种方法的临床应用不断增加，特别是TAVI，带来了更好的结果、更流畅的手术过程和更低的并发症发生率[2]。然而，无论是外科手术还是经导管AV装置都容易发生结构退化（如瓣叶钙化、撕裂、支架框架断裂）和非结构性并发症（如瓣周漏血、PPM），这些都会影响性能、降低耐用性并需要再次干预[3]。值得注意的是，还存在一些解剖学问题，例如老年人和女性患者中常见的主动脉瓣环较小，这可能增加PPM的风险，影响瓣膜的耐用性和临床结果[4]。为此，需要改进装置技术和植入技术，以明确生物假体瓣功能障碍的机制，避免方法学上的陷阱，并根据临床、技术和假体特性个性化治疗策略[5]。在临床试验之前，通过体外测试和动物研究评估外科和经导管AVR装置的血液动力学性能和安全性[6,7,8,9]。基于实验室的体外测试需要一个脉动模拟循环环路（MCL）来再现临床相关且可重复的血液动力学条件[10, 11]。根据ISO 5840标准，该标准规定了流体动力学性能和耐久性的最低要求[12]，MCL可以用于评估各种AV假体，从而实现系统比较并支持法规合规性。典型的MCL设置包括左心室（LV）腔室、功能性二尖瓣和主动脉根部（AR）测试段，假体瓣在此处植入[13,14,15]。该系统由活塞泵驱动，控制每搏输出量（SV）和心率（HR），从而再现生理心脏血液动力学，捕捉压力、流量和脉动性。流量探头和压力传感器能够定量评估流体动力学性能，包括跨瓣压降和有效瓣口面积。配备高速摄像头可以详细观察整个心动周期中的瓣叶运动。尽管将动物（例如猪）心脏安装在模拟环路上有助于捕捉心脏解剖的复杂性[16]，但这种方法无法控制特定的AV功能障碍模式，如钙化AV狭窄。为了解决这一主要限制，可以使用三维（3D）打印技术来再现退行性主动脉狭窄的解剖结构和功能特征[17,18,19]。3D打印的AV模型从基于平均解剖数据的简化AR几何结构[9, 20]到包括LV流出道、AV瓣尖和钙化的患者特定复杂配置[14, 21,22,24]不等。在先进的双材料打印策略中使用了半透明、类似橡胶的光敏聚合物（例如Tango、Vero、Agilus）来在柔性的AV瓣尖中嵌入刚性钙化物[25]，从而再现狭窄形态。这些技术可以制造出具有不同硬度和弹性的柔性AV模型[26]，尽管制造成本和时间显著增加[27, 28]。相反，之前的研究[29,30,31]使用软硅胶铸造来复制AV和近端主动脉的柔性3D模型，这种方法基于3D打印的刚性模具或铸件，成本效益更高。然而，这些模型忽略了AV瓣尖上的钙化病变，限制了它们再现AV钙化狭窄血液动力学模式的能力。最近，提出了包含钙化沉积物的患者特定复制品，以提高体外测试的真实性，并支持TAVI性能的评估[6, 32]，主要关注跨瓣压降（ΔP）和有效瓣口面积（EOA）。

材料与方法
为了在生理脉动流动条件下再现中度至重度钙化AS的功能性血液动力学特征，设计了AR模型。基于已建立的AS严重程度分级临床指南标准[2]预先定义了性能目标，这些标准主要根据平均ΔP和有效主动脉瓣面积（AVA）对AS进行分类。中度AS定义为ΔP=20–39 mmHg和AVA=1.0–1.5 cm2，而重度AS对应于ΔP≥40 mmHg和AVA≤1.0 cm2。为了实现这些血液动力学目标，定义了两个独立的设计参数：
1. 钙负荷，表示在AR模型铸造过程中加入AV瓣叶中的磷酸钙晶体（以mg计）的受控量。
2. 自由边缘切口的程度，对应于铸造过程中释放融合所需的相邻瓣叶自由边缘之间的预定义分离长度。通过有意改变这些参数，制造了一系列AR模型。随后在生理流动条件下评估了血液动力学输出，并与预定义的临床性能目标进行了比较。

为此，研究遵循了三个连续的关键阶段：
（i）基于CTA获得的平均解剖测量数据，参数化再现狭窄AV的几何结构。
（ii）通过3D打印制造刚性AR模具，然后进行硅胶铸造。
（iii）在脉动模拟环路中进行体外血液动力学评估，以量化与AS相关的血液动力学参数。

CTA获取和图像处理
从IRCCS Policlinico San Donato接受TAVI治疗的40名症状性AS患者被选入研究，这些患者来自之前的观察性和回顾性单中心协议。该研究遵循赫尔辛基宣言，并得到了IRCCS Ospedale San Raffaele当地伦理委员会的批准（协议代码“AI4TAVI”，编号33/INT/2023，2023年3月15日接受）。由于研究的回顾性质和数据分析的匿名化，免除了知情同意的要求（临床试验编号：不适用）。鉴于分析的重点是主动脉瓣环较小的AR，因此选择了平均瓣环直径<21 mm的患者；排除了双尖瓣AV的患者。

对于每位选定的患者，都有TAVI前的CTA影像数据，这些数据是在64排多探测器扫描仪（SOMATOM Definition，Siemens Healthiness，Erlangen，德国）上获得的，具有回顾性心电图门控功能，具有以下特点：切片厚度≤1 mm，重建矩阵512×512，像素间距范围为0.26×0.26至0.87×0.87 mm2。最佳收缩期CTA重建（BestSyst）被导入3mensio Structural Heart（版本8.2，Pie Medical Imaging BV，马斯特里赫特，荷兰），将基准平面设置在三个AV瓣尖的水平。左心室流出道（LVOT）位于瓣环平面下方4 mm处[33, 34]，即瓣尖高度（H）为4 mm。提取了以下AR几何测量数据（图1a）：最小、平均和最大主动脉瓣环直径（\(D_{{{\text{AA}}}}^{\min }\)、\(D_{{{\text{AA}}}}^{{{\text{mean}}}\)、\(D_{{{\text{AA}}}}^{{{\text{MAX}}}\）；最小、平均和最大LVOT直径（\(D_{{{\text{LVOT}}}}^{\min }\)、\(D_{{{\text{LVOT}}}}^{{{\text{mean}}}\)、\(D_{{{\text{LVOT}}}}^{{{\text{MAX}}}\）；窦管连接处直径（\(D_{{{\text{STJ}}}\）；左、右和非冠状Valsalva窦的突出部分（\(S_{{\text{L}}}\)、\(S_{{\text{R}}}\)、\(S_{{{\text{NC}}}\）；窦管连接处与瓣环平面的距离（\(L_{{\text{L}}}\)、\(L_{{\text{R}}}\)、\(L_{{{\text{NC}}}\）；窦管连接处与瓣环平面的高度（\(H_{{{\text{STJ}}}\）；Valsalva窦的最大突出部分与瓣环平面的高度（\(H_{{{\text{SoV}}}\））。所有提取的参数总结在表1中。

表1
从CTA成像中提取的几何参数和测量数据。

3D AR数字模型
使用基于Rhinoceros（v6.13，McNeel and Associates，西雅图，WA）和Grasshopper（v1.0）可视化编程环境的计算机辅助设计（CAD）重建了AR几何的数字模型。根据[35]中描述的方法，使用表1中报告的每个参数的中值重建了典型的代表性AR模型，除了LVOT和主动脉瓣环直径的最小和最大值。AR壁厚度设置为2.5 mm[36]。模型包括LVOT、完整的AR复合结构——包括主动脉瓣环、AV瓣尖、Valsalva窦（SoV）和窦管连接处（STJ）以及近端升主动脉（见图1b）。模型中排除了左右冠状动脉。

为了再现AV瓣尖上的钙化，使用开源CAD软件（Meshmixer v3.5.474，Autodesk Inc.，San Rafael，USA）手动膨胀每个瓣叶的表面（图1b），以模拟AV瓣叶上典型的“桥”状钙化模式[37, 38]。

模具制造和AR模型的硅胶铸造
每个AR模型都是使用硅胶铸造模具制造的。首先3D打印出刚性的AR几何模具，然后将硅胶倒入其内部空腔中形成最终结构。每个模具都是在Rhinoceros v6.13中设计的。由于几何结构的复杂性，模具被分成多个部分，以便于无损地取出模型。从内部AR表面开始，设计了两个内部模具来捕捉内部AR壁的几何结构（图2a），沿着穿过瓣叶的矢状平面分割。上部内部模具从LVOT延伸到瓣环，包括AV瓣叶和瓣叶间三角形，而下部内部模具从瓣环延伸到STJ。这两个部分被设计成能够精确地相互咬合（见图3b）。图2：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

钙化AR模型的制造过程：a、b 用于硅胶铸造的模具组件的3D CAD设计。外部模具被设计成与内部模具（黑色箭头1和2）相互咬合，最终确保精确对齐并固定组件（黑色箭头3）。硅胶铸造过程（c、d）基于PET 3D打印的模具，并需要在AV瓣膜上嵌入磷酸钙晶体（d）。e、f 最终的AR模型：e为侧视图，f为通过升主动脉的俯视图，显示钙化的瓣膜。

图3：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

体外血流动力学基准测试的实验装置：a为容纳AR模型的模块化部分的视图，b为所有电路组件的示意图。

外部AR表面被用来设计两个外模具，以包裹内部模具（图2b，黑色箭头1和2），从而形成一个密封的腔体用于硅胶注入。设计中包含了空气排放的出口通道和连接电路法兰的槽口。为了确保正确的对齐和固定的组装，添加了螺丝、螺栓和螺纹插件（见图2b，黑色箭头3）。这些模具是通过Fused Deposition Modeling (FDM)技术使用Prusa XL 3D打印机制造的，并使用PrusaSlicer 2.9.0生成G-code文件。模具由聚对苯二甲酸乙二醇酯（PETG）材料打印而成，然后通过去除支撑材料和平滑边缘进行后处理。

在硅胶铸造之前，使用磷酸钙晶体准备了AV（主动脉-二尖瓣）钙化部分，以模拟天然钙化沉积物的纹理和分布。晶体（Cisa Adriatica，Pescara，意大利）被捣碎并通过一个孔径为0.75毫米的不锈钢网过滤。

Dragon Skin? No. 20°（Smooth-On Inc.，Macungie，美国）被用来复制AR壁的软组织结构。硅胶首先在室温下（大约23°C）倒入模具中，直到达到AV瓣膜的水平。在这个阶段，将磷酸钙晶体施加到下模具内的瓣膜表面，并嵌入到额外的硅胶层中（图2c，d），完全覆盖AV瓣膜的表面。放置上内部模具后，用硅胶填充剩余的腔体以完成铸造过程。30分钟后，硅胶完全固化，最终从模具中取出钙化的AR模型（图2e，f）。

使用相同的铸造程序制造了五个具有不同程度AV狭窄的AR模型（n=8）。由于模具的设计，所有瓣膜的自由边缘在铸造后都保持融合状态（图3f）。狭窄的严重程度通过调节两个参数来控制：（i）嵌入的磷酸钙晶体的数量（以毫克计）和（ii）靠近瓣膜连合处的残余AV自由边缘的融合程度。对于后一种情况，使用手术刀从瓣膜中心向每个连合处手动切割融合线。定义了两种配置：（i）完全切割融合线到连合处（100%切割）和（ii）切割融合线的50%，保留靠近连合处的50%融合线。每种配置复制了两个模型。复制的AR模型的特性总结在表2中。

表2 复制AR模型的特性（具有狭窄AV的模型）

全尺寸表格

模型成像和机械评估

使用光子计数计算机断层扫描（PCCT）成像技术，该技术可以最小化来自钙化斑块的伪影[39]，在NAEOTOM Alpha扫描仪（Siemens Healthcare，Erlangen，德国）上对四个AR模型（两个含有50毫克磷酸钙晶体，两个含有100毫克磷酸钙晶体）进行了成像。DICOM数据集使用Mimics Medical 27.0（Materialise，Leuven，比利时）进行处理，应用850 Hounsfield Unit (HU)的分割阈值来分离钙化区域，即HU≥850 [40]，与周围的硅胶基质区分开。

此外，使用光子计数CT成像技术对每个AR模型的瓣膜厚度进行了定量评估。测量数据从每个瓣膜的横截面中间平面上的三个预定义位置提取：（i）瓣膜附着处，（ii）中央部分，以及（iii）自由边缘。每个瓣膜是根据主动脉根部模型的参考几何形状来识别的。

为了表征用于瓣膜钙化的硅胶-钙混合物的压缩刚度，按照ASTM D575标准[41]进行了无约束压缩测试。使用MTS Insight 30电动机械测试系统（MTS System Corporation）和250 N负载细胞测试了圆柱形样品（直径8毫米×高度4毫米）。变形使用ME?46视频伸长计（分辨率1微米；相机视野200毫米；Messphysik Materials Testing Gmbh，Furstenfeld，奥地利）进行测量。施加了0.01 N的预载，并以0.033毫米/秒的应变率进行测试，即达到最大位移2毫米（50%应变）。对三十九个样品进行了压缩测试。所有数据使用Matlab R2023b（The MathWorks, Inc., Natick, MA, USA）进行了后处理。分析了从预载阈值到失效点的力-位移数据。工程应力计算为施加力与圆柱样品的名义横截面积之比，而工程应变计算为尺寸变化与样品初始高度之比。压缩强度（CS）是根据定义的应变区间内观察到的峰值应力从应力-应变曲线中确定的，具体细节见[42]。考虑了五种情况，分别对应于10%、20%、30%、40%和50%的最大应变水平，分别称为CS10、CS20、CS30、CS40和CS50。最后，每个应力-应变曲线都使用多项式（7阶）样条拟合进行了重采样和规范化。随后，杨氏弹性模量（E）计算为拟合应力-应变曲线在0-5%变形范围内的斜率。

狭窄AV的体外血流动力学基准测试

通过将狭窄的AR模型集成到脉动模拟循环系统中[43]，完成了对其的血流动力学评估。完整的实验模拟循环装置如图3所示。

实验装置包括一个定制的容积式活塞泵（电机：MCS06C41，Lenze，Hameln，德国；控制器：Servo9322EK，Lenze；软件：Global Drive Control 4.14，Lenze），它将流体驱动到一个装有服务二尖瓣的刚性左心室（LV）腔室中，并与一个预载储液器相连。LV腔室通过法兰连接到一个容纳AR模型的模块化部分。下游包含一个模拟系统循环输入阻抗的后负荷电路。

使用位于AR模型上游和下游的压力传感器（Honeywell, Inc., Morristown, NJ, USA）测量了血流动力学压力梯度。使用了两个压力传感器：一个位于主动脉环上游（P1），另一个位于下游（P2）。ΔP是从P1和P2中得出的。

一个400系列（Transonic Systems，Ithaca, NY, USA）的流速计带有1英寸的流探针，用于监测AR模型下游的流量。

所有信号都使用USB 6210 A/D转换器（National Instruments, Austin, TX, USA）以200 Hz的采样率获取，并在LabView（National Instruments, Austin, TX, USA）中处理。瓣膜的运动通过安装在AR模型下游的相机（型号W400-B，AOPICK，1080p，15 fps）记录下来。

泵被编程生成60毫升的每分钟心输出量（SV）和60次心跳（HR）。

对于每个主动脉根部模型，进行了十次重复测试，以评估跨瓣膜的ΔP、反流体积（RV，单位毫升）、反流分数（RF，百分比）以及通过连续性方程得出的有效瓣口面积（EOA），以确保测量的重复性和可靠性。重复测量定义为在完全排空和重新填充包含AR的电路部分后进行的独立采集，然后重新启动流体路径并重新校准所有传感器。血流动力学数据平均了10个心动周期。ΔP在收缩期阶段进行量化，而RV和RF是通过在整个心动周期内积分正向和负向流量分量获得的。EOA使用以下公式计算：$$EOA = \frac{{Q_{{{\text{rms}}}} }}{{k\sqrt {\Delta P} }},$$ （1）其中\(Q_{{{\text{rms}}}}\)（升/分钟）是收缩期流量的均方根；ΔP（毫米汞柱）是样本上的平均收缩压降；k是一个转换因子（k=3.1），用于将EOA转换为平方厘米。

在第一个实验会话中评估了每个模型的主动脉瓣面积（AVA）。为此，使用相机记录了主动脉瓣（AV）瓣膜的主动脉视图，追踪每个帧的AV瓣口并在收缩期提取最大的AVA值。使用三个AV瓣膜的自由边缘作为参考段进行了空间图像校准，其实际长度事先使用卡尺测量。然后通过最小二乘法框架解决了相应的几何距离方程，从而估计了水平和垂直像素间距。即使参考段相对于图像轴倾斜，这种方法也能实现准确的校准。校准过程的详细描述见补充材料（见小节“从倾斜校准段估计各向异性像素间距”）。整个后处理是通过内部的Matlab脚本完成的。AS的严重程度根据平均ΔP进行分类，根据临床指南[2]：（i）如果平均ΔP<20毫米汞柱，则为轻度；（ii）如果20毫米汞柱≤平均ΔP<40毫米汞柱，则为中度；（iii）如果平均ΔP≥40毫米汞柱，则为重度。

统计分析

连续变量表示为平均值±标准差（SD）或中位数（四分位数范围），这取决于Shapiro–Wilk测试确定的分布。

实施了广义线性混合效应模型（GLMM）来评估两个制造输入——钙负荷和自由边缘融合程度——对每个AR配置的血流动力学描述符的影响。因变量，即平均ΔP和AVA，分别假设正态分布和恒等链接函数进行了分析。钙负荷（50毫克对比100毫克）和自由边缘切割（50%对比100%）作为固定效应，以及它们的交互项。引入了模型身份作为随机截距，以解释独立制造的模型之间的变异性。从每个模型获得的重复测量（n=10）用于使用复合对称协方差结构评估重复测试之间的变化，并假设同一模型内的重复观测值之间的相关性相等。统计显著性由双侧P值<0.05定义。固定效应使用F检验进行评估，效应大小以模型系数和相应的95%置信区间报告。方差分量用于量化模型之间的变异性（随机效应）和与重复测量相关的模型内部变异性（残差误差）。所有分析都使用SPSS 22.0软件（IBM Corporation，Armonk, NY, USA）进行。

结果

主动脉根部模型

狭窄AR模型的制造

生产一个AR模型的总成本，包括材料和添加剂，相对较低。具体来说，模具使用PET丝材打印，市场价格约为每公斤16.50欧元，因此生产单个根部所需的约90克材料的成本不到1.50欧元。Dragon Skin硅胶的价格为每900克42.70欧元。每个模型大约使用20克硅胶，相当于每个模型0.95欧元。钙化沉积物的最大量为每模型100毫克，价格为每1000克6欧元。因此，每个模型的总体材料成本低于3欧元。

包括模具打印（大约6-7小时）、硅胶铸造和固化（大约1-2小时）以及后处理（大约1-2小时）在内的总制造时间表明，这种快速原型制作和批量生产的过程在实验研究或术前计划中是可行的。

模型成像和机械评估

使用PCCT扫描获得的模型的DICOM图像（图4a，b）被分割，重建了每个AR模型的硅胶部分和钙化部分（图4c，d）。对制造的模型进行光子计数CT分析，得出50毫克钙化负荷的平均钙化体积为270立方毫米（范围：232-302立方毫米），100毫克钙化负荷的平均钙化体积为543立方毫米（范围：529-568立方毫米）（图4e）。

图4：该图像的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像。

从PCCT扫描获得的带有钙化的AR模型的DICOM图像堆栈的代表性轴向（a）和矢状（b）切片。PCCT成像的分割结果。c 50毫克钙（蓝色显示）和100毫克钙（绿色显示）的模型的轴向和矢状（d）视图。e 所有AR体积的直方图显示。每个AR模型的钙化沉积物的体素级HU衰减进行了量化（图5）：直方图显示了相似的分布，大多数体素强度介于1000到3000 HU之间。虽然不同模型的整体直方图形状相似，但含有50毫克和100毫克钙的模型之间存在明显差异。具体来说，50毫克钙的模型中单个HU区间的体素计数没有超过2000（AR1、AR2、AR5、AR6，图5a），而100毫克钙的模型（AR8）的计数达到了4000。尽管体素计数存在差异，但HU值仍然在相似的范围内，如箱线图所示（图5），50毫克钙的AR模型的中位HU值介于1662到1881 HU之间（图5a），100毫克钙的AR模型的中位HU值介于1863到2012 HU之间（图5b）。图5 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整尺寸图像 四个含有50毫克钙的主动脉根模型的钙化区域的HU值的直方图和箱线图（a）以及四个含有100毫克钙的主动脉根模型的直方图和箱线图（b）。所有利用PCCT成像定量评估的瓣叶厚度的测量结果详细记录在补充表S1中。简而言之，当比较不同钙负荷（50毫克 vs 100毫克）的配置时，后者的平均瓣叶厚度高出8%，分别为2.9±0.1毫米和3.2±0.1毫米（+8%）。在100毫克钙负荷的情况下，瓣叶腹部和自由边缘区域的厚度增加更为显著，这与增加的钙化体积一致。具体来说，腹部的厚度从2.1±0.2毫米增加到2.4±0.1毫米（+14%），自由边缘的厚度从1.3±0.2毫米增加到1.6±0.2毫米（+25%）。压缩试验的力-位移数据显示在图6a中。图6b展示了在10%（CS10）、20%（CS20）、30%（CS30）、40%（CS40）和50%（CS50）应变水平下计算的压缩强度（CS10–CS50）的箱线图。具体来说，CS值从0.07 MPa（CS10）逐渐增加到1.67 MPa（CS50）。在0–5%应变范围内，应力-应变曲线显示出样本间的变异性，在任何给定的应变水平下均低于大约10 kPa，如图6c中的平均曲线及其标准差范围所示。此外，还提取了每个样本在0–5%压缩变形范围内的压缩切线模量（图6c），中位值为433 kPa，四分位数范围在347到523 kPa之间（图6d）。图6 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整尺寸图像 a 测试样本的力-位移原始数据（n=39）；b 在10%、20%、30%、40%和50%应变区间内的CS值的箱线图和须状图，每个箱图都报告了中位数和四分位数范围；c 在0–5%变形范围内的应力-应变曲线；d 提取的杨氏模量的散点图。体外血流动力学评估 所有模型都通过了体外血流动力学测试，在生理压力条件下保持了结构完整性并确保了完全的液体保留。所有血流动力学结果详细记录在表3中。表3 测试AR模型的血流动力学结果 全自由边缘（100%）切割和50毫克钙负荷的AR模型（AR1、AR2）表现出中度的主动脉瓣狭窄（AS），其特征是最低的ΔP平均值（24.3和22.4毫米汞柱）和最大的主动脉瓣开口面积（AVA）平均值（1.14和1.06平方厘米）。将钙负荷增加到100毫克同时保持全自由边缘切割会导致更严重的AS，ΔP上升到31.2和31.6毫米汞柱，AVA平均值相应地降低到0.83和0.85平方厘米。将自由边缘切割减少到50%产生了最严重的AS条件。对于50毫克钙负荷的模型（AR5和AR6），平均ΔP值增加到39.7毫米汞柱（AR5）和45.3毫米汞柱（AR6），而AVA平均值分别降低到0.75平方厘米和0.78平方厘米。进一步将钙负荷增加到100毫克导致观察到的最高平均ΔP（49.5毫米汞柱，AR7）和最小的平均AVA（0.49平方厘米，AR7）。模型AR8显示出略微较低的ΔP（减少了14.9%）和较大的AVA（增加了28.6%），但仍与严重AS一致。计算出的EOA值与ΔP值一致。所有模型的反流体积和比例始终较低：RV从AR3的0.37毫升到AR5的1.09毫升不等，相应的RF值分别为0.6%和1.9%。因此，切割类型和钙化程度，如每个AR模型设计中所定义的，主要影响AS的收缩期血流动力学，而不影响舒张期瓣叶的闭合。图7显示了每个测试AR配置在舒张末期、主动脉流量峰值（收缩期峰值）和舒张晚期时的AV瓣叶的下游（即主动脉）视图。在收缩期峰值时，所有测试配置都表现出与主动脉狭窄通常观察到的形态一致的形状。具体来说，具有全自由边缘切割的AR配置（AR1和AR3）在收缩期峰值时产生了星形的三叶瓣开口。相反，具有部分自由边缘切割的配置（AR5和AR7）表现出更三角形的收缩期AVA。所有测试的AR配置在舒张期都实现了瓣叶的完全闭合。图7 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整尺寸图像 在不同心动周期时间点显示的测试AR模型的主动脉视图：a 舒张末期，b 主动脉流量峰值，c 舒张晚期。如图8所示，提取了每个不同AR配置的AVA在整个心动周期中的时间过程。AVA曲线之间的比较与观察到的峰值AVA（AVAMAX）的差异一致，证实了钙负荷和切割模式显著影响瓣膜运动学。50毫克钙负荷和全自由边缘切割的配置在整个收缩期最大化了AVA，而100毫克钙负荷和50%自由边缘切割的配置在每个时间点始终显示出最低的AVA值。在具有部分自由边缘切割的AR模型中，AVA在收缩期峰值后逐渐减少，直到瓣膜完全闭合。相比之下，具有全切割的模型在整个收缩期保持较高的AVA值，然后在舒张晚期迅速下降。图8 这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。完整尺寸图像 含有50毫克（虚线）和100毫克（实线）钙的模型的AVA的收缩期时间过程，以及部分（红线）和全切割（蓝线）。所有视频都可在补充视频材料中找到。基于GLMM的分析显示，钙负荷和自由边缘切割显著影响测试AR模型的血流动力学反应（表4）。表4 GLMM结果评估了固定效应（即钙负荷和切割模式）以及随机（模型间）和残差（模型内）变异性对ΔP和AVAMAX的影响。完整尺寸表格 对于平均ΔP，钙负荷和切割模式都是统计上显著的固定效应。具体来说，将钙负荷从50毫克增加到100毫克导致平均ΔP显著增加了8.0毫米汞柱（P=0.03），而切割模式的效应更为显著，部分自由边缘切割导致的ΔP增加明显更高，为19.2毫米汞柱，与全切割相比（P<0.001）。两个因素之间的交互作用并不显著（P=0.33），表明在研究范围内这两种制造参数的效应可以认为是可加的。同样，钙负荷和切割模式显著影响AVA。较高的钙负荷与AVA显著减少了0.26平方厘米（P<0.001），部分切割导致的AVA减少更大，为0.34平方厘米，与全切割相比（P<0.001）。没有观察到显著的交互作用（P=0.53）。方差成分分析表明，模型间变异性（随机效应）对ΔP（P=0.17）和AVA（P=0.90）都不显著，表明可归因于制造模型之间差异的变异性有限。对于这两个因变量，每个模型内重复测量的残差变异性都是显著的（P<0.001），但保持较低，ΔP的标准差约为1.08毫米汞柱，AVA的标准差约为0.08平方厘米，表明重复性良好。讨论 在这项研究中，我们提出了一种可复制且成本效益高的方法来制造能够模拟狭窄AV血流动力学性能的AR模型，该方法结合了基于图像的参数建模与3D打印模具和硅胶浇铸。利用从CT成像中回顾性获取的标准放射学测量数据，重新创建了一个可靠的AR几何数字模型，特别关注了一组具有小主动脉瓣环和退行性AS的患者。随后使用3D打印和模具浇铸技术重新创建了相应的物理AR模型，有效地将钙化嵌入AV瓣叶中，并研究了与AS相关的血流动力学严重程度。研究的创新性 据我们所知，多材料3D打印和使用硅胶化合物的基于模具的浇铸方法是复制AR模型的两种常用制造策略[8, 14, 25, 26, 28, 29, 45]。一方面，多材料3D打印因其固有的将刚性嵌入物嵌入柔顺AV瓣尖的能力而成为复制钙化AS的金标准[25]。然而，这种技术涉及使用半透明的橡胶状光聚合物，如Tango、Vero或Agilus（Stratasys Ltd., Eden Prairie, MN, USA）以及PolyJet多材料技术，这通常与高成本和较长的打印时间相关[28]。另一方面，使用FDM制造的3D打印模具和浇铸市售硅胶化合物（如Dragon Skin）是一种更快、成本更低的实用替代方法，用于复制心血管物理模型并模拟天然组织的机械行为[24, 29, 30, 31, 45]。这些材料在大多数实验室环境中容易获得，模具也可以轻松复制。例如，Aigner等人[29]使用硅胶浇铸开发了左心室（LV）、近端主动脉和主动脉弓的模型。同样，Russo等人[30]制作了AV和近端主动脉的3D模型，用于手术培训和复杂程序的模拟，其中包括瓣叶。然而，这些研究主要关注通过软硅胶浇铸复制LVOT和主动脉几何形状，但忽略了将钙化病变嵌入瓣尖。在Kaule等人[45]提出的实验框架中，主动脉瓣环模型展示了三个典型的凸起——围绕周长对称分布的环形钙化沉积。作者旨在研究TAVI后瓣周漏血的影响，根据钙化的程度，凸起达到了腔内的1到3毫米。然而，既没有对AV瓣叶也没有对瓣尖钙化进行建模和研究。Fujita等人[24]提出了一个复杂的体外设置来研究TAVI后永久性起搏器植入（PPI）的风险。为此，他们结合了PolyJet打印和硅胶模具浇铸。3D打印了钙化结构和薄的AR壁，后者随后放置在有机玻璃管内。然后将硅胶浇铸到AR壁和有机玻璃管之间的空间中，从而创建了主动脉血液体积的负模。移除薄AR壁后，在模型底部放置了一个瓣叶基座，并插入和对齐了连接到环架的钙化部件。最后，从顶部浇铸一层硅胶薄膜，将钙化体积与瓣叶连接起来。同样，我们的方法采用了一种混合材料策略来复制天然AV瓣叶和钙化沉积物。然而，在当前工作中，我们的方法引入了一种专用的模具设计和硅胶浇铸策略，用于在脉动模拟环中测试钙化AV狭窄。与Fujita及其同事[24]提出的模型不同，当前方法旨在确保AV瓣叶和AR壁之间的结构连续性，同时也实现了钙化沉积物在瓣膜基底内的更深和更稳定的整合。为此，模具组装被设计为一个模块化和互锁系统（图2），便于嵌入钙化并重复浇铸相同的模型。这两种具有镜面反射特性的内部模具能够捕捉到形成瓣膜的薄硅胶层内的钙化现象，而它们相互连接的设计使得从顶部浇注的硅胶能够流过并固定瓣膜复合材料到主动脉瓣（AR）的壁上。固化后，模具可以完全拆卸，从而无损地释放模型和所有模具部件，使得同一模具可以用于多次铸造循环。因此，这种方法能够在完全可复制的血流动力学条件下，重现不同的主动脉瓣（AV）狭窄模式进行测试和比较。

模型可靠性和性能
我们的方法旨在在受控的体外条件下重现和研究主动脉瓣狭窄的血流动力学特性。为此，制造的模型在脉动模拟循环中进行了定量评估，并根据标准临床指南[2]对狭窄程度进行了分类。具体来说，我们研究了两个可能影响主动脉瓣狭窄血流动力学行为和严重程度的关键制造参数：（i）钙负荷，由嵌入的磷酸钙晶体量决定（50毫克对比100毫克）；（ii）自由边缘切口的程度（50%对比100%）。所有测试的模型在生理压力下都保持了结构完整性。

钙化性主动脉瓣狭窄（Calcific AS）是由瓣膜钙化、瓣膜增厚以及在某些情况下的部分瓣膜融合共同作用引起的，这些因素共同增加了瓣膜的硬度，限制了瓣尖的活动性以及主动脉瓣口面积，如图8[46]所示。从临床角度来看，三尖瓣主动脉瓣的钙化性狭窄通常表现为每个瓣尖中央部分的钙化最为明显，通常没有瓣尖融合，导致收缩期瓣口呈星形[47]。在我们的主动脉瓣模型中，完全自由边缘切口的情况很好地再现了这一特征，由于没有瓣尖融合的约束，瓣膜打开的模式与退行性钙化疾病观察到的情况一致[48,49,50]。相反，风湿性主动脉瓣狭窄的特点是瓣尖融合，导致收缩期瓣口更接近三角形，瓣膜增厚和钙化主要分布在瓣尖边缘[51, 52]。在这种情况下，部分自由边缘切口的主动脉瓣模型旨在模拟与瓣尖融合相关的几何约束，以便合理地近似风湿性狭窄的表型。

关注我们在主动脉瓣模型中复制的钙负荷，发现其与基于CT的参考值一致，这些参考值是关于钙化瓣膜体积的指数[53]。具体来说，Cartlidge及其同事报告称，轻度AS的钙化体积指数（相对于瓣环面积）约为39 mm3/cm2，中度AS为85 mm3/cm2，重度AS为190 mm3/cm2。考虑到我们的主动脉瓣模型的20毫米瓣环直径，相应的预期总钙化体积分别为轻度AS约123 mm3，中度AS约267 mm3，重度AS约597 mm3。相比之下，对制造的模型进行PCCT分析得出，50毫克钙负荷下的平均钙化体积为270 mm3（范围：232–302 mm3），100毫克钙负荷下的平均钙化体积为543 mm3（范围：529–568 mm3）。因此，这些测量结果表明，分析中的主动脉瓣模型所实现的钙负荷与预期中度及重度AS的总体钙化体积相当。

如广义线性混合模型（GLMM）分析所示，钙负荷和自由边缘切口作为固定效应显著影响了主动脉瓣狭窄严重程度的血流动力学特征，体现在ΔP和AVA（表4）上。一方面，增加钙负荷导致ΔP值升高，AVA减小，反映了向更严重AS的进展。具体来说，钙负荷翻倍导致ΔP平均增加约8毫米汞柱（mmHg）。然而，在完全自由边缘切口的配置中，这种增加本身不足以达到重度AS的临床阈值40毫米汞柱。在同一模型中，将钙负荷从50毫克增加到100毫克导致AVA减少约0.26平方厘米（cm2），使得数值从高于1.0平方厘米（AR1和AR2）变为低于1.0平方厘米（AR3和AR4），从而表明从中度AS向重度AS的转变。

另一方面，自由边缘切口对这两个血流动力学参数的影响更为显著。将自由边缘切口从100%减少到50%与ΔP增加约19毫米汞柱和AVA减少0.34平方厘米相关。因此，所有具有50%自由边缘切口的主动脉瓣模型都表现出重度AS，ΔP值≥40毫米汞柱，AVA始终低于1.0平方厘米。如AR7配置所示，两个因素的叠加效应产生了最严重的AS情况，ΔP达到49.5毫米汞柱，AVA最大值降至0.49平方厘米。总体而言，这些发现表明钙负荷和自由边缘切口显著影响了主动脉瓣模型的血流动力学性能。独立制造的模型之间的变异性有限（ΔP的P=0.17，AVA的P=0.90），证实了制造过程的良好重复性。尽管每次测量之间的残余变异性在统计上显著（P<0.001），但仍然较低，ΔP的标准差约为1.08毫米汞柱，AVA的标准差约为0.08平方厘米。这表明体外测量的重复性很高，对结果的临床解释影响可以忽略不计。

在本研究中，硅胶-钙复合材料的机械特性仅限于对其压缩硬度的初步评估及其与体外数据的对比。实际上，对硅胶-钙复合材料的无约束压缩测试（图6）显示的硬度值处于钙化人类主动脉斑块的报告范围内，大约为300千帕（kPa）到2兆帕（MPa）[54]，与Shirakawa及其同事[42]报告的狭窄主动脉瓣膜的体外测量结果相当。在那项研究中，压缩硬度从10%应变时的0.38兆帕（CS10）增加到50%应变时的1.73兆帕（CS50），这一趋势与我们在样本中观察到的响应一致。值得注意的是，这种程度的表征不足以建立与天然主动脉瓣的机械等效性，因为天然主动脉瓣的体内行为受各向异性拉伸性能、弯曲硬度和剪切响应的复杂组合控制[55]。这也可能解释了在没有瓣尖融合（即完全自由边缘切口）的情况下，将钙负荷增加到100毫克并不足以一致地再现重度AS的ΔP条件。

从临床角度来看，所提出的主动脉瓣模型是临床前研究的宝贵工具，通过使用成本效益高且易于获取的材料和技术，提供了多材料3D打印解决方案的可持续替代方案。主动脉瓣模型是使用低成本且广泛可用的FDM丝材和硅胶制造的，每个模型的材料成本低于3欧元。虽然制造需要标准的FDM 3D打印机，但这类系统广泛可用，且比先进的多材料增材制造平台便宜得多。

局限性和未来方向
本研究的发现应结合几个局限性来解读，这些局限性也指出了未来改进的相关方向。首先，当前方法无法再现患者特定的几何形状或钙化模式；相反，主动脉瓣模型是基于小瓣环主动脉瓣人群的CT平均测量结果，并采用单一的、手动定义的钙化模式。尽管这种配置在临床上具有相关性，特别是在小主动脉瓣环患者中假体不匹配的风险较高时，但它没有涵盖更广泛的主动脉瓣狭窄人群中的解剖和病理变异性。其次，将制造工作流程扩展到其他解剖配置，如更大的瓣环尺寸或更多异质性的钙化表型，将需要专门的研究，如有必要，还需要重新校准制造参数以保持临床血流动力学的真实性。尽管基础方法本质上是可扩展和可适应的，但需要对几何设计和钙负荷分布进行调整，以保持与生理条件的一致性。例如，参数化的解剖模型可以调整大小以匹配不同的主动脉瓣形态，而钙负荷可以根据[53]进行调整，以保持血流动力学的真实性。在这方面，结合患者特定的、基于成像的钙化模式是实现更个性化应用的关键未来方向[38]。然而，还需要额外的努力来建立标准化的制造协议，以便直接根据常规临床成像生成特定用途的主动脉瓣模型，并根据放射学测量进行调整。第三，当前方法没有考虑到在主动脉瓣狭窄的退行过程中钙化向瓣环和左心室流出道（LVOT）的渐进性扩展[56]。钙化仅嵌入在主动脉瓣膜内，而周围的主动脉瓣组件完全由硅胶组成。正在进行的工作旨在逐步改进主动脉瓣模型，以包括瓣环和LVOT的钙化，以实现更全面的表示。第四，尽管我们使用的Dragon Skin?硅胶材料模仿了软心血管组织的一般变形能力，但它无法再现天然主动脉瓣组织的各向异性机械行为或疾病人类组织的复杂、高度可变的特性。尽管如此，先前的研究表明，Dragon Skin?硅胶能够有效近似软心血管组织的机械响应[31]。作为潜在的未来改进，可以在硅胶基质中加入纤维增强材料（例如使用聚合物网），以更好地再现天然主动脉瓣组织的各向异性力学和生理可伸展性。在这方面，我们的发现清楚地表明，尽管硅胶-钙复合材料的压缩硬度值与体外数据相当[42, 54]，但其整体机械响应尚未完全捕捉到天然钙化主动脉瓣的有效硬度——特别是在弯曲和拉伸载荷条件下。这突显了未来研究的必要性，旨在表征和优化复合材料的多方向机械行为，以提高钙化主动脉瓣模型的生物力学真实性。

此外，基于这次探索性经验，还有其他与制造相关的因素可能影响了观察到的主动脉瓣模型的行为。尽管仔细放置了钙颗粒，但手动分布可能会在瓣膜中引入局部硬度不均匀性：当增加钙负荷时，添加的颗粒倾向于优先集中在瓣膜腹部，这可能会对瓣尖区域的硬度产生不同的影响。自由边缘切口的精度可能会影响AVA的形状和范围，也会在瓣尖之间引入细微的不对称性。第五，制造的模型尚未准备好用于假体瓣膜的基准测试或手术规划。尽管本研究证明了在生理脉动流动的可控体外平台上重现中度至重度AS的临床相关血流动力学条件的可行性，但验证仅限于全局AS相关指标，即ΔP和AVA。将分析扩展到设备评估或手术规划将需要额外的开发，包括对硅胶-钙主动脉瓣复合材料的全面机械表征和专门的基准研究，例如涉及经导管主动脉瓣植入（TAVI）设备，以研究设备-瓣膜之间的相互作用。在TAVI的背景下，钙化的瓣膜显著增加了天然瓣膜结构的硬度，这直接增加了TAVI支架扩张所需的径向力，使得设备部署对钙化的数量和机械阻力非常敏感[57,58,59]。这也有助于在完全受控的实验条件下对新原型进行定量评估，支持公平和可重复的血流动力学比较[60]。

总之，本文提出了一种可靠且多用途的主动脉瓣建模策略，用于在受控的体外条件下研究钙化性主动脉瓣狭窄的血流动力学效应。钙负荷和自由边缘切口被确定为狭窄严重程度的关键决定因素，显著影响了最终的血流动力学响应。经过进一步改进和验证，这一实验框架可以扩展到涵盖更广泛的主动脉瓣狭窄表现范围。