研究脂质纳米颗粒的弹性对癌细胞内吞作用及mRNA递送的影响

《Med-X》：Examining the effect of lipid nanoparticle elasticity on endocytosis and mRNA delivery to cancer cells

　　**摘要**
脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种模块化且高效的核酸递送载体，为癌症治疗提供了潜在的新策略。本研究探讨了通过改变固醇脂质结构和固醇脂质摩尔比来调节LNPs弹性，如何影响LNPs在肝细胞（HepG2）、卵巢癌细胞（OVCAR8）和肺细胞（H1299）中的内吞作用和mRNA转染。所有LNPs制剂均经过大小、多分散指数（PDI）和mRNA包封效率的表征，并随后在HepG2、OVCAR8和H1299癌细胞中评估了其mRNA转染效果。体外实验表明，LNPs的弹性对这三种细胞类型的mRNA转染均有影响：中等硬度的LNPs增强了HepG2和OVCAR8细胞的mRNA转染，而低硬度的LNPs则提高了H1299细胞的mRNA转染效率。内吞机制研究表明，clathrin介导和脂质筏介导的内吞途径均参与了LNPs在所有细胞类型中的摄取。这些发现强调了通过调节LNPs弹性来增强mRNA向癌细胞递送的潜力，从而可能提高LNPs在癌症治疗中的应用效果。

**图形摘要**
脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种模块化且高效的核酸递送载体，为癌症治疗提供了潜在的新策略。本研究探讨了通过改变固醇脂质结构和固醇脂质摩尔比来调节LNPs弹性，如何影响LNPs在肝细胞（HepG2）、卵巢癌细胞（OVCAR8）和肺细胞（H1299）中的内吞作用和mRNA转染。所有LNPs制剂均经过大小、多分散指数（PDI）和mRNA包封效率的表征，并随后在HepG2、OVCAR8和H1299癌细胞中评估了其mRNA转染效果。体外实验表明，LNPs的弹性对这三种细胞类型的mRNA转染均有影响：中等硬度的LNPs增强了HepG2和OVCAR8细胞的mRNA转染，而低硬度的LNPs则提高了H1299细胞的mRNA转染效率。内吞机制研究表明，clathrin介导和脂质筏介导的内吞途径均参与了LNPs在所有细胞类型中的摄取。这些发现强调了通过调节LNPs弹性来增强mRNA向癌细胞递送的潜力，从而可能提高LNPs在癌症治疗中的应用效果。

**引言**
癌症仍然是一个重大的全球健康问题，每年有数百万新病例被诊断出来[1]。目前的治疗策略主要涉及手术切除结合化疗或放疗，但这些疗法常常会导致全身毒性和脱靶效应，因为它们通过损害快速分裂的细胞来发挥作用，但特异性较低[2, 3]。这些局限性凸显了迫切需要更精确、危害更小的治疗方法。
脂质纳米颗粒（LNPs）作为一种变革性的RNA递送平台，在包括疫苗、基因组编辑和蛋白质替代疗法在内的多种治疗应用中展现出巨大潜力[4, 5]。它们能够封装并高效地将多种RNA cargo递送到细胞内，因此也成为癌症治疗的有希望的工具[6, 7]。具体而言，已经研究了LNPs介导的多种RNA模式的递送，包括小干扰RNA（siRNA）和微RNA（miRNA）用于沉默致癌驱动因子，自扩增RNA（saRNA）用于上调肿瘤抑制途径，以及编码肿瘤抗原的信使RNA（mRNA）用于癌症疫苗或细胞因子治疗[8,9,10,11,12,13,14]。这些策略共同展示了正在研究的广泛RNA载荷应用。
LNPs通常由四种成分组成：可电离脂质、磷脂、固醇脂质和脂质锚定的聚乙二醇（PEG）。每种成分都在促进有效的mRNA包封、增强LNPs稳定性以及促进内体逃逸从而实现有效的细胞质递送方面发挥着重要作用（图1a）[15, 16]。此外，LNPs的模块化特性使得通过调整成分摩尔比或改变所用成分来优化其化学组成成为可能。这样的调整有助于靶向递送到病变组织，同时最小化全身暴露，这在癌症治疗中尤其有利，因为提高特异性可以减少传统癌症疗法相关的广泛副作用[6, 17]。先前的研究表明，修改可电离脂质的结构、改变成分摩尔比或在LNPs表面引入靶向基团（如抗体）可以改变LNPs的生物分布并引导其向肿瘤部位递送[6, 18]。

**图1**
a. 脂质纳米颗粒（LNPs）合成示意图：含有可电离脂质、磷脂、固醇脂质和PEG-脂质的乙醇相与含有mRNA的水相在微流控装置中混合。
b. 本研究中使用的胆固醇类似物（胆固醇、菜籽甾醇、β-谷甾醇和豆甾醇）的结构及其对LNPs硬度的预期影响。
c. LNPs库设计示意图：LNPs由可电离脂质MC3和四种固醇脂质中的一种、可电离脂质C12-494和四种固醇脂质中的一种配制而成，或者可电离脂质C12-494与不同摩尔比的胆固醇配制而成。

**结果与讨论**
**LNPs的配制与表征**
迄今为止，关于LNPs弹性对癌细胞mRNA递送作用的研究较少。因此，我们利用了一个先前已表征的、具有可调弹性特性的LNPs库来评估LNPs弹性差异是否会影响肝细胞（HepG2）、卵巢癌细胞（OVCAR8）和肺细胞（H1299）中的mRNA转染。为了配制LNPs，将含有可电离脂质、磷脂、固醇脂质和PEG-脂质的脂质相在乙醇中以特定摩尔比混合，并在微流控装置中与萤光素酶mRNA混合（表S1）。研究了两种可电离脂质：MC3（一种经FDA批准的、以高效递送RNA至肝细胞而闻名的可电离脂质）和C12-494（已在多种细胞类型中表现出高效mRNA转染能力的脂质）。每种LNPs均与四种固醇脂质中的一种（胆固醇（Chol）、菜籽甾醇（Camp）、β-谷甾醇（Sito）或豆甾醇（Stig）配制，或者以不同的胆固醇摩尔比配制。由于预期这种可电离脂质在所有三种细胞类型中均具有高效的转染效果，因此我们仅改变了C12-494 LNPs配方中的胆固醇摩尔比。
配制完成后，所有LNPs均经过大小、多分散指数（PDI）和包封效率的表征；改变固醇结构或胆固醇摩尔比也可能影响LNPs的其他物理化学性质，从而影响其性能（表S2）。Z平均尺寸范围为70.6–87.7 nm，所有LNPs的PDI均低于0.31，表明颗粒分布均匀。虽然大多数LNPs的大小相似，但MC3 Sito和Stig LNPs的尺寸比MC3 Chol LNPs略大约10 nm。同样，C12-494 Sito LNPs和C12-494 High Chol LNPs的尺寸也比C12-494 Chol LNPs稍大。所有LNPs的mRNA包封效率均超过90%，表明胆固醇类似物的添加或胆固醇摩尔比的改变并未对mRNA装载产生不利影响。最后，所有LNPs制剂均表现出轻微的负zeta电位。C12-494 LNPs库的zeta电位接近中性，范围为-2.70至-8.24 mV，而MC3 LNPs库的zeta电位更负，范围为-13.56至-21.09 mV。总体而言，不同固醇类似物的添加或胆固醇摩尔比的改变并未显著改变LNPs的大小、PDI、mRNA包封效率或zeta电位。

**LNPs弹性对HepG2细胞中mRNA转染和内吞作用的影响**
研究表明，纳米颗粒的弹性会影响其在癌细胞中的摄取，较软的纳米颗粒表现出更优先的肿瘤积累、增强的细胞摄取和更长的循环时间[20, 34]。因此，我们探讨了LNPs是否也表现出类似的趋势，以及LNPs的弹性如何影响三种上皮来源的癌细胞（HepG2细胞（肝细胞癌模型）、OVCAR8细胞（卵巢癌模型）和H1299细胞（非小细胞肺癌细胞系）中的mRNA转染。选择这些细胞系是因为它们是成熟的癌症模型，并且已在LNPs递送研究中得到研究[35,36,37,38,39,40]。
在体外筛选中，LNPs与萤光素酶mRNA作为报告基因 cargo配制。为了评估肝癌细胞中的mRNA递送效果，HepG2细胞接受了每10,000个细胞10 ng萤光素酶mRNA的三种LNPs处理。处理24小时后，测量了萤光素酶表达和细胞存活率，并与MC3或C12-494胆固醇LNPs配方进行了比较（图2a）。LNP处理后的发光信号以相对于对照LNPs配方MC3 Chol的相对发光值报告。虽然这种方法允许在不同治疗组之间进行比较，但测量到的荧光信号反映的是整个细胞群体中的平均荧光素酶表达水平，而不是单个转染事件，这可能会掩盖细胞群体内部转染的异质性。图2：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。研究LNP弹性对HepG2肝癌细胞中mRNA转染和LNP内吞作用的影响。a. 总体示意图显示，具有中等硬度的LNP通过脂质筏介导和网格蛋白介导的内吞作用有效地转染HepG2细胞。b. 用每种胆固醇类似物处理的HepG2细胞在处理后24小时的荧光素酶表达情况；c. 用每种胆固醇类似物处理的C12-494 LNP；d. 用不同摩尔量的胆固醇（低或高）处理的C12-494 LNP，每10,000个细胞添加10 ng的mRNA。相对荧光通过标准化到用MC3 Chol LNP处理的细胞来量化。结果以平均值±标准差的形式报告，基于4次生物学重复实验。使用Holm-?ídák校正进行多重比较的后验Student's t检验的嵌套单因素方差分析（ANOVA）用于比较不同治疗组与MC3或C12-494 Chol LNP之间的相对荧光，**p≤0.01，****p≤0.0001，ns=不显著。e. 在存在不同内吞抑制剂（Amiloride (AMI) 是巨噬细胞内吞的抑制剂；chlorpromazine (CPZ) 是网格蛋白介导的内吞的抑制剂；genistein (GEN) 是 caveolae介导的内吞的抑制剂；dynasore (DYNA) 是dynamin依赖性内吞的抑制剂；methyl-β-cyclodextrin (MβCD) 是脂质筏介导的内吞的抑制剂）的情况下，用每种胆固醇类似物处理的HepG2细胞在处理后24小时的荧光素酶表达情况；f. 在存在不同内吞抑制剂的情况下，用C12-494 Low和High胆固醇LNP（每10,000个细胞添加10 ng的mRNA）处理的HepG2细胞。相对荧光信号通过标准化到未使用内吞抑制剂处理的细胞来量化。结果以平均值±标准差的形式报告，基于3次生物学重复实验。使用Holm-?ídák校正进行多重比较的后验Student's t检验的双因素方差分析（ANOVA）用于比较不同治疗组和抑制剂与C12-494 Chol LNP之间的荧光素酶表达。在MC3 LNP库中，MC3 Sito LNP比MC3 Chol、Camp和Stig LNP介导的荧光素酶表达显著更高（图2b）。这一趋势在C12-494 LNP库中也得到了体现，C12-494 Sito LNP相对于其他C12-494胆固醇类似物制剂也显示出显著增强的mRNA转染效率，这突显了β-谷甾醇在不同可电离脂质中的普遍益处（图2c）。此外，C12-494 High Chol LNP介导的转染效果显著优于C12-494 Low Chol和Chol制剂，而C12-494 Chol LNP的表现也优于C12-494 Low Chol制剂（图2d）。最后，在HepG2细胞中观察到的任何LNP制剂的细胞毒性都可以忽略不计（图S1）。为了进一步评估LNP库的潜在毒性，用每种LNP处理RAW-Blue报告细胞并测量NF-κB活性。与未处理的细胞相比，没有LNP显著诱导更高的NF-κB活性；然而，用C12-494 LNP处理的细胞显示出显著更高的NF-κB活性，这表明C12-494 LNP可能会引发更明显的炎症反应（图S2）。总体而言，这些结果表明，当LNP的硬度增加时，mRNA向HepG2细胞的传递效果会得到改善。在MC3和C12-494胆固醇类似物库中，通过加入胆固醇类似物增加LNP的硬度可以增强mRNA转染；然而，具有中等硬度的LNP，特别是那些含有β-谷甾醇的LNP，在mRNA转染方面表现出最大的改善。在具有不同胆固醇摩尔比的C12-494库中也观察到了类似的趋势，其中含有较高胆固醇含量和相应较高杨氏模量的LNP介导了更强的mRNA转染。这些发现与先前的假设一致，即虽然增加LNP的硬度可以增强mRNA传递，但过于坚硬的LNP（如在MC3和C12-494库中用stigmastanol配制的LNP）可能会由于在生物环境中的稳定性增强而减少细胞摄取或阻碍mRNA释放[22, 25]。接下来，为了研究C2-494 Sito和High Chol LNP与Chol LNP制剂相比观察到mRNA转染增强的原因，我们使用共聚焦显微镜检查了LNP在HepG2细胞内体隔室中的共定位情况（图S3a）。在LNP处理后2小时，我们没有观察到LNP之间的内体逃逸差异，这一点也得到了相似的皮尔逊相关系数的支持（图S3b-c）。尽管在这个时间点没有检测到内体逃逸的差异，但关键的内体逃逸事件可能发生在2小时之后。此外，尽管整体内体逃逸率似乎较低，但C2-494 Sito和High Chol LNP的强共定位信号和高皮尔逊相关系数表明这些LNP可能在内体中停留更长时间，可能将它们运输到更有利于mRNA释放的隔室，如晚期内体，这之前已经与含有甾醇类似物的LNP相关联[26, 41, 42]。最后，在C2-494 Sito和High Chol显微镜图像中观察到的强LNP信号表明了强烈的细胞摄取，这也可能有助于体外mRNA转染的增强。为了进一步探究LNP介导的mRNA传递的摄取机制，我们在荧光素酶mRNA LNP转染之前用各种内吞抑制剂预处理了HepG2细胞。先前的研究表明，纳米粒子的弹性影响摄取途径，其中较硬的纳米粒子通常通过网格蛋白介导的内吞作用被内化，而较软的纳米粒子则通过非特异性融合机制被内化[20, 21, 43]。为了探索LNP弹性对内吞作用的影响，我们测试了五种针对不同内吞途径的小分子抑制剂。具体来说，我们测试了amiloride（巨噬细胞内吞的抑制剂）、chlorpromazine（网格蛋白介导的内吞的抑制剂）、genistein（caveolae介导的内吞的抑制剂）、dynasore（dynamin介导的内吞的抑制剂）和methyl-β-cyclodextrin（脂质筏介导的内吞的抑制剂）（图S4）。为了研究这些内吞途径，我们使用封装了荧光素酶mRNA的LNP来处理已经用每种抑制剂预处理的HepG2细胞。鉴于C2-494 LNP库在HepG2细胞中介导的mRNA转染效果优于MC3库，因此本研究中仅包括了C2-494 LNP。尽管对于每种抑制剂，不同胆固醇类似物制剂之间没有观察到显著差异，但所有胆固醇类似物LNP在甲基-β-cyclodextrin处理后都显示出mRNA转染的显著减少，表明脂质筏介导的内吞可能是这些制剂在肝癌细胞中的主要摄取途径（图2e，图S5）。这种模式也适用于用不同胆固醇含量处理的细胞。当细胞用甲基-β-cyclodextrin预处理时，C2-494 Low Chol和High Chol LNP的荧光信号都显著减少，这表明脂质筏介导的内吞是这些LNP在HepG2细胞中实现摄取的主要机制（图2f，图S5）。有趣的是，C2-494 Low Chol LNP在甲基-β-cyclodextrin存在下仅表现出50%的荧光信号减少，而C2-494 Chol和High Chol LNP则约为20%，这表明这种制剂可能不像其他LNP制剂那样依赖脂质筏途径。此外，几乎所有LNP处理组在氯丙嗪存在下都显示出显著的荧光抑制，这表明这些LNP也可能依赖于网格蛋白介导的内吞途径（图S5）。虽然这些抑制剂可以帮助指示哪些途径有助于LNP的摄取，但它们对内吞过程的影响往往是非特异性的[44]。例如，amiloride通过调节钠通道和pH值来调节巨噬细胞内吞，但它也会影响快速的内吞蛋白[44, 45]。氯丙嗪会破坏网格蛋白介导的内吞，但也会影响dynamin依赖的过程[46]。Genistein通常用于阻断caveolae介导的摄取，广泛抑制酪氨酸特异性蛋白激酶，并且还可以影响网格蛋白依赖的内化[44, 48]。据报道，dynasore会改变细胞信号传导，包括mTORC1的激活，并减少膜胆固醇，从而破坏脂质筏[48]。最后，methyl-β-cyclodextrin通过耗尽膜胆固醇来抑制脂质筏介导的摄取，但这也会影响细胞膜结构、流动性和信号传导组织[44, 49]。尽管这些广泛的细胞效应需要根据每种抑制剂的机制来解释结果，但总体抑制模式仍然可以提供有关特定细胞系中LNP摄取最可能途径的有用见解。

评估LNP弹性对OVCAR8细胞中体外mRNA转染和LNP内吞的作用。由于已经证明C12-494可电离脂质可以在女性生殖器官（包括卵巢、子宫和胎盘）中介导mRNA转染，我们使用C12-494和MC3 LNP库来探索LNP弹性对卵巢癌细胞中mRNA转染的影响[30]。为了评估卵巢癌模型中的mRNA转染，用三种LNP库以每20,000个细胞25 ng的荧光素酶mRNA的剂量处理OVCAR8细胞。LNP处理24小时后，测量所有治疗组的荧光素酶表达和细胞活力，并与MC3或C12-494胆固醇LNP制剂进行比较（图3a）。图3：该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像。研究LNP弹性对OVCAR8卵巢癌细胞中mRNA转染和LNP内吞的作用。a. 总体示意图显示，具有中等硬度的LNP通过脂质筏介导的内吞作用有效地转染OVCAR8细胞。b. 用每种胆固醇类似物处理的OVCAR8细胞在处理后24小时的荧光素酶表达情况；c. 用每种胆固醇类似物处理的C12-494 LNP；d. 用不同摩尔量的胆固醇（低或高）处理的C12-494 LNP，每10,000个细胞添加10 ng的mRNA。相对荧光通过标准化到用MC3 Chol LNP处理的细胞来量化。结果以平均值±标准差的形式报告，基于n=4次生物学重复实验。使用Holm-?ídák校正进行多重比较的后验Student's t检验的嵌套单因素方差分析（ANOVA）用于比较不同治疗组与MC3或C12-494 Chol LNP之间的相对荧光，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001，****p≤0.0001，ns=不显著。e. 在存在不同内吞抑制剂（Amiloride (AMI)、chlorpromazine (CPZ)、genistein (GEN)、dynasore (DYNA)、methyl-β-cyclodextrin (MβCD)）的情况下，用每种胆固醇类似物处理的OVCAR8细胞在处理后24小时的荧光素酶表达情况；f. 在存在不同内吞抑制剂的情况下，用C12-494 Low和High胆固醇LNP（每10,000个细胞添加10 ng的mRNA）处理的OVCAR8细胞。相对荧光信号通过标准化到未使用内吞抑制剂处理的细胞来量化。结果以平均值±标准差的形式报告，基于3次生物学重复实验。使用Holm-?ídák校正进行多重比较的后验Student's t检验的双因素方差分析（ANOVA）用于比较不同治疗组和抑制剂与C12-494 Chol LNP之间的荧光素酶表达，**p≤0.01，***p≤0.001。在MC3 LNP库中，加入胆固醇类似物并增加LNP的硬度可以改善OVCAR8细胞的mRNA传递效果，与胆固醇制剂相比。值得注意的是，MC3 Sito制剂介导的荧光素酶表达显著高于所有其他制剂（图3b）。相比之下，C12-494 LNP库在不同胆固醇类似物之间的mRNA转染差异较小（图3c）。在这个库中，C12-494 Camp和Sito制剂相对于C12-494 Chol和Stig LNP显示出适度的荧光素酶信号改善，再次表明具有中等硬度的LNP可能改善卵巢癌细胞的mRNA传递。重要的是，没有观察到任何测试的LNP制剂具有细胞毒性（图S6）。与HepG2细胞的结果类似，较硬的C2-494 High Chol LNP在OVCAR8细胞中介导的mRNA传递显著优于低硬度的C2-494 Low Chol和Chol制剂（图3d）。此外，所有C12-494 LNP的相对荧光信号比MC3 LNP高出50至100倍，这突显了这种可电离脂质在转染女性生殖组织细胞中的效力。总体而言，这些结果表明增加LNP的硬度可以改善OVCAR8细胞的mRNA转染，而C2-494 High Chol LNP在卵巢癌细胞中介导了强效的mRNA转染。我们再次检查了不同制剂之间的mRNA转染差异是否可能是由于内体逃逸的差异造成的。使用共聚焦显微镜，我们评估了两种表现最好的LNP制剂C2-494 Camp和High Chol与C2-494 Chol LNP在OVCAR8细胞内体隔室中的共定位情况（图S7a）。在LNP处理后2小时，没有观察到制剂之间的内体逃逸或皮尔逊相关系数的差异（图S7b，c）。所有三种配方的细胞内体逃逸率总体较低，这表明在OVCAR8细胞中，细胞内体逃逸可能发生在较晚的时间点，可能显示出2小时之后的差异。此外，主要的LNP配方，特别是C12-494高胆固醇LNP，与用C12-494胆固醇LNP处理的细胞相比，表现出更强的LNP信号，表明细胞摄取增强，可能有助于更有效的下游mRNA转染。为了研究参与mRNA转染的摄取途径，在用封装了荧光素酶mRNA的C12-494 LNP库处理之前，OVCAR8细胞被预先用之前描述的一组内吞抑制剂处理。由于MC3 LNP的转染效率较低，因此再次将其排除在本研究之外。在两个库中，当预先用染料木黄酮和dynasore处理时，未观察到内吞作用，染料木黄酮和dynasore分别抑制了洞穴样内吞和动力蛋白依赖的内吞途径，这表明这些途径对卵巢癌细胞中的LNP摄取没有显著贡献（图3e，f）。有趣的是，当OVCAR8细胞预先用染料木黄酮处理并给予更硬的Stig和高胆固醇LNP时，发光信号显著增加，表明阻断洞穴样内吞可能增强卵巢癌细胞中的LNP摄取和mRNA递送。在使用阿米洛利或氯丙嗪预处理后，不同LNP配方之间的发光信号没有显著差异。对于几乎所有LNP配方，用甲基-β-环糊精预处理OVCAR8细胞会导致发光信号显著降低（图S8）。尽管没有统计学意义，但在甲基-β-环糊精存在下配制的C12-494 LNP显示出比较软的C12-494胆固醇LNP更大的抑制趋势，这表明这些LNP配方可能更依赖于脂质筏介导的内吞作用在卵巢癌细胞中的摄取（图3e）。

为了评估LNP弹性对H1299细胞体外mRNA转染和LNP内吞的影响，已经探索了mRNA LNP在肺癌小鼠模型中的治疗作用，因此我们试图评估改变LNP弹性是否会影响LNP介导的mRNA递送[50, 51]。为了评估肺癌模型中的mRNA递送，H1299细胞被用每种LNP库处理，每20,000个细胞添加20 ng的荧光素酶mRNA。LNP处理24小时后，测量所有处理组的荧光素酶表达和细胞活力，并与MC3或C12-494胆固醇LNP配方进行比较（图4a）。

图4
该图像的替代文本可能是使用AI生成的。

研究LNP弹性对H1299肺癌细胞中mRNA转染和LNP内吞的作用。a 总体示意图，突出显示较软的LNP通过脂质筏和网格蛋白介导的内吞作用有效转染H1299细胞。b 用每种胆固醇类似物处理的H1299细胞在处理24小时后的荧光素酶表达；c 用每种胆固醇类似物处理的C12-494 LNP；d 用不同摩尔量的胆固醇（低或高）处理的C12-494 LNP，每20,000个细胞添加20 ng的mRNA。相对发光强度通过标准化为用MC3胆固醇LNP处理的细胞来量化。结果以3次生物学重复实验的平均值±标准差报告。使用Holm-?ídák多重比较校正的嵌套单因素ANOVA和事后Student's t检验来比较不同处理组与MC3或C12-494胆固醇LNP的相对发光强度，*p≤0.05，ns=不显著。e 用每种胆固醇类似物处理的C12-494 LNP在处理24小时后的相对荧光素酶表达；f 在不同内吞抑制剂（阿米洛利（AMI）、氯丙嗪（CPZ）、染料木黄酮（GEN）、dynasore（DYNA）、甲基-β-环糊精（MβCD）存在下，用10 ng的mRNA每10,000个细胞处理的C12-494低胆固醇和高胆固醇LNP的相对荧光强度。相对发光强度通过标准化为未用内吞抑制剂处理的细胞来量化。结果以3次生物学重复实验的平均值±标准差报告。使用Holm-?ídák多重比较校正的双因素ANOVA和事后Student's t检验来比较不同处理组和抑制剂与C12-494胆固醇LNP的荧光素酶表达，*p≤0.05，**p≤0.01。

在MC3和C12-494胆固醇类似物库中，低硬度的LNP配方表现优于其较硬的对应物（图4b，c）。具体来说，MC3 Camp LNP的mRNA递送效果提高了四倍，而C12-494胆固醇LNP的mRNA转染效果显著高于C12-494 Sito和Stig LNP。通过改变C12-494 LNP中的胆固醇摩尔比来改变LNP弹性，并没有显著影响H1299细胞中的mRNA递送（图4d）。与HepG2和OVCAR8的结果一致，所有C12-494 LNP的mRNA表达量都比MC3 LNP高一个数量级，强调了这种可电离脂质在癌细胞转染中的效力。所有测试的LNP均未观察到细胞毒性（图S9）。

接下来，我们使用共聚焦显微镜检查了低硬度C12-494胆固醇LNP与较硬的C12-494 Stig和高胆固醇LNP配方在H1299细胞中的LNP摄取和内体逃逸差异（图S10a）。尽管在不同配方之间没有观察到统计学上显著的内体逃逸差异，但C12-494 Stig LNP的内体逃逸率是C12-494胆固醇LNP的三倍，尽管在H1299细胞中的mRNA转染效果较差（图S10b）。此外，我们观察到用C12-494胆固醇LNP处理的细胞中LNP信号较强，这表明尽管内体逃逸率可能较低，但更高的LNP积累可能有助于这种配方的mRNA转染增强。所有三种LNP配方的皮尔逊相关系数均大于0.7，表明与内体区室的强共定位，并表明可能在较晚的时间点发生额外的内体逃逸事件（图S10c）。

为了进一步了解LNP摄取机制，在用封装了荧光素酶mRNA的C12-494 LNP库处理之前，H1299细胞被预先用之前描述的一组内吞抑制剂处理。由于MC3 LNP的转染效率较低，因此再次将其排除。当H1299细胞预先用阿米洛利和氯丙嗪处理时，观察到所有LNP处理组的mRNA递送受到适度抑制，阿米洛利和氯丙嗪分别抑制巨噬细胞内吞和网格蛋白介导的内吞，表明所有LNP部分独立于LNP弹性使用这些途径（图4e，f，图S11）。同样，甲基-β-环糊精预处理也部分抑制了内吞作用，其中较硬的LNP的抑制作用比较软的配方更明显，尽管在不同LNP组之间没有显著差异。用染料木黄酮预处理时几乎没有或没有抑制作用，表明洞穴样内吞不是H1299细胞中的主要摄取途径。值得注意的是，用dynasore预处理时出现了内吞抑制的差异，dynasore是一种抑制动力蛋白依赖内吞的抑制剂。在dynasore存在下，C12-494 Sito LNP没有内吞抑制，这与C12-494胆固醇LNP观察到的抑制明显不同。同样，在dynasore存在下，C12-494低胆固醇和高胆固醇LNP也没有抑制mRNA翻译。总体而言，这些结果表明，当LNP弹性改变时，LNP内吞途径会发生变化，而且对于同一LNP配方，这些途径在不同的细胞类型中可能有所不同。

结论

本研究调查了LNP弹性（通过甾醇结构和胆固醇摩尔比的变化调节）在三种癌细胞模型（肝细胞癌（HepG2）、卵巢癌（OVCAR8）和非小细胞肺癌（H1299）中的mRNA转染中的作用。我们的发现表明，LNP弹性影响mRNA递送效率，其中中等硬度的LNP增强了肝细胞和卵巢癌细胞中的mRNA递送，而低硬度的LNP改善了肺癌细胞中的mRNA转染。不同细胞系中表现最佳的LNP配方之间的差异也可能归因于每种癌细胞的膜组成和流动性差异，这反过来可能影响LNP内吞[52, 53]。例如，据报道H1299细胞的膜胆固醇含量相对较高，导致膜流动性降低，这可能解释了它们偏好较软LNP的原因[54]。此外，内吞抑制研究表明，LNP摄取可能主要通过网格蛋白介导和脂质筏介导的内吞途径在所有三种细胞系中发生。这些结果表明，调整LNP弹性是一种有前景的策略，以优化不同癌症类型的mRNA递送，最佳平衡可能存在于中等硬度的配方中。值得注意的是，表现最佳的LNP，C12-494 Sito和高胆固醇LNP的杨氏模量分别为202和136 kPa，这与之前的发现一致，即模量在千帕到兆帕范围内的纳米粒子在癌细胞中的摄取增强[20, 21, 25, 34]。

此外，未来的研究可以进一步加深我们对LNP弹性如何影响不同癌细胞模型中纳米粒子摄取机制和mRNA转染的理解。在这项工作中，我们使用了已建立的癌细胞系进行纳米粒子研究；然而，这些发现受到这些模型均为上皮来源的限制。未来的研究应该评估不同弹性范围的LNP在更广泛的癌细胞类型中的表现，包括间充质和血液学表型。还应该研究更广泛的胆固醇类似物，以确定特定结构特征是否有助于β-谷甾醇LNP在癌细胞中的性能提升，并探索其他可电离脂质LNP配方中不同的胆固醇摩尔比。未来的工作还应包括更全面的内吞研究，利用扩展的抑制剂面板和siRNA介导的特定蛋白质敲低，以进一步阐明依赖于硬度的摄取机制。此外，使用染料标记的LNP来评估LNP摄取的抑制将有助于确认阻断这些途径会影响LNP的内化和下游mRNA翻译。

最后，使用治疗性mRNA载荷的体内生物分布和肿瘤模型研究对于验证这些LNP设计原则并将其转化为临床相关的癌症疗法至关重要。虽然肿瘤微环境比2D体外细胞培养系统复杂得多，但体外实验提供了关于LNP弹性如何影响细胞摄取和mRNA转染的宝贵机制见解。尽管体外和体内结果并不总是相关，但之前研究癌症背景下纳米粒子弹性的研究表明，在体外表现良好的候选者通常在体内也有效，这表明这里的发现可能在体内肿瘤研究中得到验证[20, 21, 34]。此外，这里呈现的发现建立了粒子硬度和转染效率之间的趋势，使得可以排除表现不佳或具有细胞毒性的配方。这些发现可以指导选择有前景的LNP候选者进行体内评估，在更生理相关的肿瘤微环境中评估循环时间、肿瘤穿透和治疗效率等参数。总体而言，这项工作强调了纳米粒子弹性作为LNP设计参数的重要性，并为工程化具有优化机械特性的LNP提供了基础，从而可能提高基于mRNA的癌症疗法的安全性、有效性和特异性。

**材料和方法**

**可电离脂质合成**

C12-494可电离脂质按照之前的描述合成[25, 30]。简而言之，多胺核心2-{2-[4-(2-{[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基}乙基)哌嗪-1-基]乙氧基}乙烷1-胺（Enamine，基辅，乌克兰）与过量的环氧尾1,2-环氧十二烷（MilliporeSigma，伯灵顿，MA）在80oC下温和搅拌48小时。使用闪蒸色谱法纯化产品，并使用Rotovapor R-300旋转蒸发器（Buchi，新卡斯尔，DE）干燥产品，然后将其重新悬浮在乙醇中，浓度为40 mg/ml，用于LNP合成。

**LNP合成**

为了配制LNP，将包含可电离脂质、固醇脂质和PEG脂质的脂质混合物按表S1中指定的不同摩尔比结合在乙醇相中。具体来说，使用了可电离脂质C12-494或MC3（Cayman Chemical，安娜堡，MI），以及磷脂1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）或1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）（Avanti Polar Lipids，阿拉巴斯特，AL）、固醇脂质胆固醇（Sigma Aldrich，圣路易斯，MO）、菜油甾醇、β-谷甾醇或stigmastanol（Cayman Chemical），以及脂质-PEGs 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]（铵盐）（C14-PEG2k）或1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）（Avanti Polar Lipids）。预先配制的带有N1-甲基伪尿苷修饰的mRNA（Trilink Biotechnologies，圣地亚哥，CA）溶解在10 mM柠檬酸缓冲液（pH 3）中以产生水相。所有LNP的配比为可电离脂质与mRNA的重量比10:1。使用注射泵（Harvard Apparatus，霍利斯顿，MA）通过微流控设备以1:3的体积比混合乙醇和水相。合成完成后，LNP颗粒通过分子量截留值为20 kDa的透析盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）在1X PBS中进行2小时透析，并使用0.22 μm过滤器进行灭菌。随后将这些颗粒储存在4°C条件下以备后续使用。

### LNP特性分析
- **颗粒大小与分布宽度（PDI）**：使用DynaPro? Plate Reader III（Wyatt Technology，Santa Barbara，CA）通过动态光散射（DLS）技术进行测量。LNP颗粒在1X PBS中稀释后进行DLS检测，每个样本至少记录三次测量结果。Z平均尺寸和PDI以3次重复实验的平均值±标准差表示。
- **Zeta电位**：使用Zetasizer Nano（Malvern Instruments）进行测量。LNP颗粒在水中稀释后进行Zeta电位检测，每个样本至少记录三次测量结果。Zeta电位以3次重复实验的平均值±标准差表示。
- **包封效率**：采用Quant-iT RiboGreen RNA检测方法（Thermo Fisher Scientific）进行量化。每种LNP配方在1X tris–EDTA（TE）缓冲液或含有0.1% Triton X-100的TE缓冲液中稀释80倍。将LNP与mRNA标准品分别加入黑色96孔板中，每个孔中加入RiboGreen试剂。室温下孵育5分钟后，在480 nm激发波长和520 nm发射波长下使用板读仪读取荧光强度。包封效率计算公式为：[(Triton X-100中的RNA含量 / TE缓冲液中的RNA含量) × 100]。包封效率以4次重复实验的平均值±标准差表示。

### 细胞培养
体外实验使用了人类HepG2肝癌细胞（ATCC #HB-8065）、H1299癌细胞（ATCC #CRL-5803）和OVCAR8细胞系。OVCAR8细胞由Ronny Drapkin博士（宾夕法尼亚大学）提供。所有细胞系均检测为无支原体污染，且每代细胞均经过形态学检查以确保无污染。HepG2细胞在添加了10% FBS（Gibco）和1%青霉素-链霉素（Gibco）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco，爱尔兰都柏林）中培养；H1299和OVCAR8细胞在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的Roswell Park Memorial Institute培养基（RPMI，Gibco）中培养。所有细胞系均在37°C和5% CO2条件下培养。

### LNP介导的mRNA向癌细胞的转染效率评估
- ** Luciferase活性检测**：通过Luciferase检测评估LNP介导的mRNA转染效率。将细胞接种在96孔板中的100 μL培养基中并静置过夜。HepG2和H1299细胞以每孔10,000个细胞的浓度接种，OVCAR8细胞以每孔20,000个细胞的浓度接种。HepG2细胞用10 ng的luciferase mRNA处理，OVCAR8细胞用25 ng的luciferase mRNA处理，H1299细胞用20 ng的luciferase mRNA处理。LNP处理24小时后，吸除培养基并向每个孔中加入50 μL 0.1% Triton X-100以裂解细胞。将板置于摇床上振荡2-3分钟以确保细胞裂解完全。随后向每个孔中加入100 μL luciferin底物（Promega，Madison，WI），在室温下轻轻振荡10分钟后进行荧光测量。相对荧光信号通过先减去未处理细胞的背景值，再除以处理MC3 Chol LNPs的细胞平均荧光值得出。相对Luciferase表达以3次或4次生物学重复实验的平均值±标准差表示。使用Holm-?ídák多重比较校正进行嵌套单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后Student’s t检验来比较不同处理组间的Luciferase表达差异。
- **细胞毒性评估**：采用CellTiter-Glo?荧光细胞活力检测方法评估LNP的细胞毒性。将细胞以上述接种密度接种在96孔板中的100 μL培养基中并静置过夜。细胞用相同剂量的LNP处理24小时后，向每个孔中加入100 μL CellTiter-Glo?（Promega），在室温下孵育10分钟。使用板读仪（Tecan，Morrisville，NC）测量荧光信号，并将各处理组的荧光信号归一化至未处理细胞的水平。细胞存活率以4次重复实验的平均值±标准差表示。使用Holm-?ídák多重比较校正进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后Student’s t检验来比较不同处理组间的细胞存活率差异。

### LNP介导的NF-κB活性检测
RAW-Blue细胞（Invivogen，San Diego，CA）在添加了10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM（Gibco）中培养。将RAW-Blue细胞以每100 μl培养基80,000个细胞的浓度接种，静置过夜后用100 ng的mRNA处理。LNP处理24小时后，根据制造商的方案使用QUANTI-Blue Assay（InvivoGen）检测上清液中的碱性磷酸酶水平来评估NF-κB活性。归一化的NF-κB活性以4次生物学重复实验的平均值±标准差表示。使用Holm-?ídák多重比较校正进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后Student’s t检验来比较不同处理组间的NF-κB活性差异。

### LNP的摄取研究（荧光显微镜观察）
- **荧光显微镜观察**：将HepG2、OVCAR8和H1299细胞以每500 μl培养基100,000个细胞的浓度接种在35 mm玻璃底皿中并静置过夜。细胞用100 ng mRNA浓度的DiI标记LNP处理。2小时后，用Hoechst 33342（5 μg/mL，Thermo Fisher Scientific）染色10分钟，在37°C下洗涤，再用LysoTracker Deep Red（150 nM，Thermo Fisher Scientific）染色30分钟。最后在不含酚红的DMEM或RPMI中孵育以进行成像。使用共聚焦激光扫描显微镜（Leica Stellaris 5）拍摄图像。
- **LNP定位与内体逃逸分析**：通过对荧光图像进行基于像素的分析来量化LNP的定位和内体逃逸情况。对所有通道应用二值掩膜以界定细胞区域。在该掩膜内，使用固定阈值在DiI-LNP通道（G）中识别LNP阳性像素，记录细胞内所有LNP阳性像素的平均G通道强度（MFI LNP，黄色），代表每个LNP阳性像素的平均DiI-LNP信号。使用类似阈值在内体标记通道（R）中识别内体阳性像素，记录所有内体阳性像素的平均R通道强度（MFI endolysosome，红色）。同时位于LNP（G）和内体（R）掩膜中的像素被归类为共定位（LNP位于内体中）。记录这些共定位像素的平均G通道强度（MFI coloc，橙色），表示被内体捕获的LNP信号。通过计算LNP总强度（MFI LNP）与内体中LNP强度（MFI Coloc）的差值来估算内体逃逸程度。每个细胞的LNP逃逸率表示为LNP位于内体外的强度占LNP总强度的比例：[MFI（LNP通道）– MFI（共定位通道）]/[MFI（LNP通道）]。使用Pearson相关系数（r）来量化单个细胞内DiI标记LNP（黄色通道）与内体（红色通道）之间的共定位程度。所有分析均使用Fiji中的自定义脚本根据既定荧光共定位量化指南进行。结果以3个视野和每个视野10个细胞的平均值±标准差表示。使用Holm-?ídák多重比较校正进行单因素方差分析（one-way ANOVA）和事后Student’s t检验来比较不同处理组间的LNP逃逸率和Pearson系数。

### 小分子内吞作用抑制剂实验
- **内吞作用抑制剂实验**：将HepG2、OVCAR8和H1299细胞分别以每100 μl培养基10,000、20,000或10,000个细胞的浓度接种并静置过夜。内吞作用抑制剂包括阿米洛利（AMI，巨胞饮作用抑制剂，200 mM，Sigma Aldrich）、氯丙嗪（CPZ，网格蛋白介导的内吞作用抑制剂，2000 μM，Sigma Aldrich）、染料木黄酮（GEN， caveolae介导的内吞作用抑制剂，20 mM，Sigma Aldrich）、Dynasore（DYNA，动力蛋白依赖性内吞作用抑制剂，10 mM，Sigma Aldrich）和甲基-β-环糊精（MBCD，脂质筏介导的内吞作用抑制剂，500 mM，Sigma Aldrich），并将其溶解在相应浓度的DMSO中。过夜粘附后，向相应孔中加入1 μL每种抑制剂（Amiloride（AMI）、Chlorpromazine（CPZ）、Genistein（GEN）、Dynasore（DYNA）、Methyl-beta-cyclodextrin（MBCD），孵育30分钟。孵育完成后，将细胞重新悬浮在新鲜DMEM或RPMI培养基中，并分别加入10 ng的luciferase mRNA LNP（HepG2细胞）、25 ng的luciferase mRNA LNP（OVCAR8细胞）和20 ng的luciferase mRNA LNP（H1299细胞）。LNP处理24小时后，按照前述方法测量荧光信号。相对荧光信号通过先减去未处理细胞的背景值，再除以未加抑制剂的LNP处理细胞的平均荧光值得出。相对Luciferase表达以3次生物学重复实验的平均值±标准差表示。使用Holm-?ídák多重比较校正进行双因素方差分析（two-way ANOVA）和事后Student’s t检验来比较不同处理组和抑制剂之间的差异。