巴勒斯坦霍奇金淋巴瘤的血液学与分子学联合研究：揭示亚型特异性预后及Claudin-6/GATA-4基因的作用

《Annals of Hematology》：A combined hematological and molecular study of Hodgkin lymphoma in Palestine: insights into subtype-specific prognosis and the role of Claudin-6/GATA-4

　　摘要
霍奇金淋巴瘤（HL）是一种人体淋巴系统中的异质性恶性肿瘤，具有独特的临床和分子特征。本研究的目的是评估巴勒斯坦地区HL患者的血液学和分子状态，并探索潜在的预后指标及需要进一步评估的潜在靶点。某些血液学因素，如贫血、乳酸脱氢酶水平升高和炎症标志物，被纳入国际预后评分（IPS）中用于HL的评估。本研究强调了在资源有限的医疗环境中可获得的血液学生物标志物的临床价值。通过对巴勒斯坦健康信息中心（PHIC）数据库和医院病历中的557例HL淋巴结活检样本（2017–2023年）进行回顾性队列研究，分析了血液学参数（血红蛋白、MCV）和生化标志物（ESR、LDH）。通过qRT-PCR技术量化了HL患者（n=25）和健康捐赠者（n=25）淋巴结组织中的Claudin-6（CLDN6）mRNA表达，同时通过Western blot技术检测了蛋白质水平。血清GATA-4浓度通过ELISA方法测定。结节硬化型是最常见的类型，主要发生在年轻患者中，且性别分布相对均衡。不同亚型之间的血红蛋白水平存在差异，其中淋巴细胞耗竭型（LD）亚型的平均血红蛋白值最低；淋巴细胞耗竭型（LD）亚型的血红蛋白和MCV（74.77 fL）均较低，表明存在小细胞性贫血。所有亚型的ESR均升高，其中结节硬化型（NOS）亚型的ESR最高（63.5 mm/h），反映了疾病的侵袭性。男性死亡率在混合细胞型（87.5%）和结节硬化型（NS）（75%）中最高，而淋巴细胞主导型（LD）和淋巴细胞丰富型（LR）亚型中未见男性死亡病例。在分子水平上，HL组织中的CLDN6 mRNA和GATA-4水平显著升高（P<0.001），尽管Claudin-6蛋白表达保持不变，这表明可能存在转录后调控。本研究代表了巴勒斯坦地区霍奇金淋巴瘤的首次血液学和分子联合特征分析，并提供了CLDN6-GATA4在HL发病机制中起调节作用的初步证据。巴勒斯坦HL患者的血液学变化具有独特性。Claudin-6和GATA-4作为潜在标志物的作用仍处于初步研究阶段，需要在霍奇金淋巴瘤的背景下进一步验证。

引言
霍奇金淋巴瘤（HL）是一种人体淋巴系统的生物异质性恶性肿瘤，其临床、血液学和分子特征存在显著差异。尽管HL的病因尚未完全明确，但它属于最可治愈的淋巴系统恶性肿瘤之一，尤其是在早期诊断并得到适当治疗的情况下。HL的典型特征是Reed-Sternberg细胞的存在，这些细胞体积较大且可能含有多个细胞核[1]。流行病学研究表明，HL的发病率受地理、年龄、性别、种族、遗传倾向、社会经济状况、环境暴露、感染因素以及诊断方法的进步等因素的影响[2, 3]。2020年全球报告的新HL病例约为83,087例，其中南欧地区的发病率最高，东亚地区最低[2]。最受关注的风险因素之一是Epstein-Barr病毒（EBV）感染，该病毒在大约30–40%的经典HL病例中起作用，具体比例因地区而异[4, 5]。EBV通过促进受感染B细胞的存活、改变免疫反应和引发基因组不稳定来促进肿瘤发生。其他致病因素还包括染色体异常、免疫缺陷、自身免疫疾病和遗传倾向[6]。从分子角度来看，人们对Claudin-6（CLDN6）这一紧密连接蛋白家族成员特别感兴趣。CLDN6已被确定为多种类型癌症的潜在治疗靶点。因此，本研究旨在评估HL患者组织中CLDN6的表达情况及其潜在的生物学意义。CLDN6在成人体细胞组织中通常不表达，但在多种类型的癌症中异常过度表达。其致癌作用与细胞增殖、侵袭性、抗凋亡能力和不良预后相关。CLDN6已被提出作为多种恶性肿瘤的潜在治疗靶点[7]。

研究设计与数据收集
这项回顾性队列研究调查了2017年至2023年间在西岸地区诊断出的所有霍奇金淋巴瘤（HL）病例，共识别出557名患者，数据来自巴勒斯坦健康信息中心（PHIC）数据库。纳入标准包括组织病理学确诊的HL患者，并具备完整的临床和实验室数据。排除医学记录不完整或组织病理学分类不确定的病例。收集了人口统计信息（年龄、性别、居住地）和病史（如糖尿病或高血压等并发症以及家族恶性肿瘤史）。检测了全血细胞计数（CBC）、肝酶、肌酐、乳酸脱氢酶、尿酸、白蛋白、总蛋白和红细胞沉降率（ESR）。疾病相关数据包括活检部位、组织病理学亚型、细胞起源以及数据收集时的生存状态（存活或死亡）。组织病理学诊断依据世界卫生组织（WHO）第五版血液淋巴系统肿瘤分类标准，并在必要时通过免疫表型分析由经验丰富的病理学家确认。被归类为“其他未特指”（NOS）的病例包括组织病理学亚型分类有限或免疫表型数据不足的患者。收集了经福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的HL组织块，以评估CLDN6在HL组织（n=25）和无癌淋巴结（n=25）中的表达情况。根据组织和血清的可用性，对不同样本进行了分子分析。由于组织和血清的有限性，并非所有样本都进行了相同的分子分析。

免疫组化（IHC）
使用多克隆抗CLDN6抗体在BOND-III全自动IHC和ISH染色系统（Leica Biosystems）上进行了CLDN6的免疫组化检测。切片经脱蜡、复水、抗原修复处理后，依次与过氧化物酶阻断剂、一抗、二抗、聚合酶检测系统和DAB显色剂孵育，最后进行苏木精复染。人结直肠癌组织作为阳性对照，省略一抗作为阴性对照。切片在认证病理学家的监督下进行观察。

Western blot分析
使用含有蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液从HL和对照淋巴结中提取蛋白质，通过BCA试剂盒定量蛋白质，并用5×加载缓冲液变性。每份样本提取20微克蛋白质，通过10% SDS-PAGE分离后转移到PVDF膜上。膜用5%脱脂牛奶封闭，然后在4°C下用抗CLDN6（Santa Cruz）和抗GAPDH（Abcam）抗体（1:1,000）孵育过夜。孵育后加入HRP标记的二抗（1:5,000, Abcam），使用FUSION Solo S系统进行荧光检测。

定量实时PCR
使用PureLink? FFPE RNA Isolation Kit（Invitrogen）从FFPE切片中分离总RNA，并用High-Capacity cDNA Kit（R&D）合成cDNA。定量PCR使用TaqMan Fast Advanced Master Mix（Applied Biosystems）进行，以GAPDH作为参考基因。扩增条件为94°C 30秒、60°C 30秒、72°C 1分钟，共40个循环，最后72°C 10分钟。相对CLDN6表达通过QuantStudio? 5系统中的ΔΔCt方法计算。

酶联免疫吸附测定（ELISA）
根据制造商说明，使用商业ELISA试剂盒（Abcam）检测血清GATA-4水平。使用微孔板读取器记录450 nm处的吸光度，并根据标准曲线确定浓度。

伦理考量与统计分析
本研究获得了An-Najah国立大学和巴勒斯坦卫生部的批准。通过数据编码和去标识程序确保了患者的匿名性。统计分析使用SPSS 20.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）和GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）软件进行。分类变量使用卡方检验（Chi-square test）分析HL亚型与人口统计或临床特征之间的关联。连续变量以均值±标准差表示。使用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，使用Levene’s检验评估方差齐性，再进行方差分析（ANOVA）。涉及两个以上HL亚型比较的连续变量使用单因素方差分析（ANOVA）。适当情况下，使用双尾独立样本t检验（two-tailed unpaired Student’s t-test）进行比较。缺失数据通过逐例排除处理。由于亚型是探索性分析的，未进行多重比较校正。因此，结果需谨慎解读，因为可能存在I类错误。p值≤0.05被视为统计学显著。当ANOVA显示统计显著性时，使用Tukey多重比较检验进行亚型特异性差异的进一步分析。

结果
**霍奇金淋巴瘤亚型的临床-人口统计和地理分布**
本研究共纳入557名霍奇金淋巴瘤（HL）患者。图1A显示最常见的组织病理学亚型是结节硬化型（NS），占所有病例的46.3%，其次是混合细胞型（MC）占24.6%。其他较少见的亚型包括其他未特指型（NOS）（12.2%）、经典HL（8.1%）、淋巴细胞丰富型（LR）（4.1%）和淋巴细胞耗竭型（LD），后者最为罕见，占1.1%。图1B显示了各亚型的平均年龄差异，总体平均年龄为33.7岁。淋巴细胞丰富型（LR）亚型的平均年龄最高（45.3岁），其次是淋巴细胞主导型（LP）（36.5岁）和结节硬化型（NS）（35.5岁）。淋巴细胞耗竭型（LD）亚型的平均年龄最低（26.8岁），其次是经典HL（27.7岁）和结节硬化型（NS）（31.6岁）。不同亚型的性别分布也存在显著差异。图1C显示混合细胞型（MC）和结节硬化型（NS）中男性占比较高，分别为68.6%和67.6%；而淋巴细胞耗竭型（LD）和淋巴细胞丰富型（LR）亚型中女性占比较高，分别为69.6%和70%。卡方分析显示性别分布与HL亚型之间存在统计学上的显著关联（χ2 = 24.89, p=0.00037），表明亚型之间存在特定的性别优势模式。总体而言，并非所有霍奇金淋巴瘤（HL）亚型都存在普遍的性别优势；相反，性别分布因亚型而异，其中MC和NOS亚型以男性为主，LD和LR亚型以女性为主，而NS亚型的性别分布较为均衡。（D）根据患者居住地划分的霍奇金淋巴瘤病例的地理分布显示，希伯伦省的发病率较高。患者的居住地分布在不同地区存在差异（图2）。希伯伦省的患者数量最多，共有132人；拉马拉紧随其后，有113名患者；纳布卢斯有89名患者；杰宁也有72名患者。图2的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。

霍奇金淋巴瘤患者各亚型的血液学参数：（A）HL患者中基于性别的血红蛋白水平差异。（B）HL亚型中血红蛋白（Hb）水平的分布。条形图表示每个类别的平均Hb（g/dL）值。男性Hb的正常参考范围为13.5–17.5 g/dL，女性为12.0–15.5 g/dL。（C）HL亚型中的平均红细胞体积（MCV）分布。条形图表示每个类别的平均MCV（fL）值。MCV的正常参考范围为80–100 pg/ml。（D）HL亚型中的平均红细胞血红蛋白（MCH）分布。条形图表示每个类别的平均MCH（pg/ml）值。MCH的正常参考范围为27–33 pg/cell。（E）HL亚型中的平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC）分布。条形图表示每个类别的平均MCHC值。MCHC的正常参考范围为32–36 g/dL。（F）HL亚型中的血细胞比容（HCT）百分比。条形图表示每个类别的HCT值。男性HCT的正常参考范围为40%-45%，女性为36%-48%。图中的误差条表示标准偏差。

其他地区的患者数量较少：卡尔基利亚有27名患者，伯利恒有33名，萨尔菲特有15名，图勒卡雷姆有47名患者。值得注意的是，一些地区的患者数量非常少，加沙有4名患者，杰里科有5名，耶路撒冷有7名，图巴斯有3名。这些发现进一步突显了在研究人群中霍奇金淋巴瘤在人口统计和地理分布上的显著异质性。

当我们分析血红蛋白（Hb）水平时，发现存在明显的性别差异。男性患者的平均血红蛋白水平为12.7 ± 2.1 g/dL，而女性患者的平均血红蛋白水平显著较低，为11.4 ± 1.7 g/dL（p < 0.05；图2A）。虽然这种差异符合标准的生理预期，但它为解读HL患者的血液学趋势提供了重要的基准。当按HL亚型分层时，数据变得更加具体（图2B）。MC亚型的平均血红蛋白水平最高（12.58 g/dL），其次是NOS（12.1 g/dL）和NS（12.0 g/dL）。经典HL和LR亚型的患者平均血红蛋白水平位于中间，分别为11.9 g/dL和11.6 g/dL。LP亚型的平均血红蛋白水平为11.4 g/dL，与整个组别的平均水平相同。然而，LD亚型的临床情况最为令人担忧。尽管仅占患者总数的1.1%，但这些患者的诊断年龄更小（26.8岁），并且贫血症状最严重，血红蛋白水平降至10.65 g/dL。尽管我们没有正式将这些数据与疾病阶段相关联，但如此年轻患者的严重贫血可能表明疾病负担更重；然而，鉴于样本量较小，这些发现应谨慎解读。

为了确定这些差异是否具有统计学意义，我们对多个血液参数进行了单因素方差分析（ANOVA）。结果证实了平均白细胞计数（F(6,550) = 2.41, p = 0.026）、淋巴细胞百分比（F(6,550) = 2.58, p = 0.020）和中性粒细胞百分比（F(6,550) = 2.44, p = 0.025）存在显著的亚型依赖性差异。其他指标，包括红细胞和血小板计数以及嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞的百分比，没有显示出显著差异（p > 0.05）。这表明虽然某些参数具有亚型特异性，但其他参数在不同HL亚型中相对稳定。最后，我们评估了平均红细胞体积（MCV），以了解红细胞大小是否随着这些病理变化而改变。与血红蛋白的趋势一致，平均红细胞体积（MCV）也显示了不同的模式（图2C）。NS亚型的平均MCV最高，为82.1 fL，表明这些患者的红细胞通常较大。相比之下，LR亚型的平均MCV为79.9 fL，而MC和NOS亚型的平均值均为79.5 fL。在较少见的亚型中，MCV开始下降。LP亚型的平均MCV为77.6 fL，经典HL亚型的平均值进一步降至76.4 fL。值得注意的是，LD亚型的平均MCV最低，为74.77 fL。这一趋势表明，像LD这样较为罕见的、可能更具侵袭性的亚型与较小的平均红细胞大小相关。虽然这些变化可能源于独特的疾病生物学特性或系统性炎症，但需要进一步研究以确定其确切的临床意义。

我们还在平均红细胞血红蛋白（MCH）方面观察到了类似的模式（图2D）。MC亚型的平均MCH最高，为28.5 pg。紧随其后的是LR和NOS亚型，其平均值分别为25.5 pg和25.4 pg。NS和LP亚型的平均值也非常接近（25.2 pg和25.1 pg），而经典HL亚型的平均值略低，为24.8 pg。与MCV数据类似，LD亚型的平均MCH最低，为23.4 pg。MCV和MCH在LD亚型中的持续下降可能表明这些患者存在更明显的微细胞性贫血或贫血状态。我们进一步探讨了平均红细胞血红蛋白浓度（MCHC），该指标衡量红细胞内的血红蛋白浓度（图2E）。NOS亚型的平均MCHC最高，为37.6 g/dL，其次是MC亚型，为36.4 g/dL。有趣的是，LR、经典HL、LP和NS亚型的MCHC值都在32.2至32.4 g/dL的范围内。然而，LD亚型的MCHC再次处于较低水平，平均值为31.2 g/dL，接近我们认为的低色素血症的临界值，可能表明存在潜在的营养缺乏或更严重的系统性影响。这些综合参数强调了显著的生物学多样性；虽然NOS和MC亚型似乎保持了相对稳定的血液学特征，但LD患者的一致低指标反映了更严重的系统性效应和更具侵袭性的疾病进程。

最后，我们查看了血细胞比容（HCT），以评估红细胞占血液体积的实际比例（图2F）。NOS亚型的平均HCT最高，为44.14%。其次是MC和NS亚型，其平均值分别为38.5%和38.17%。相比之下，经典HL亚型的平均HCT为36.9%，而LR和LP亚型的HCT更低（分别为36.1%和35%）。LD亚型的HCT最低，仅为34%，进一步证实了其与严重血液学异常的关联。值得注意的是，LP和LD亚型的HCT均显著降低（p < 0.05），与其他亚型明显不同。表1总结了所有测试的HL患者的CBC参数及其平均值±标准差。

霍奇金淋巴瘤亚型之间的白细胞（WBCs）差异计数：HL亚型的外周血WBCs差异谱型有所不同。淋巴细胞缺乏的亚型表现出明显的中性粒细胞增多症和淋巴细胞减少症，表现为所有组中中性粒细胞百分比和绝对计数最高，淋巴细胞比例最低。相比之下，淋巴细胞丰富和淋巴细胞占主导的亚型表现出相对保留的淋巴细胞百分比和较低的中性粒细胞计数，表明血液学特征相对稳定。结节硬化和混合细胞型亚型表现出中等程度的中性粒细胞增多和淋巴细胞减少。经典霍奇金淋巴瘤亚型的嗜酸性粒细胞计数略有升高，而单核细胞百分比在淋巴细胞丰富的病例中较高。所有亚型的嗜碱性粒细胞计数均保持较低。总体而言，这些发现突显了霍奇金淋巴瘤中不同亚型的炎症特征。表2总结了所有测试的WBCs差异计数参数及其平均值±标准差。

淋巴细胞缺乏的亚型表现出较高的乳酸脱氢酶（LDH）浓度，而淋巴细胞占主导的亚型表现出最高的ALT和AST水平。除了血液学指标外，我们还分析了几个生化标志物，以更好地了解每种HL亚型的代谢情况（图3）。乳酸脱氢酶（LDH）是一种常与细胞更新和肿瘤负担相关的标志物，在整个患者群体中表现出显著差异（单因素方差分析：F(6,550) = 2.29, p = 0.034）。通过Tukey检验的后分析确认，LD亚型的LDH水平显著高于NLPHL、经典HL、MC和NS亚型。由于LD病例数量较少（n = 6），这些发现应谨慎解读，并需要在更大样本量中进行验证。这表明这些患者的代谢活动程度较高或系统性疾病参与度更高。如图3A所示，LD亚型的平均LDH水平达到351 U/L，进一步证实了其与更具侵袭性表型的关联。NOS亚型的LDH水平为285 U/L。NS和LR亚型的LDH水平分别为250.9 U/L和244.85 U/L，而MC和经典HL亚型的LDH水平接近237 U/L。LP亚型的LDH水平最低，为223.6 U/L，暗示其疾病进程可能较不具侵袭性。这些差异突显了HL的异质性；特别是LD和NOS亚型中升高的LDH可能作为识别生物学上更具侵袭性病例的有用临床指标。

HL患者的生化参数：（A）不同HL亚型的血清LDH（乳酸脱氢酶）水平。条形图表示每个诊断类别的平均LDH（U/L）值。LDH的正常值为140–280 U/L。（B）不同HL亚型的血清尿酸水平。条形图表示每个诊断类别的平均尿酸（mg/dL）值。男性的尿酸正常值为3.4-7.0 mg/dL，女性为2.4-6.0 mg/dL。（C）不同HL亚型的血清ALT（丙氨酸氨基转移酶）水平。条形图表示每个诊断类别的平均ALT（U/L）值。ALT的正常值为10–40 U/L，女性为7–35 U/L。（D）不同HL亚型的血清AST（天冬氨酸氨基转移酶）水平。条形图表示每个诊断类别的平均AST（U/L）值。AST的正常值为10–40 U/L。图中的误差条表示标准偏差。

我们还评估了血清尿酸，它是嘌呤代谢的副产物，通常反映细胞更新情况（图3B）。NOS亚型的平均尿酸水平最高（接近5.0 mg/dL），可能表明该组的代谢负担较高。LP和MC亚型的尿酸水平接近4.8 mg/dL，而LR、经典HL和NS亚型的尿酸水平在4.5至4.7 mg/dL之间。有趣的是，LD亚型的LDH水平最高，但尿酸水平最低，平均为4.3 mg/dL。这种差异可能表明这些亚型在肾脏清除或特定代谢途径方面存在差异。虽然这些差异相对较小，但NOS和其他经典亚型中的较高水平在监测并发症时可能具有相关性。

为了评估潜在的肝脏受累或系统性炎症，我们检查了血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的平均水平（图3C和D）。有趣的是，LP组的酶活性最高，平均ALT约为40 U/L。其次是NOS亚型，为30 U/L，而LR、MC和NS亚型的AST水平在20至22 U/L之间。经典HL组的AST水平略低，为18 U/L。与其高LDH水平形成鲜明对比的是，LD亚型的AST水平最低，仅为7–8 U/L。虽然大多数患者的ALT值在正常范围内，但LP和NOS亚型的较高水平表明存在轻微的肝脏受累。我们在AST水平上也观察到了类似的模式（图3D）。LP亚型的AST水平最高，约为30 U/L，其次是MC和NOS亚型，分别为27–28 U/L。LR亚型的AST水平为25 U/L，而NS和经典HL亚型的AST水平在18–20 U/L之间。再次，LD亚型的AST值最低，约为15 U/L。总体而言，大多数亚型的ALT水平等于或略高于AST。然而，LD组呈现了一个独特的例外：其AST（15 U/L）几乎是ALT（7–8 U/L）的两倍。这种明显的差异，加上ALT的总体范围（约7至40 U/L）远大于AST（约15至30 U/L），表明这些亚型对肝细胞释放的影响存在显著差异。两种酶在淋巴细胞优势型中达到峰值，在淋巴细胞耗竭型中最低，这可能表明疾病组织学与全身肝脏反应之间存在特定关联。表3总结了所有HL患者的生化参数，包括平均值±标准差。

HL样本中CLDN6 mRNA和蛋白质表达的差异

我们关注Claudin-6（CLDN6），因为它被认为是一个有前途的诊断标志物和治疗靶点，尤其是在其表达通常仅限于健康成人组织的情况下。首先，我们使用定量RT-PCR测量了25名健康捐赠者和25名HL患者的淋巴结组织中的CLDN6 mRNA水平。结果非常显著：与健康对照组相比，HL组中的CLDN6 mRNA显著升高（P < 0.001；图4A）。事实上，相当一部分HL病例的CLDN6表达上调了超过两倍。

霍奇金淋巴瘤（HL）中CLDN6的分子模式。正常和HL淋巴结中的CLDN6 mRNA表达。(A) RT-PCR量化了来自25名健康捐赠者和25名HL患者的淋巴结样本中的CLDN6 mRNA水平。表达水平以相对于正常对照组的倍数变化表示，使用GAPDH作为内参基因。(B) 正常对照组和HL患者血清中的GATA-4浓度。ELISA量化了来自25名健康捐赠者和25名HL患者的血清样本中的GATA-4蛋白质水平。浓度以pg/ml表示。统计显著性使用非配对t检验确定，P < 0.05被认为具有统计学意义。(C) 正常和HL淋巴结中的Claudin-6蛋白质表达。代表性的Western blot显示了来自健康捐赠者和HL患者的淋巴结样本中的Claudin-6（26 kDa）蛋白质水平。GAPDH（37 kDa）作为加载对照。每条泳道代表一个单独的样本。与正常淋巴结相比，HL样本中的Claudin-6表达似乎降低。(D) Claudin-6的免疫组化检测。(1) 阳性对照：显示强膜性和胞质性Claudin-6染色的结直肠癌。(2) 骨髓阴性对照显示正常造血和脂肪细胞成分中无Claudin-6染色。(3) 技术阴性对照（未经一级抗体处理的脂肪组织）确认了检测的特异性。(4) 测试的HL组织显示恶性淋巴浸润中无或极少Claudin-6免疫染色，这与Western blot分析中观察到的蛋白质表达减少一致。

为了了解驱动这种mRNA激增的原因，我们研究了GATA-4，这是一种已知能调节CLDN6基因的转录因子。当我们使用ELISA分析淋巴结裂解物时，发现HL样本中的GATA-4蛋白质水平显著升高（P < 0.0001；图4B）。这种强烈的相关性表明，过度活跃的GATA-4可能促进了这些患者中CLDN6的转录激活。然而，当我们检查实际的蛋白质水平时，数据出现了意想不到的转折。尽管mRNA转录水平很高，但Western blot分析显示HL组织中的Claudin-6蛋白质表达实际上很低甚至无法检测到，几乎与健康组织中的基线水平相同（图4C）。我们使用GAPDH确认了这些结果的可靠性，它在所有样本中显示出一致的表达作为加载对照。这种高mRNA与无蛋白质之间的明显差异强烈表明存在生物学障碍，可能是转录后调控机制抑制了蛋白质的合成。

讨论

霍奇金淋巴瘤（HL）是一种相对罕见的恶性肿瘤，占全球所有肿瘤的不到1%[8]。其生物学复杂性很高，起源于淋巴组织，其特征是存在Reed-Sternberg（RS）细胞，这些细胞是异常的多核巨细胞，能够驱动肿瘤增殖并显著改变周围的免疫微环境[8,9,10]。这项研究是首次对巴勒斯坦人群中的HL进行全面的临床病理学和分子学研究。通过绘制他们的人口统计学、血液学和分子特征，我们提供了关于区域疾病特征如何反映和偏离全球趋势的关键见解。

在全球范围内，特别是在发达国家，HL通常表现出双峰年龄分布。然而，在我们的研究中，诊断时的平均年龄（约33.7岁）与其他中东人群的数据明显一致，这些地区的疾病主要影响年轻人[11,12,13]。这种区域性的年龄模式变化可能反映了环境暴露、社会经济因素和传染病流行率的变化，这些因素被认为会影响发展中国家的HL流行病学。

有趣的是，我们研究人群中结节硬化型（NS）亚型的优势可能归因于流行病学的变化，类似于其他邻国（如约旦）的趋势，那里NS的患病率正在上升，而EBV阳性亚型（如混合细胞型）的患病率则相对较低。这可能部分解释了EBV状态信息的缺失。

性别分布显示出亚型特异性差异，MC和NOS亚型在男性中更常见，而LD和LR亚型则相对女性占优势，NS则影响两性[14,15,16]。与国际流行病学趋势一致，NS成为最常见的亚型，通常与较年轻的发病年龄、纵隔受累和相对良好的预后相关。相比之下，MC亚型与较年长的年龄组、较低的社会经济地位以及与Epstein–Barr病毒感染的更强关联有关[17,18,19]。尽管LD病例相对较少，但它们表现出提示疾病侵袭性的临床特征，包括升高的LDH水平和增加的肿瘤代谢活性。这些发现与公认的不良预后指标一致，这些指标被纳入了国际预后评分系统（IPS）中，尽管解释时应考虑该亚型的样本量有限[20,21,22]。然而，由于病例数量有限，关于LD亚型特征的结论应谨慎解读。

我们的统计分析（单因素方差分析）确认了这些HL亚型的生物学异质性直接体现在患者的血液学特征中。我们观察到所有HL亚型的平均血红蛋白水平显著降低，其中LD组的下降最为严重。此外，这些贫血状态经常伴随着小细胞变化（反映在MCV降低）和炎症标志物（如ESR）的升高。进一步测试显示WBC和RBC计数存在显著的亚型依赖性波动。最终，这些独特的血液学特征突显了HL变体之间的深刻生物学多样性，直接反映了不同亚型如何调节肿瘤微环境、改变全身免疫反应并驱动疾病的侵袭性。重要的是，我们在本研究中发现的血液学异常，包括贫血、升高的ESR和升高的LDH水平，直接对应于国际预后评分（IPS）中公认的预后参数。这些标志物可能反映了肿瘤微环境中的潜在疾病负担和炎症活性。此外，通过卡方分析和方差分析发现的统计学显著差异强烈支持HL中存在亚型特异性的临床和血液学模式。此外，未进行多重比较校正可能会增加假阳性结果的可能性，因此结果应谨慎解读。

例如，NS亚型中的白细胞增多和淋巴细胞增多，MC和LD变型中的中性粒细胞增多和贫血，以及NS和MC中的嗜酸性粒细胞增多，可以为监测疾病活动提供关键的支持性标志[29,30,31]。从临床角度来看，识别这些亚型特异性的血液学模式是可行的。这些结果进一步强调了使用常规血液学参数作为成本效益高的工具在疾病预后和管理中的价值，特别是在资源有限的医疗环境中。它可能支持早期风险分层和监测，尤其是在先进分子诊断手段有限的资源有限的环境中。然而，由于样本量有限，应谨慎解读与LD亚型相关的发现。

观察到的WBC分布模式突显了HL中周围血细胞分布的显著亚型特异性改变，淋巴细胞耗竭型病例以严重的淋巴细胞减少和明显的中性粒细胞增多为特征，反映了侵袭性的炎症表型。相比之下，淋巴细胞丰富和淋巴细胞优势型亚型表现出保留的淋巴细胞特征，表明宿主免疫反应更为完整，这可能有助于它们更良好的临床表现。这些观察基于外周血计数，并不代表全面的免疫谱型。

HL的发病机制是多因素的，由复杂的分子改变驱动，这些改变会破坏细胞周期调控、促进免疫逃逸并增强对凋亡的抵抗。先前的研究将反复出现的遗传异常归因于NF-κB激活、JAK/STAT信号通路失调以及抗原呈递途径的改变，如B2M突变[23,24,25]。在这场风暴的中心是经典HL中的恶性霍奇金细胞和Reed-Sternberg（HRS）细胞，以及NLPHL中的淋巴细胞优势（LP）细胞，这两种细胞都积极驱动肿瘤扩张并强烈重塑免疫微环境[26]。在此基础上，我们的研究深入探讨了Claudin-6（CLDN6）的作用，这是一种越来越被认为能增强细胞增殖、迁移和凋亡抵抗的紧密连接蛋白。如前所述，HL组织中的CLDN6 mRNA显著升高，同时GATA-4水平也升高，这可能表明存在需要进一步研究的潜在调控相互作用[27,28,29,30,31]。然而，CLDN6蛋白质表达的一致缺失可能表明存在转录后调控机制。观察到的CLDN6 mRNA水平升高与蛋白质表达极低之间的明显差异表明存在复杂的转录后调控控制。几种生物学机制可能解释了这一现象，包括microRNA介导的翻译抑制、mRNA稳定性的改变或Claudin-6蛋白质的泛素-蛋白酶体介导的降解。在其他涉及紧密连接蛋白的恶性肿瘤中也报告了类似的mRNA-蛋白质不一致性，这突显了肿瘤特异性调控网络的复杂性。此外，HL组织中的炎症细胞因子和微环境压力可能干扰翻译效率。上述结果表明可能存在转录后调控机制。然而，上述结论仍然是假设性的，需要进一步的研究。

然而，功能验证实验（如microRNA谱型分析或蛋白酶体抑制试验）超出了本研究的范围。因此，这种调控阻滞的机制基础需要在未来的实验模型中进行进一步研究。这种差异可能具有潜在的生物学意义；然而，CLDN6在靶向治疗策略中的作用仍处于初步阶段，需要进一步验证。虽然观察到的CLDN6转录上调可能需要进一步研究，但目前尚不能得出关于其作为治疗靶点的适用性或靶向霍奇金淋巴瘤转录途径的有效性的明确结论。

从解剖学表现来看，我们研究中的活检样本最常来自胸腔和颈部淋巴结，这与NS和MC亚型的已知解剖学偏好完全一致。有趣的是，我们在希伯伦省观察到相对较高的病例发生率。这种地理变异可能受到环境暴露、遗传倾向或医疗可及性的影响。尽管需要进一步基于人群的流行病学研究来确认这些局部聚集的根本原因。最终，这些发现与约旦、埃及、黎巴嫩和伊拉克的区域数据高度一致[31]。然而，我们在淋巴瘤（LR）和淋巴细胞白血病（LD）亚型分布中观察到的细微差异凸显了一个关键的区域性需求：建立区域性淋巴瘤登记系统，并开展前瞻性分子研究，以更准确地界定中东地区的疾病特征和治疗反应。重要的是，这项研究来自资源有限的医疗环境，提供了具有临床意义的数据，突显了在先进分子诊断技术可能无法常规应用的环境中，可获取的血液学标志物的诊断和预后价值。

该研究具有多个优势，包括相对较大的样本量（代表了巴勒斯坦地区最大的淋巴瘤人群数据库之一）、临床病理学与分子分析的结合、国家登记数据的利用以及基于实验室的生物标志物评估和全面的统计亚组分析。关于EB病毒（EBV）状态和自身免疫相关疾病的数据并不总是可获得的，因此未纳入分析中，这可以被视为该研究的一个局限性。由于缺乏基于结果的数据分析（如国际预后评分（IPS）计算、生存分析及多变量分析），因此难以得出明确的预后结论。未来需要进行前瞻性研究，包括病毒谱型分析、CLDN6相关通路的扩展分子表征、全面的临床病理学关联研究以及长期预后分析，以验证潜在的生物标志物，并进一步阐明疾病发病机制和治疗潜力。