与神经元相关的转录富集现象与胃癌的特定生物学状态相关，并预示着较差的预后

《Annals of Surgical Oncology》：Neuron-Associated Transcriptional Enrichment Is Associated with Distinct Biological States and Predicts Poor Prognosis in Gastric Cancer

　　摘要
背景
外周神经系统可能促进肿瘤的发展、进展和转移；然而，胃癌（GC）患者肿瘤微环境中神经元特征的临床相关性仍有待充分阐明。

患者与方法
我们利用公开数据库中的大规模转录组数据和临床数据，评估了一个名为xCell的评分系统，该系统能够量化GC肿瘤中与神经元相关的基因表达程序的相对富集程度。这使我们能够将每个队列中的样本分为神经元评分高和神经元评分低的组别，其中评分较高的三分之二样本被定义为高评分组。通过分析神经递质受体表达、基因集富集、肿瘤微环境组成、基因组特征以及患者生存情况，来评估神经元富集与肿瘤生物学特性之间的关联。

结果
神经元评分高的GC肿瘤表现出β-肾上腺素能、多巴胺和毒蕈碱乙酰胆碱受体基因表达的显著富集，这与增强的神经化学信号传导潜力一致。在肿瘤细胞水平上，神经元评分高的组与上皮-间质转化（EMT）程序的激活相关，而与细胞增殖相关的通路则在神经元评分低的肿瘤中更为丰富。尽管突变负担较低，但神经元评分高的肿瘤还显示出减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的基质成分以及升高的肿瘤内异质性。在两个队列中，神经元评分高的肿瘤都与较差的总体生存率相关，并且在多变量分析中仍然独立地与预后相关。

结论
神经元评分高的GC肿瘤始终与特定的神经递质受体基因表达模式、增强的EMT程序、减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的肿瘤内异质性和较差的预后相关。这些观察结果表明，肿瘤中的神经元评分可能是一个潜在的GC生物学指标。

背景
外周神经系统可能促进肿瘤的发展、进展和转移；然而，胃癌（GC）患者肿瘤微环境中神经元特征的临床相关性仍有待充分阐明。

患者与方法
我们利用公开数据库中的大规模转录组数据和临床数据，评估了一个名为xCell的评分系统，该系统能够量化GC肿瘤中与神经元相关的基因表达程序的相对富集程度。这使我们能够将每个队列中的样本分为神经元评分高和神经元评分低的组别，其中评分较高的三分之二样本被定义为高评分组。通过分析神经递质受体表达、基因集富集、肿瘤微环境组成、基因组特征以及患者生存情况，来评估神经元富集与肿瘤生物学特性之间的关联。

结果
神经元评分高的GC肿瘤表现出β-肾上腺素能、多巴胺和毒蕈碱乙酰胆碱受体基因表达的显著富集，这与增强的神经化学信号传导潜力一致。在肿瘤细胞水平上，神经元评分高的组与上皮-间质转化（EMT）程序的激活相关，而与细胞增殖相关的通路则在神经元评分低的肿瘤中更为丰富。尽管突变负担较低，但神经元评分高的肿瘤还显示出减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的基质成分以及升高的肿瘤内异质性。在两个队列中，神经元评分高的肿瘤都与较差的总体生存率相关，并且在多变量分析中仍然独立地与预后相关。

结论
神经元评分高的GC肿瘤始终与特定的神经递质受体基因表达模式、增强的EMT程序、减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的肿瘤内异质性和较差的预后相关。这些观察结果表明，肿瘤中的神经元评分可能是一个潜在的GC生物学指标。肿瘤微环境（TME）在塑造癌症的发展、进展和转移中起着关键作用。在胃癌（GC）中，TME的组成部分（如免疫细胞、癌相关成纤维细胞、内皮细胞和细胞外基质重塑）会影响临床结果和治疗反应。还有越来越多的证据表明，外周神经会主动调节TME的成分并影响肿瘤的进展。迄今为止，外周神经系统与GC之间的关系主要是通过常规的苏木精和伊红染色来评估的，以确定神经周围浸润（PNI），即癌细胞侵入神经周围组织或神经束。虽然PNI是GC的一个公认的不良预后因素，但它仅反映了肿瘤对神经的侵袭，可能无法反映神经对TME的侵袭情况。因此，需要更全面地评估外周神经与肿瘤之间的相互作用。例如，肿瘤通过神经营养信号招募神经纤维并诱导神经发生，而神经元衍生的信号则通过代谢重编程和免疫调节等机制促进癌症进展。这些发现表明，神经浸润是TME中一个生物活性成分，而不仅仅是肿瘤在局部神经附近的生长现象。实际上，乳腺癌TME中的神经已被证明在促进肿瘤侵袭性方面起着关键作用，乳腺癌TME中高密度的神经纤维与较差的生存结果相关。目前，临床实践中缺乏一种客观的方法来量化TME中的神经纤维，这主要依赖于组织学评估。最近的研究表明，当用两种独立抗体对每个肿瘤块的整个组织切片进行染色时，85%的乳腺癌患者中检测到了神经纤维；而当分析组织微阵列时，这一比例仅为12-28%。在这方面，转录组分析方法的进步可能有助于进一步探究GC TME中与神经元相关的程序之间的关系。xCell是一种基于基因签名的计算机算法，可以从基因表达数据中分析64种免疫细胞、基质细胞和干细胞的细胞类型富集情况。利用xCell和实际患者队列中的转录组数据，我们能够量化特定细胞相关转录程序的相对富集程度，并评估它们在TME中的临床相关性，例如巨噬细胞、树突状细胞、CD8+细胞、调节性T细胞、微血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞。这种方法对于那些极其罕见、需要通过组织学检测才能发现的细胞相关程序特别有效。

在本研究中，我们使用一个强大的反卷积框架和xCell算法，结合公开的GC数据集（包括癌症基因组图谱（TCGA）和一个独立的基因表达综合数据库（GEO）GSE84437及其临床注释，来研究GC中与神经元相关的转录富集的临床和生物学意义。我们量化了肿瘤中与神经元相关的基因表达程序的相对富集程度，并评估了它们与患者生存率、神经元通路富集、免疫特征和基因组特征之间的关联。

患者与方法
我们从TCGA胃腺癌队列（TCGA-STAD）和独立验证队列GSE84437中获取了GC的转录组数据和临床数据。对于TCGA-STAD，基因表达值来自RNA测序（RNA-seq）表达矩阵，并在log2(TPM + 0.05)的对数转换尺度上进行分析。对于GSE84437，使用了原始研究提供的公开微阵列表达矩阵；必要时，通过选择样本中平均表达最高的探针，将探针级别的测量值汇总为基因级别的表达值。所有分析都在每个队列内独立进行，以避免跨平台伪影。表达矩阵使用标准程序进行了标准化和协调。临床注释使用标准命名法和样本标识符进行了协调。缺少所需转录组谱型或xCell神经元评分的样本被排除在后续分析之外。除非另有说明，所有统计分析均使用R（版本4.3.0）进行。

使用xCell推断神经元特征
我们使用xCell从大规模转录组中推断出细胞类型富集评分。神经元特征是通过每个肿瘤样本的xCell神经元评分来估计的，该评分代表肿瘤中神经元基因表达特征的相对富集程度，而不是直接量化组织学上可识别的神经或神经浸润。用于神经元评分的基因列在补充表1中。在每个队列中，神经元评分呈现出高度左偏的分布，大部分样本集中在低值附近（补充图S1），表明生物学意义上的变异集中在分布的上尾部分，而不是在整个范围内线性变化。为了保持生物学对比度同时保持足够的样本量，我们采用了基于分布的分位数分层策略，将神经元评分分布最低的33%的肿瘤分类为低评分，其余病例分类为高评分。这种方法在保持足够的样本量的同时增加了对比度，便于后续的生存分析和分子分析。突变负担和肿瘤内异质性指标来自之前发布的TCGA衍生数据集，特别是Thorsson等人报告的全面免疫基因组分析。在该研究中，肿瘤内异质性是根据TCGA测序数据推断的肿瘤亚克隆结构来量化的。这些预先计算的指标与神经元评分分层相结合，以评估神经元特征富集与肿瘤基因组特征之间的关系。

神经递质受体表达分析
为了评估与神经元富集相关的神经化学信号特征，我们比较了每个队列中神经元评分高和低肿瘤中选定的神经递质受体基因（包括β-肾上腺素能、多巴胺和毒蕈碱乙酰胆碱受体家族）的表达水平。效应大小使用Hedges’ g和95%置信区间进行估计。结果使用森林图进行可视化，以便比较不同基因和队列之间的效应大小和方向。统计显著性测试单独进行，并与效应大小估计一起解释。

肿瘤微环境特征分析和功能富集分析
为了表征与神经元富集相关的TME差异，我们使用xCell衍生的细胞类型评分来评估免疫和基质组分特征。使用分子特征数据库（MSigDB）的标志基因集进行了基因集富集分析（GSEA），以识别与神经元评分高和低肿瘤相关的生物通路。对于每个队列，根据神经元评分高和低组之间的差异表达方向和大小对基因进行排序，并使用标准的排列程序评估富集显著性。

统计分析和可视化
所有统计分析均在R（版本4.3.0）中进行。除非另有说明，所有测试均为双侧检验。对于涉及两个独立组的比较，使用Wilcoxon秩和检验（Mann–Whitney U检验）进行统计显著性评估。对于涉及多个组的比较，应用Kruskal–Wallis检验，然后在适当的情况下进行后续分析。在适用的情况下，使用Benjamini–Hochberg方法进行多重检验校正。效应大小在相关情况下报告95%置信区间，特别是对于比较神经元评分高和低肿瘤的分析。总体生存率使用Kaplan–Meier估计和log-rank检验进行分析，Cox比例风险回归用于单变量和多变量生存分析。

神经元评分高的GC与高表达的神经递质反应性受体相关
我们首先比较了神经元评分高和低肿瘤之间神经递质受体基因的表达谱，因为TME中神经与癌细胞之间的通信通常通过影响肿瘤进展和转移的神经递质依赖性信号通路介导。为此，我们使用基于预定义神经元基因集的xCell衍生的神经元评分来量化每个肿瘤中的神经元特征富集，并相应地对样本进行分层，然后检查神经元评分高和低肿瘤之间神经递质受体基因的差异表达。在TCGA队列中，神经元评分高的肿瘤一致表现出所有检测到的神经递质受体基因（包括β-肾上腺素能受体（ADRB1-3）、多巴胺受体（DRD1-3）、毒蕈碱乙酰胆碱受体（CHRM1、CHRM2、CHRM4和CHRM5）以及感觉传入相关信号基因（TACR1、CALCRL、RAMP1和TRPV1）的显著更高表达（图1，左侧面板）。使用Hedges’ g进行的效应大小估计显示这些基因之间存在中等到大的正效应，置信区间不重叠于零，表明两组之间存在稳健且生物学上显著的差异。接下来我们在GSE84437队列中验证了这些关联（图1，右侧面板）。在这个验证数据集中，出现了一种更具选择性的模式。在感觉传入相关基因中，CGRP受体复合体的组成部分CALCRL和RAMP1在神经元评分高的肿瘤中仍然显著上调，且在两个队列中的效应大小和假发现率调整后的显著性都是一致的。相比之下，TACR1（P物质受体）和TRPV1表现出队列依赖性模式，在TCGA中达到统计显著性，但在GSE84437中则没有。对于几种经典神经递质受体也观察到了类似的趋势，其效应方向基本保持不变，但关联强度减弱，且在验证队列中的置信区间更宽。总之，这些发现表明，富含神经元特征的肿瘤与对多种神经递质模式的增强转录反应性相关。重要的是，独立队列中CGRP受体轴的持续上调突显了感觉传入信号作为神经元评分高的胃癌（GCs）的一种可重复的神经化学特征，而其他受体的队列特异性行为则表明不同的神经-肿瘤通信通路是依赖于具体情境的。图1 这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。全尺寸图像显示了胃癌中神经元评分与神经递质受体表达之间的关联；森林图展示了TCGA和GSE84437队列中神经元评分高和评分低肿瘤之间神经递质受体基因差异表达的效果大小估计；点表示神经元评分高与评分低肿瘤之间的标准化效果大小（Hedges’s g），水平条代表95%置信区间；基因按受体家族组织，包括β-肾上腺素能、多巴胺和毒蕈碱乙酰胆碱受体，以及与感觉传入相关的受体（P物质受体：TACR1、CGRP受体复合体；CALCRL/RAMP1和痛觉受体相关受体；TRPV1）。

为了阐明与高神经元评分相关的更广泛的生物学程序，我们接下来检查了神经元评分是否与重要的癌症生物学相关的不同转录程序有关。我们关注上皮-间质转化（EMT）和细胞周期相关通路，这些通路代表了肿瘤表型可塑性的互补轴。基因集富集分析（GSEA）显示与神经元评分相关的转录程序存在明显差异。在TCGA和GSE84437队列中，标志性的EMT基因集在神经元评分高的肿瘤中一致富集（图2A）。相比之下，神经元评分低的肿瘤显示出细胞周期和细胞增殖相关通路的显著富集，包括E2F靶标、G2M检查点和MYC靶标基因集，以及与DNA修复和未折叠蛋白反应相关的通路（图2B）。所有与细胞增殖相关的程序都表现出负的标准化富集分数，表明在神经元评分低的肿瘤中优先激活，而EMT在神经元评分高的肿瘤中方向性富集，在两个队列中观察到一致的模式。这些发现共同描绘了与高神经元评分相关的不同转录状态，其特征是神经元评分高的肿瘤中EMT相关程序的激活，以及神经元评分低的肿瘤中的增殖信号。

为了进一步描述与高神经元评分相关的TME（肿瘤微环境），我们检查了高神经元评分和低神经元评分肿瘤中的免疫细胞浸润和免疫相关转录程序。使用基于xCell的去卷积技术，高神经元评分肿瘤在TCGA和GSE84437队列中都表现出多种免疫细胞群体的浸润减少。在TCGA队列中，观察到CD4+记忆T细胞、Th1细胞、Th2细胞、调节性T细胞、自然杀伤（NK）细胞以及M1和M2巨噬细胞的显著增加（图3A）。值得注意的是，巨噬细胞亚群和Th1细胞显示出特别强的差异，并具有显著的统计显著性。在GSE84437队列中也独立验证了类似的模式，其中神经元评分低的肿瘤同样显示出CD4+记忆T细胞、Th1细胞、Th2细胞、NK细胞和巨噬细胞亚群的显著增加，且Th1细胞显示出特别强的差异并具有显著的统计显著性（图3A）。在两个队列中，效应的方向高度一致，尽管在转录组平台和队列组成上存在差异，大多数免疫细胞类型在神经元评分低的肿瘤中表现出增加的浸润。与这些细胞水平发现一致，基因集富集分析显示高神经元评分肿瘤中的免疫相关转录程序减弱。标志性的干扰素（IFN）-α和IFN-γ反应基因集在两个队列中的神经元评分低肿瘤中显著富集，表现为负的标准化富集分数和低于GSE推荐阈值的假发现率（FDR）< 0.25（图3B）。这些结果共同表明，低神经元评分的GC与免疫浸润和干扰素反应的肿瘤微环境相关，在独立的胃肿瘤队列中可重复观察到。

为了进一步描述与高神经元评分相关的TME的非免疫成分，我们接下来使用基于xCell的去卷积技术检查了基质细胞群体。与免疫组分不同，高神经元评分肿瘤在TCGA和GSE84437队列中表现出多种基质细胞类型的持续增加的浸润（图4A）。在TCGA队列中，高神经元评分肿瘤显示出脂肪细胞、成纤维细胞、淋巴内皮细胞和周细胞的显著富集分数，尤其是成纤维细胞（图4A）的差异尤为明显。在GSE84437队列中也独立验证了类似的模式，其中高神经元评分肿瘤显示出成纤维细胞、淋巴内皮细胞、微血管内皮细胞和周细胞的显著升高水平。尽管各个基质成分的幅度在队列间有所不同，但效应的方向高度一致，基质浸润在两个队列中都一致增加。为了进一步探索与神经元评分相关的基因组特征，我们分析了来自公开可用TCGA数据集的突变相关分数。使用TCGA Pan-Cancer Atlas中整理的突变负荷相关指标，高神经元评分肿瘤显示出与低神经元评分肿瘤不同的基因组特征（图4B）。具体来说，高神经元评分肿瘤表现出显著的肿瘤内异质性增加，而沉默和非沉默突变率在低神经元评分肿瘤中显著增加。相比之下，高神经元评分肿瘤和低神经元评分肿瘤在同源重组缺陷、基因组改变的比例或预测的单核苷酸变异衍生新抗原负荷方面没有观察到一致差异。这些发现表明，神经元评分与特定的基因组变异模式相关，其特征是高神经元评分肿瘤中的肿瘤内异质性增加和整体突变负担降低。

我们上面分析获得的数据表明，基于神经元评分的临床结果数据可能存在重要差异。为了评估这一令人兴奋的可能性，我们检查了神经元评分与临床病理参数以及患者生存期的关系。在两个队列中，神经元评分在病理阶段或肿瘤范围上没有显著差异（图5A）。在TCGA队列中，神经元评分在AJCC阶段以及T和N类别中是可比的。同样，在GSE84437队列中，也没有观察到神经元评分在T或N类别上的显著差异。然而，尽管与病理阶段无关，神经元评分与患者生存期显著相关（图5B）。被分类为高神经元评分的患者在两个队列中的总体生存期明显较差（TCGA中p = 0.044，GSE84437中p < 0.001）。此外，在TCGA队列中，高神经元评分肿瘤不太可能是MSI高，且ERBB2 mRNA表达在低神经元评分肿瘤中显著更高（补充图S2A,B）。接下来，我们检查了神经元评分与TCGA分子亚型（CIN、EBV、GS和MSI）之间的关系。分子亚型的分布在高神经元评分和低神经元评分肿瘤之间有显著差异（补充图S3A，p < 0.001），高神经元评分肿瘤富含GS和CIN亚型，而低神经元评分肿瘤相对富含MSI和EBV亚型（补充图S3B）。这些发现共同表明，神经元评分捕获了标准分期参数未反映的临床相关信息。

由于Kaplan–Meier分析显示神经元评分与总体生存（OS）之间存在关联（图5），我们最终使用Cox比例风险回归分析评估了神经元评分的预后价值。分别在TCGA和GSE84437队列中进行了单变量和多变量Cox回归分析。在单变量分析中与OS显著相关的变量被纳入多变量模型。在两个队列中，高神经元评分与较差的OS显著相关，并且在多变量调整后仍然独立相关（表1）。在TCGA队列中，高神经元评分肿瘤的患者死亡风险增加。这种关联在GSE84437队列中也得到独立验证，其中神经元评分同样与OS显著相关。表1 单变量和多变量Cox回归分析用于OS。

通过整合两个独立胃癌患者队列的大规模转录组分析，我们发现肿瘤微环境的神经元评分有助于识别临床和生物学上不同的肿瘤状态，揭示了之前未被充分认识的胃癌生物学成分，这些成分可能与疾病进展相关。具体来说，我们观察到高神经元评分肿瘤不仅与神经递质受体基因表达的富集相关，还与增强的上皮-间质转化程序、减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的肿瘤内异质性和较差的总体生存相关。这些数据突显了之前未被充分认识的胃癌生物学成分，这些成分与疾病进展相关。在多种癌症类型中积累的证据强调了神经系统在肿瘤发展、进展和转移传播中的功能作用。实验工作进一步表明，交感神经去神经支配或药理学β-肾上腺素能阻断可以抑制肿瘤生长和转移，强调了神经-肿瘤相互作用的功能相关性。在胰腺癌中，感觉神经浸润已被证明可以促进神经重塑并支持侵袭性肿瘤表型。除了直接的神经接触外，包括肾上腺素能和胆碱能轴在内的神经化学信号通路已被牵涉到应激介导的转移、基质重塑和免疫抑制中。本研究在大型患者队列中系统地展示了肿瘤微环境中的神经元评分与神经递质受体基因表达之间的关联。根据xCell定义的神经元基因特征被分类为高神经元评分的肿瘤表现出β-肾上腺素能、多巴胺和毒蕈碱乙酰胆碱受体基因的表达增加，以及与感觉传入相关的受体（尤其是降钙素基因相关肽（CGRP）受体复合体成分CALCRL和RAMP1）的表达增强。这种模式在基于RNA-seq的TCGA队列中非常稳健，并且尽管统计功效降低，但在独立的微阵列队列中大体上保持了方向一致性。这些发现表明，神经元评分较高的肿瘤在转录层面上对多种神经化学信号具有响应能力，揭示了神经-肿瘤相互作用的分子特征，这些特征超出了组织学上定义的神经周围侵犯范围。尽管之前的研究主要关注局部的神经-肿瘤接触，但我们的结果表明，神经元的影响可能在更广泛的生态系统中塑造基因表达程序，并与免疫和基质成分动态互动。值得注意的是，CGRP信号传导已被确定为肿瘤组织中血管张力、基质重塑和免疫调节的关键调节因子。我们在不同队列中观察到神经元评分较高的胃癌中CGRP受体复合物（CALCRL/RAMP1）的一致性上调，从而强调了感觉传入CGRP信号传导作为神经-肿瘤交流的一个生物学上相关且可重复的轴。这些结果表明，神经元评分不仅仅是一个替代传统肿瘤负荷或局部侵犯指标的指标。相反，TACR1和TRPV1的队列依赖性行为表明，P物质相关通路和痛觉感受器相关通路可能以更具体的情境方式运作，这可能受到肿瘤分化状态、炎症环境或上皮-间充质转化程序的影响。总的来说，这些观察结果支持了一个模型，即胃癌中的神经化学相互作用在感觉信号轴上具有层次结构，而CGRP介导的通路是神经元评分较高肿瘤的一个主导且更可重复的特征。

EMT（上皮-间充质转化）是肿瘤进展中的一个核心过程，常与转移能力、治疗抵抗性和免疫逃逸相关。在本研究中，高神经元评分与胃癌中的EMT相关转录状态一致相关，而低神经元评分的肿瘤则表现出细胞增殖程序的富集。这些观察结果与新兴证据一致，即EMT特征能够捕捉到胃癌中的临床相关肿瘤生物学特征。我们之前报告过，升高的EMT特征与不良微环境特征、血管生成相关程序和较差的生存率相关，并进一步报告了EMT与细胞增殖相关信号之间的负相关关系。我们的发现将EMT置于神经元背景中：EMT富集的状态主要出现在神经元评分较高的肿瘤中，而细胞增殖相关程序则集中在神经元评分较低的肿瘤中，不同平台之间的方向一致性也得到了验证。这些数据表明，神经元评分可能与一种以表型可塑性增加而非增殖优势为特征的肿瘤细胞状态相关。这一解释还得到了神经元评分较高肿瘤中GS（间变性鳞状细胞）和CIN（癌性内皮增生）亚型富集的支持，因为这两种亚型都与胃癌中的间充质、基质或染色体不稳定性相关。相比之下，神经元评分较低的肿瘤中MSI（微卫星不稳定）和EBV（Epstein-Barr病毒）亚型的相对富集与其更活跃的免疫反应和较低的间充质转录特征一致。鉴于先前的研究指出神经化学信号在癌症进展中的作用，神经元评分与EMT之间的转录关联在生物学上是合理的。β-肾上腺素能信号传导已被广泛认为与促进肿瘤的过程（包括侵袭和类似EMT的转化）相关，并能激活cAMP-PKA等经典的第二信使通路以及情境依赖性的应激反应回路。与这一概念一致，我们分析中识别出的高神经元评分肿瘤表现出多个神经递质受体基因的协调上调，同时也表现出EMT相关转录程序的优先富集。同时，不同神经元评分层中EMT与细胞增殖程序的差异富集与一个更广泛的“状态”模型相符，即高神经元评分肿瘤更倾向于表现出可塑的、与侵袭相关的表型，而低神经元评分肿瘤则更强烈地反映简单的细胞增殖生物学特征。

越来越多的证据表明，神经系统可以调节肿瘤微环境中的免疫细胞活性。实验研究表明，肾上腺素能信号传导可以减弱CD8+ T细胞的细胞毒性，抑制NK细胞功能，并促进促进肿瘤进展的调节性免疫细胞的积累。在这方面，我们的研究提供了一个系统性的转录组视角，将神经元特征与胃癌中的免疫景观联系起来。具体来说，高神经元评分肿瘤在两个独立队列中一致表现出多种免疫细胞亚群的浸润减少和IFN相关信号减弱。尽管当前分析未能建立因果关系或阐明潜在机制，但这些发现的可重复性和方向一致性表明，神经元评分与相对免疫贫乏的肿瘤微环境相关。重要的是，这种关联是在整体转录程序层面观察到的，而不仅仅是局部的神经-肿瘤接触，从而将先前的观察结果扩展到了组织学上定义的神经周围侵犯范围之外。这些结果强调了神经元评分在揭示胃癌中之前未被充分认识的免疫异质性轴方面的潜力，这对肿瘤-免疫相互作用和治疗反应性具有潜在意义。

肿瘤内的异质性是肿瘤复杂性的一个基本维度，反映了单一病变中多种细胞状态的共存。在本分析中，尽管高神经元评分肿瘤的沉默和非沉默突变率较低，但它们表现出更高的肿瘤内异质性。这种模式表明，这些肿瘤中的基因组多样性不能仅用突变负担来解释。相反，它指向在高神经元评分背景下突变负荷与异质性之间的脱钩。重要的是，这种增强的异质性出现在那些还表现出肿瘤微环境协调改变的肿瘤中，包括免疫浸润减少、基质成分扩张和EMT相关转录程序的富集。虽然当前研究未能解决这些变化的潜在机制，但这些特征在不同队列中的平行出现表明，高神经元评分标志着一个肿瘤环境，在这种环境中，表型多样化可能独立于持续的突变过程而发生。从这个角度来看，神经元评分可能描绘出一个肿瘤生态系统，在这个系统中，细胞多样性是通过适应性状态而非遗传多样化产生的，这一假设值得直接进行实验验证。

在本研究中，高神经元评分的肿瘤在两个独立的胃癌队列中一致与较差的总体生存率相关。重要的是，即使在纳入已建立的临床病理学因素的多变量分析中，这种关联仍然显著，表明神经元评分能够捕捉到超出传统临床参数的预后信息。值得注意的是，神经元评分与肿瘤分期或局部范围无关，但在生存分析中仍具有预后意义。这种分离表明，肿瘤整体的神经元评分可能反映了传统分期系统无法充分代表的肿瘤生物学方面。神经元评分可能不仅仅是一个替代肿瘤负荷或解剖学进展的指标，而可能指示一个与不良临床结果相关的独特生物学背景。这种关联在不同转录组平台上的一致性进一步支持了神经元富集作为胃癌预后特征的普遍性。尽管不同队列之间的效应大小有所差异，但一致的方向性和独立性排除了队列特异性假象，强调了神经元评分在肿瘤生态系统中的生物学相关性。此外，神经元评分与MSI高状态以及ERBB2表达之间的负相关表明，神经元特征富集与已建立的分子特征相关，但并非简单地可互换，而是反映了不同的肿瘤状态。与此一致，我们还观察到神经元评分与TCGA（肿瘤基因组学）分子亚型之间的显著关联，高神经元评分肿瘤富含GS和CIN亚型，而低神经元评分肿瘤则相对富含MSI和EBV亚型。这进一步支持了神经元特征富集与已建立的分子分类方案相关但不可完全替代的观点。从转化医学的角度来看，xCell衍生的神经元评分目前应被视为基于整体转录组数据的研究导向指标，而不是可以直接应用的临床检测方法。虽然像神经密度或神经周围侵犯这样的组织病理学特征已被广泛研究，但当前工作通过捕捉肿瘤生态系统中的神经元信号响应性转录状态，探讨了肿瘤生物学的不同层面。我们的方法旨在识别与不良结果相关的生物学和临床相关的肿瘤状态，而不仅仅是量化神经结构本身。在这方面，神经元评分为分子风险分层和未来针对神经-肿瘤相互作用的治疗策略提供了概念框架。未来的研究需要结合转录组分析、空间分析和基于病理学的评估，以确定是否可以开发出实用的临床替代检测方法。

尽管有这些有趣的发现，但仍有一些局限性需要考虑。这里使用的神经元评分是从整体转录组数据推断出来的，我们无法直接确认该评分反映了肿瘤微环境中的可识别神经元或神经密度。此外，周围神经纤维缺乏神经元细胞体，导致转录丰度有限，xCell神经元特征中包含的几个基因（如NEUROD2、NEUROG2、GAD2、ELAVL3和STMN2）通常与中枢神经系统相关。因此，神经元评分可能捕捉到了非神经元细胞类型的转录程序。因此，未来旨在定义肿瘤内神经元相关转录信号来源的研究将至关重要。此外，本研究的观察性质排除了关于神经递质信号在肿瘤进展中的功能作用的因果推断。未来的研究需要结合空间转录组学、功能扰动和纵向临床数据，以阐明神经-肿瘤交流的精确机制。另一个重要限制是这里分析的公开可用转录组队列中缺乏统一注释的治疗反应数据，这阻碍了直接评估神经元评分与治疗反应之间的关系。解决这个问题将需要使用具有详细治疗和结果信息的临床注释队列或前瞻性临床试验数据集。

我们的发现揭示，高神经元评分的胃癌与特定的神经递质受体基因表达模式、增强的上皮-间充质转化程序、减弱的抗肿瘤免疫浸润、增加的肿瘤内异质性和较差的预后相关。这些观察结果将肿瘤整体中的神经元评分确定为胃癌生物学的一个先前未被充分认识的标志物。虽然当前研究未能建立因果关系，但它为未来研究神经-肿瘤相互作用提供了框架，并提出了患者分层和治疗探索的潜在途径。