《BioDrugs》：Recent Developments in Lipid Nanoparticle-Mediated Delivery of Biotherapeutics and Gene Therapy Across the Blood–Brain Barrier
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针对神经系统适应症的外周给药治疗面临着解剖和生理屏障的挑战，这些屏障限制了其进入中枢神经系统（CNS）作用部位的能力。对于复杂的疗法，如抗体、免疫疗法和基因疗法，这一点尤为明显。血脑屏障（BBB）是一种特殊的结构，在功能上调节血液成分进入CNS的能力。用于蛋白
针对神经系统适应症的外周给药治疗面临着解剖和生理屏障的挑战，这些屏障限制了其进入中枢神经系统（CNS）作用部位的能力。对于复杂的疗法，如抗体、免疫疗法和基因疗法，这一点尤为明显。血脑屏障（BBB）是一种特殊的结构，在功能上调节血液成分进入CNS的能力。用于蛋白质治疗的BBB递送技术已在临床前模型中建立，并开始在临床研究中得到验证。依赖跨BBB细胞通路的技术利用了受体介导的转胞吞（RMT）机制。近年来，利用脂质纳米颗粒（LNPs）递送复杂疗法的研究极大地扩展。LNPs代表了病毒载体极具吸引力的替代方案，可用于递送各种基因治疗模式，包括信使RNA（mRNA）、小干扰RNA（siRNA）和反义寡核苷酸（ASOs）。探索用BBB穿透性分子对LNPs进行功能化，是实现基于LNP的治疗药物CNS递送的一种手段。LNP基递送系统的最新创新和验证，加速了实现便捷的CNS靶向基因治疗承诺的进程。本综述重点关注BBB的功能方面，及其与LNP技术用于CNS递送的最新进展的关系，以及它们对基因治疗的潜在影响。
1 脂质纳米颗粒：一种独特的中枢神经系统治疗模式
解决针对中枢神经系统（CNS）的治疗药物所面临的血脑屏障（BBB）挑战，一直是研究的热点。虽然直接使用侵入性方法（颅内、鞘内或脑室内[ICV]给药）绕过BBB，或暂时破坏BBB（聚焦超声或渗透性破坏）是可行的策略，但它们伴随着相当大的安全性和实施问题。专注于利用内源性转运机制（如受体介导的转胞吞[RMT]）跨越BBB的策略，旨在避免侵入性方法的缺点。纳米技术的进步导致了用于BBB通透性的纳米颗粒（NPs）的开发。在各种NP形式中，脂质纳米颗粒（LNPs）在安全性和有效性方面经过了广泛的临床验证。LNPs占据了一个独特的治疗领域，涵盖了从小分子药物到多功能蛋白生物制剂、核酸、NPs、病毒和基因工程细胞。在此，我们从BBB结构、功能和疾病的角度，回顾了LNP配方、功能化和CNS靶向的最新进展。此外，我们强调了LNP递送载体作为病毒替代品在推进CNS基因治疗方面的多功能性。
2 纳米颗粒与血脑屏障
药物递送载体的开发已成为一个高度活跃的研究领域。同时，基因治疗应用，特别是那些利用腺相关病毒（AAV）的应用，前景广阔并已推进到临床试验阶段。由于病毒（20-300 nm）和NPs（5-200 nm）超过了通过BBB旁细胞途径扩散的尺寸限制，它们必须依赖于内吞或转胞吞途径。虽然大多数AAV血清型不能跨越BBB，但某些AAV血清型表现出脑趋向性，能够跨越BBB并随后转导神经元。许多衣壳工程工作已被开展以进一步利用脑趋向性，并导致AAV介导的基因治疗脑递送的进一步优化。值得注意的是，最近发现的AAVBR1是一种AAV2变体，据报道对脑微血管内皮细胞具有高特异性，可能代表了一种在局部产生治疗性蛋白质或遗传调节BBB以增强其对CNS的NP转运亲和力的手段。从机制上讲，AAV衣壳蛋白结合脑内皮细胞（BECs）上存在的受体，随后经历RMT，这与其转导机制不同。全身给药的NPs在很大程度上被排除在大脑之外，这需要在纳米材料上进行BBB穿透特性的工程化，以靶向CNS疾病。虽然小至25 nm的病毒可以传递有意义的治疗效果，但NPs的治疗效果具有尺寸依赖性。较大的NPs（>100 nm）具有较高的载药量，而较小的NPs（<100 nm）表现出较高的细胞摄取率和延长的循环时间。此外，非常小（<10 nm）和非常大（200-500 nm）的NPs会被肾脏、肝脏和脾脏迅速清除。鉴于高清除率不利于CNS递送，优化用于CNS递送的NPs需要仔细考虑多种因素，包括尺寸、电荷和表面功能化。与病毒载体相比，LNPs为基因治疗应用提供了几个优势。病毒（腺病毒、AAV和慢病毒）与免疫原性、有效载荷限制以及由于插入诱变导致的潜在基因毒性有关。脂质纳米颗粒递送的基因治疗策略可以被设计为避免这些陷阱，同时提供超越病毒载体能力的可能性。此外，制造治疗性病毒的成本和复杂性远远超过LNPs。因此，LNP介导的CNS基因治疗代表了一种极具前景的赋能技术，用于针对神经系统疾病的治愈性治疗。
3 用于中枢神经系统药物输送的脂质纳米颗粒
脂质纳米颗粒代表了CNS药物递送的一项创新进步，为克服BBB并将多种治疗货物直接递送至大脑提供了新的潜力。这些复杂的LNP平台包括各种配方，如固体脂质纳米颗粒、结构化脂质载体、传统脂质体和前沿的可电离脂质系统。每个平台都提供独特的优势：固体脂质纳米颗粒提供优异的稳定性和控释曲线，结构化脂质载体通过其不完美的晶体结构增强载药能力，脂质体实现仿生膜相互作用，可电离脂质系统通过pH依赖性质子化促进内涵体逃逸。LNP平台的多功能性很高，能够封装广泛的治疗剂，范围从小分子和肽到复杂的生物制剂，包括蛋白质、反义寡核苷酸（ASOs）、小干扰RNA（siRNA）、信使RNA（mRNA）、质粒DNA和成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）-Cas基因编辑组件。核酸的封装过程通常涉及可电离的阳离子脂质，在NP组装过程中，这些脂质在酸性pH下与带负电荷的有效载荷形成静电复合物。纳米封装保护治疗货物免受体内酶降解和全身清除，从而实现靶向递送。本综述的重点是将含有可电离阳离子脂质的系统及其在靶向CNS递送中的适用性。
4 血脑屏障的结构与功能
外周给药的神经治疗药物在进入CNS靶点时面临独特的挑战。这在很大程度上归因于BBB，它是一个高效的障碍，利用多种机制阻止选择性血液成分（溶质和细胞）进入大脑。BBB是神经血管单元（NVU）的一个组成部分，是一个结构和功能单元，通过调节脑血流来响应大脑不同的能量需求。除了BECs，NVU还包括星形胶质细胞、壁细胞（即血管平滑肌细胞和周细胞）、小胶质细胞、神经元和细胞外基质成分。NVU的结构使得微血管和毛细血管的内部衬以内皮细胞，这些细胞附着在基底膜（基板）的细胞外基质上。血管的内腔表面覆盖着粘液层（被称为糖萼的多糖大分子），充当大分子和NPs的筛状屏障。血管的外腔表面被周细胞和星形胶质细胞终足包围，并与神经元突起接触。多细胞的NVU结构允许神经血管耦合，将神经活动与脑血流联系起来，实现对应当地能量需求的精确时空调节。重要的是，星形胶质细胞和周细胞在BBB的发育和维持中发挥了充分记录的作用，BBB的屏障特性依赖于NVU内周细胞、星形胶质细胞和神经元之间的细胞串扰。管腔内的血液成分直接暴露于NVU的内皮细胞层。因此，BECs代表了限制进入大脑的首要和主要机会。脑内皮细胞是特殊的紧密连接（TJ）形成的内皮细胞，有效地限制了亲水性蛋白质（>500 Da）通过BBB的旁细胞运输，这得到了BECs低胞饮率的增强。细胞间TJs是由BECs之间广泛重叠的封闭结构形成的，其结构完整性由TJ蛋白复合物提供。紧密连接复合物由多种蛋白质组成，包括闭合蛋白、claudins、连接粘附分子（JAMs）和ZO-1，其中claudins被认为是建立TJs和决定相邻BECs之间旁细胞屏障的主要成分。由于糖萼带负电荷，带正电荷的分子容易与其相互作用，而带负电荷的分子则被排斥。Szecskó等人最近证明了糖萼在介导LNP纳米载体摄取/转运中的重要性。这些作者表明，通过神经氨酸酶或阳离子脂质处理改变内皮细胞的表面电荷，显著减少了阳离子肽标记的NPs的摄取。因此，在设计脑靶向治疗药物时必须考虑静电相互作用。除了物理TJ屏障外，BECs还能够主动转运特定的溶质穿过BBB。这是通过表达众多的单向或双向转运蛋白来实现的，这些蛋白调节特定溶质进出大脑。就营养物质而言，如葡萄糖、氨基酸、核苷和某些神经递质，进入大脑是通过特定的溶质转运蛋白实现的，如葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、单羧酸转运蛋白1（SLC16A1）和大中性氨基酸转运蛋白（LAT1, SLC7A5）。相反，外排转运蛋白，如ABC转运蛋白，将溶质从大脑泵入血液，从而清除有害代谢物，并在防止血液溶质进入大脑中发挥作用。外排转运蛋白系统负责许多小分子治疗药物表现出比根据其亲脂性预期的更低的CNS通透性。BBB的一个附加成分是代谢屏障，其中药物代谢酶使治疗药物失活和/或改变其进入CNS的能力。虽然大脑从潜在有害的血液成分中获得的保护对大脑功能是必要的，但BBB也阻止了许多治疗药物与其CNS靶点结合。
5 中枢神经系统药物输送的机制
针对CNS病理学的复杂疗法（例如大分子、NPs、病毒）必须直接给药到大脑，或者依靠从外周血管递送到大脑的能力。已经开发了各种策略来克服BBB并实现治疗药物进入大脑，包括临床实施的医疗程序，如甘露醇诱导的渗透性BBB破坏和带有聚焦超声的微泡。虽然BBB破坏机制可以有效地在一组有限的疾病中实现脑渗透，但其物理性质本质上是破坏性的，并且不适用于需要长期重复给药的疾病。相比之下，转胞吞机制与BBB破坏或血液成分的侵入性递送无关。转胞吞在机制上可分为载体介导的转运、RMT或吸附介导的转胞吞（AMT）。较小货物（例如葡萄糖、激素和脂肪酸）的立体特异性转运是通过载体介导的转运实现的，而AMT则利用静电相互作用与细胞表面结合位点实现带正电分子的转运。受体介导的转胞吞已被证明是将各种治疗模式跨BBB递送的强大机制，具有多种可利用的受体系统。内吞作用是AMT和RMT的潜在机制，涉及将细胞外分子内化到细胞内囊泡结构（内涵体）中。内涵体具有高度异质性，可大致分为早期/分选内涵体、回收内涵体和晚期内涵体。分类基于大小、形态、细胞定位和蛋白表达。蛋白标记物的表达用于区分早期/分选内涵体（Rab5a, Eea1）、回收内涵体（Rab4, Rab11）和晚期内涵体（Lamp 1/2, M6pr, Rab7a, Rab11a/b）。早期内涵体内的纳米级腔内囊泡是由早期内涵体的限制膜内陷形成的，导致多泡体（MVBs）的形成。这些中间内涵体结构转变为降解性MVBs（晚期内涵体和溶酶体）或外排性MVBs，最终形成微泡脱落到细胞外环境。BECs将其外排性MVBs shedding到其外腔表面的能力代表了RMT的启用机制。内吞作用可分为网格蛋白介导的内吞作用或网格蛋白非依赖性内吞作用，包括小窝蛋白依赖性内吞作用和胞饮作用。网格蛋白介导的内吞作用（也称为受体介导的内吞作用）是一个选择性过程，需要结合细胞膜受体作为内化特定细胞外分子子集的第一步。受体介导的内吞作用是一个涉及质膜和细胞质中众多因素的复杂受控过程。网格蛋白介导的内吞作用和RMT是相似的过程，RMT发生在受限的极性细胞类型亚群中，包括神经元、上皮细胞和内皮细胞。在形成屏障的细胞（上皮细胞和内皮细胞）中，RMT是负责跨BBB转运特定大分子（如铁、胰岛素和胰岛素样生长因子）的潜在机制。RMT和网格蛋白介导的内吞作用的启动是相同的，即配体与表达在BEC的腔侧（顶端）表面的受体结合。网格蛋白介导的内吞作用介导的配体-受体复合物内化之后是分选到早期内涵体囊泡。随后形成多泡体，配体被分选到降解性、回收性或外排性MVBs中。存在于外排性MVBs中的配体被释放到内皮细胞的腔侧（顶端表面，循环回血管腔）或腔外（基底外侧表面，转运至脑实质）。值得注意的是，大多数AAV血清型利用聚糖部分（AAV2,3,6的硫酸乙酰肝素；AAV1,4,5,6的N-连接和O-连接唾液酸；脑营养性AAV9的末端半乳糖）进行初始附着，并在附着后结合AAV受体KIAA0319L和各种辅助受体。同样，脑营养性AAV变体被发现利用GPI连接的受体（淋巴细胞抗原6A[L6A]，淋巴细胞抗原6C1）或跨膜蛋白（碳酸酐酶4[CA4]，低密度脂蛋白受体相关蛋白6[LRP6]，转铁蛋白受体[TfR, TFRC]，碱性磷酸酶[ALPL]），独立于KIAA0319L来实现脑营养性和BBB转胞吞。从机制上讲，KIAA0319L实现细胞内运输（从内涵体到反式高尔基体网络的逆行运输），是转导所必需的，并且可能利用上述转胞吞机制。同样，将NPs功能化以结合已知的血管内皮转胞吞受体（TfR, 胰岛素受体[INSR], 跨膜蛋白30A[TMEM30A], 胰岛素样生长因子1受体[IGF1R], 低密度脂蛋白受体[LDLR], 低密度脂蛋白受体相关蛋白1[LRP1], CD98, 基底膜聚糖[Basigin], 整合素-beta 1[ITGB1], 整合膜蛋白2A[EMP2A], 新生儿Fc受体[FcRn], P-选择素[SELP]）代表了一种可行的策略，用于在全身给药后实现治疗性NPs跨BBB向脑实质的递送。此外，还有替代性的、不太明确的转胞吞机制，如AMT和窖蛋白介导的转胞吞（caveolar transcytosis），这两种机制都利用阳离子或仿生NP表面与内皮膜之间的静电相互作用来绕过屏障。吸附介导的转胞吞依赖于带正电的NPs与带负电的内皮糖萼之间的非特异性静电相互作用，触发巨胞饮作用和随后的跨细胞运输。窖蛋白介导的转胞吞利用窖蛋白-1（caveolin-1）介导的囊泡运输，在疾病条件下BECs中上调，并避开溶酶体降解途径。
6 血脑屏障与神经病理学
越来越明显的是，在许多与炎症和神经变性相关的神经系统疾病和损伤中，NVU的结构改变和BBB功能障碍是常见的观察结果。在阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷顿病（HD）、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和多发性硬化症（MS）的动物模型和患者中均观察到了BBB功能障碍，以及其他疾病。事实上，据估计超过40%的脑部疾病表现出BBB的功能障碍和/或结构改变。在临床上，可以使用动态对比增强磁共振成像（DCE-MRI）、循环生物标志物（如claudin-5、occludin和ZO-1）的存在或通过检查脑脊液（CSF）/血清白蛋白比率来观察BBB功能障碍。死后脑组织分析显示血液成分（纤维蛋白原、免疫球蛋白G、白蛋白）的存在或病理性免疫细胞向脑实质的浸润，表明神经病理条件下的BBB受损。目前，导致疾病相关BBB功能障碍的主要机制被认为是TJ结构的改变和TJ蛋白表达的减少。疾病条件下BBB失调和破坏代表了神经病理学一个未被充分认识但可能促进药物递送的方面，也是开发可能恢复BBB基本功能的BBB靶向治疗的机会。
7 血脑屏障和血脑肿瘤屏障调节用于中枢神经系统基因递送
在生理条件下，BBB对CNS药物递送构成了主要障碍，这种限制在胶质母细胞瘤（GBM）中通过血脑肿瘤屏障（BTB）持续存在，后者仍然是不均匀且通常不完全破坏的。虽然在缺氧和血管生成的肿瘤核心内BBB完整性受损，但在低级别胶质瘤和高级别肿瘤的浸润边缘，血脑肿瘤屏障基本保持完整，胶质瘤细胞在这些区域迁移到邻近脑组织而没有明显的屏障破坏。这种区域性的屏障连续性导致了治疗抵抗和肿瘤复发。血脑肿瘤屏障的特性随肿瘤级别而变化：低级别胶质瘤在很大程度上保留了类似BBB的微血管结构，而高级别GBMs表现出增加的血管表面积、血管直径和超过正常白质的通透性。周细胞覆盖率、紧密连接蛋白表达（例如claudin-5, occludin）和内皮转胞吞的空间异质性进一步驱动了不同肿瘤区域的渗透性和药物积累。为了克服这些挑战，已经开发了基于LNP的策略，利用配体介导的受体靶向（如TfR或LRP1）、甘露糖介导的免疫细胞摄取和仿生NP涂层，以改善穿透和细胞特异性。作为生理靶向的补充，几种物理调节方法，包括聚焦超声、光学（光基）刺激和磁场策略，能够实现BBB和BTB通透性的瞬时和区域特异性增加。其中，结合循环微泡的聚焦超声显示出最大的临床转化潜力，实现了可逆和局灶性的屏障开放，增强了核酸负载LNPs的CNS递送。在临床前GBM模型中，这种方法使健康脑区的NP积累增加了约十倍，肿瘤内增加了约六到七倍，同时保持了血管和神经完整性。光基BBB调节主要利用近红外光热或光遗传学机制，以高精度改变内皮连接和屏障功能。近红外吸收纳米材料如金纳米棒在照射下产生局部热疗，足以扰乱TJ完整性并增加细胞旁通透性，同时限制广泛的组织损伤。光遗传平台在内皮细胞中表达光响应离子通道或调节RhoA信号传导，在体外和离体模型中展示了屏障通透性的可逆控制。磁场介导的策略利用超顺磁性氧化铁NPs（SPIONs）或磁电复合材料，其中静态梯度增强NP积累，交变场诱导热疗或机械应力以瞬时打开连接。在LNP-SPION杂化物中，磁引导改善了啮齿动物GBM模型中超出血管生成核心的瘤内分布。新兴数据表明，将受体靶向LNPs与这些物理模式同步，特别是聚焦超声或磁热疗，可延长实质滞留时间和细胞摄取，为精确的CNS基因治疗提供协同平台。
8 用于中枢神经系统递送的脂质纳米颗粒工程
创新的一个新兴领域涉及合成脂质库的开发，提供广泛的BBB穿透脂质。这种方法代表了从经验配方开发到系统构效关系研究的范式转变，使得能够合理设计脑靶向递送系统。理性筛选方法已经鉴定出专门的脂质，如MK16、TD5和NT1脂质体，与传统的美国食品和药物管理局（FDA）批准的可电离脂质（如DLin-MC3-DMA，用于Onpattro等第一代mRNA疫苗）相比，它们显示出显着提高的脑积累。MK16具有吗啉头基和优化的烷基链结构，在静脉给药后，与FDA批准的可电离脂质相比，实现了高达7.4倍的脑递送。TD5是一种与氨基脂质相连的大脑靶向小分子，在鞘内注射后，在所有主要脑区引起了29.6%的神经元和38.1%的星形胶质细胞的广泛绿色荧光蛋白表达。这些新型脂质利用精确的化学修饰来增强脂质-膜相互作用，促进跨BBB的转胞吞，并促进神经元细胞的转染。其他关键的设计原则包括优化pKa值以平衡循环稳定性与内涵体逃逸（通常靶向pKa值在6.0和7.0之间），掺入可生物降解的酯键以减少积累毒性，以及微调疏水尾部结构以优化膜融合动力学。高通量筛选方法能够同时评估数千种脂质候选物，利用自动化合成平台、机器人处理系统和高内涵成像来评估BBB穿透、细胞摄取和毒性特征。机器学习算法越来越多地被用来基于定量构效关系预测最佳脂质结构，可能加速下一代脑靶向脂质的鉴定。神经递质衍生脂质体的开发代表了一种特别优雅的工程策略，其中脂质分子模拟多巴胺或血清素的结构基序，利用内源性囊
